生物钟(circadian clock)系统是生物在进化中为了适应昼夜更替对生物体的影响而形成的内在的适应性计时机制；昼夜节律(circadian rhythm)是生命活动以24 h左右为周期的变动，是机体生物钟系统中的重要组成部分，能够与机体的代谢同步变化^[1]。正常生物体的肠道内寄生着复杂的肠道菌群^[2]，在生物的生长发育、消化吸收、代谢及免疫等方面起着重要作用^[3]。越来越多的研究表明，肠道菌群存在昼夜节律性，并存在宿主生物钟系统和交互效果之间的一定的平衡时钟^[4]。同时，肥胖等代谢类疾病也与昼夜节律紊乱有关^[3]，试验进一步证实碳水化合物、脂类等营养物质的代谢与宿主生物钟存在密切联系^[5]，同时昼夜节律紊乱也会使肝脏生物钟紊乱^[4]；生物钟紊乱则会破坏肠黏膜屏障，升高肠黏膜通透性，促进炎症反应，增加脂肪肝发生率^[3]。研究发现，宿主生物钟和菌群生物钟可以根据它们的饮食和可用性共同进化，破坏宿主生物钟，可导致菌群生物钟的改变，影响肠道菌群的构成^[6]。本文主要综述了肠道菌群有节奏的生物钟及其与宿主生物钟系统的互作效应，以期为今后肠道菌群与其宿主节律相互作用影响代谢机制的研究提供一些参考资料。

1 肠道菌群的昼夜节律性

最早发现蓝藻菌和真菌具有对光的昼夜节律性，其代谢水平的节律主要受纬度(光照时间)的影响^[7]，该结果首次证实了细菌存在昼夜节律性，但尚不清楚肠道菌群作为一个重要的生物群落是否存在昼夜节律性。Thaiss等^[8]通过对小鼠时差的控制证明了肠道菌群的组成和功能存在24 h周期的日变化；随后，Leone等^[9]研究发现肠道菌群的日变化受摄食时间影响。随着对肠道菌群研究的继续，发现肠道菌群确实具有以24 h为1个周期变化的昼夜节律^[10]。此昼夜节律主要表现在3个方面：数量与组成、定植位置和功能活动。

1.1 肠道菌群构成与数量的昼夜节律性

肠道菌群高度动态，且表现出24 h的昼夜变化。目前研究发现，生物钟的分子机制是一个24 h自动调节的反馈机制，涉及昼夜节律突变基因包括Per^[8]、Clock^[11]、Bmal1^[12]和Tim^[13]等。反馈回路以Clock/Bmal1在E-box上耦合形成二聚体为起点，接着激活启动子，诱导Per、Cry转录翻译，使Per、Cry蛋白浓聚形成二聚体，从而实现反馈抑制^[13]。此外，还发现Tim蛋白会与Per蛋白结合，随后一起进入细胞核，从而抑制Per的活性，这样便使抑制反馈回路闭合成环^[14]。Rosselot等^[15]以失活ClockD19等位基因的纯合小鼠作为研究昼夜节律基因破坏的模型，发现该小鼠肠道细菌的丰富性和均匀性明显降低，ClockD19突变能使得昼夜节律破坏，导致肠道生态失调。Liang等^[12]在研究哺乳动物肠道菌群时，发现其中拟杆菌门和厚壁菌门的丰度均表现出昼夜节律性，可以假定小鼠肠道菌群数量和种类呈周期性波动，随后敲除Bmal1基因，肠道菌群的结构组成和数量均失去昼夜节律性。Thaiss等^[8]研究通过对小鼠光照时间和饮食时间的调节，发现类属于梭菌目、乳杆菌目以及拟杆菌目的菌群丰度具有昼夜节律，这些菌群约占15%。通过数量测试，发现拟杆菌数量的昼夜波动是肠道菌群组成昼夜节律性变化的主要驱动力^[12]，并通过肠道菌群日变化的数量和类型的定量法进一步证实肠道菌群的数量及种类具有昼夜变化。

1.2 肠道菌群定植的昼夜节律性

微生物定植是指微生物从不同环境进入机体，并在某部位定居，继续生长和繁殖的过程。微生物定植后，需要生物体提供营养物质来维持正常的生长发育和繁殖；微生物的定植受环境、定植抗性等因素的影响。在对池塘细菌分布及日变化规律研究中，发现池塘水细菌的差异在白天逐渐增大，在夜晚逐渐减小，说明白天更利于细菌的定植、生长和发育^[16]。实时荧光定量PCR检测健康男女早晚形成的链球菌牙菌斑定植变异数量的差异，结果发现白天12 h定植变异体链球菌数小于夜间12 h，表明牙菌斑微生物定植存在昼夜节律变化^[17]。

以上均表明细菌的定植的确具有昼夜节律变化，为此对肠道菌群的定植昼夜变化也做了探讨。Thaiss等^[18]报道，肠道菌群的定植具有由于昼夜交替导致微小的位置移动，它们有着自己的习惯，从部分肠黏膜定植开始，向左或向右移动几微米，随后再返回原位置。采用实时荧光定量PCR扩增检测和电镜观察，发现菌群在肠黏膜层定植程度呈24 h周期性变化^[18]。研究发现，昼夜期间肠上皮细胞和菌群的空间位置不同，而肠道菌群的构成，甚至菌群及宿主的功能交流会受到这种位置的昼夜节律影响^[18]。但是对于这一方面的研究目前还比较少，肠道菌群定植位置节律究竟还有怎样的具体变化，哪些菌群表现出强烈的位置变化，这种变化对机体有哪些影响，这些问题都有待解决。

1.3 肠道菌群功能活动的昼夜节律性

研究人员针对微生物群组成的昼夜变化是否对1 d内肠道菌群的功能活动产生影响进行了探讨。研究发现，啮齿类动物昼夜期间肠道菌群含量会发生变化，从而导致菌群的功能活动也有所不同，比如白天这类动物通常处于休眠期，由于肠道中乳杆菌数量较多，机体解毒、胃肠蠕动、感知环境这些作用增强；相反在夜间由于厚壁菌和拟杆菌含量的增加，DNA恢复、能量代谢和细胞生长及发育作用增强^[18]，如果强行改变饮食习惯，肠道菌群数量、类型以及活动方式将改变。大多数基因在1 d内表现稳定，对光暗循环期间收集的小鼠粪便进行宏基因组测序，并将基因组序列映射到肠道菌群基因目录，发现某些基因组的数量(如涉及鞭毛组装和糖胺聚糖降解的基因)差异较大^[19]。试验发现，有基因覆盖在0.2以上的通路中，其中23%具有昼夜周期节律性，结果表明存在特定时间的微生物群功能^[19]。此外，不同的功能单元似乎表现出反相协调的波动，例如，参与DNA修复、能量代谢和在黑暗中良好表现的细胞生长的功能，而在光明期表现出更多的“维持”途径参与解毒、运动和环境意识^[19]。总之，这些结果揭示了微生物区系的组成及功能存在遵循24 h节律的昼夜波动，并能够导致在具体时间的强烈振荡^[8]。

2 肠道菌群昼夜节律性的影响因素 2.1 宿主进食节律影响肠道菌群节律性

在哺乳动物中，食物信号是环境中最有效的生物钟授时信号之一。分类学分析表明，有节奏的进食可导致微生物群振荡的发生，某特定种类的微生物有节奏地占据生态位可能是这种宏基因组波动的原因，而这些生态位可对进食或者饥饿阶段做出回应^[8]。因此，外来微生物进入肠道菌群是每日波动的基础，导致共生菌群需要一个昼夜节律的生态位占领^[8]。一些试验研究发现，菌群节律能够通过调节饮食节奏进行调控。对Per1、Per2基因敲除的小鼠给予长期节奏性的饮食后检测菌群的构成发现，调控进食节律可恢复由于宿主节律被破坏而引起的菌群失调^[3]；同时，Thaiss等^[8]的研究也显示，Per1、Per2基因敲除的小鼠可以通过恢复进食节律从而促进肠道菌群昼夜节律性的恢复；Zarrinpar等^[20]研究结果显示，可以通过限时喂养恢复由于饮食问题导致肥胖的小鼠某些菌群的节律性波动。饮食习惯可为正常野生型宿主体内的微生物群的节律提供动力，比如夜间啮齿动物会在黑暗期首先进食。相比之下，Per1和Per2基因敲除小鼠的昼夜进食节律明显较弱，所以它们微生物组节律的减弱是其改变进食时间所导致的。为此，研究者进行了一个定时喂食试验，野生型小鼠只在光明或黑暗期进食，结果发现，与定时喂食对外周时钟的嵌入能力相一致，这种喂食习惯改变肠道生物钟基因的表达模式^[9]。大部分循环的操作分类单元(OTUs)在改变进食时间后相对移动约12 h，表明进食时间可以直接控制微生物群的节律。这些结果表明，进食时间影响微生物群落构成的波动，而共生菌丰度的波动可以通过规律饮食来调节^[9]。此外，不同微生物的能力可以借助进食节律，主要是进食节律对营养物质运用程度的改变进行调节，微生物的细胞发育、能量汲取和DNA损伤后的反应功能主要在营养素可消化吸收时期，解毒功能主要在非进食期间^[3]。

2.2 宿主饲粮结构影响肠道菌群节律性

饲粮组成的改变会引起肠道菌群的构成、功能改变，同时也会使其昼夜节律波动受到影响。Leone等^[9]研究发现，将试验小鼠持续置于“人工昼夜”中，喂食低脂或高脂饮食的无菌(germ-free，GF)小鼠的中枢生物钟基因和肝脏生物钟基因表达明显受损，但与低脂饲粮相比，高脂饲粮使小鼠微生物alpha多样性(一个特定区域或生态系统内的多样性，是反映菌群丰富度和均匀度的综合指标)改变，Shannon指数(Shannon指数越高，说明菌群的多样性越高)显著降低；对低脂饮食小鼠和高脂饮食小鼠的盲肠菌群beta多样性(能够反映样本间是否具有显著的微生物群落差异)深入评估表明，在低脂饮食条件下，1 d之内，授时因子时间变化更明显；此外，定量PCR(qPCR)测定的16S rRNA丰度的振荡仅在高脂饮食小鼠的盲肠内容物中检测到，即小鼠菌群丰度的昼夜节律受到抑制主要是在高脂饮食条件下，说明高脂饮食对肠道菌群昼夜节律存在影响。此外，高脂饮食小鼠肠道菌群昼夜节律振荡消失，昼夜差异显著的菌群数量减少，夜间有益菌类数量减少，有害菌类数量增加^[21]。但是，先前没有发现昼夜节律性的硫酸盐还原菌，却能够在小鼠喂食高脂饮食时表现出昼夜节律性^[21]；有时间限制的高脂饮食的小鼠可以部分使肠道菌群的昼夜节律性恢复原水平，恢复葡萄糖正常耐受量，并抑制小鼠肥胖^[21]。上述结论均说明饮食特别是高脂饮食能够对肠道菌群昼夜节律以及宿主代谢功能产生重要影响^[9]。

2.3 性别影响肠道菌群节律

性别的差异会使机体的很多方面产生差异。例如，雌性C57BL/6成年小鼠心肌细胞收缩力和钙瞬变普遍低于雄性^[22]；小鼠化学性肝损伤的过程中，雄性小鼠肝损伤后的修复能力相比雌性小鼠比较强^[23]；短期高脂饮食对不同性别的小鼠肠道菌群组成以及结构的影响也存在差异^[24]。

已知宿主生物钟的变化会影响肠道菌群，推测不同性别的宿主生物钟变化对肠道菌群的影响有所不同。研究发现，小鼠粪便菌群昼夜节律性消失时，雌雄两者菌群丰度的改变不同^[12]。Org等^[25]研究发现，使用睾丸素能够恢复缺失睾丸小鼠的肠道菌群中由于睾丸切除造成的变化及胆汁酸构成中的反向性别差异，这说明雄激素对肠道菌群的变化起作用。而睾丸素等类固醇的生成依靠生物钟蛋白Bmal1。所以，睾丸素和胆汁酸等激素可能与宿主不同性别产生的不同肠道菌群有关，而生物钟和性别两者间的互作对肠道菌群的构成和昼夜节律也有重要影响。

3 肠道菌群与宿主生物钟的相互作用

肠道菌群在结构组成和功能上呈现出昼夜节律性，并经由脑-肠轴影响大脑神经生化和行为表型^[26]。肠道菌群的昼夜节律性振荡受宿主进食节律、食物结构和性别的调节；而肠道菌群对宿主的节律波动蛋白转录、表型遗传以及代谢也有显著的系统性影响^[26]。这些均表明肠道菌群与宿主生物钟之间相互作用，不可分割。

3.1 肠道菌群对宿主生物钟的调控作用

宿主生物钟的正常运作作为肠道菌群昼夜节律性变化的依赖，宿主生物钟和肠道菌群两者任一方的紊乱都会对另一方产生不利影响，比如生物钟紊乱导致肠道菌群失调，而肠道菌群紊乱也会导致生物钟改变^[4]。研究发现，破坏肠道菌群的稳态直接影响宿主基因的节律性表达^[3]。Kuang等^[27]研究证明，肠道菌群调节小鼠小肠昼夜节律的关键物质是组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)。HDAC3通过集合微生物、整合昼夜节律线索来调控宿主昼夜节律性，并确定了控制宿主代谢的关键机制。Leone等^[9]通过检测GF小鼠和无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级小鼠视交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)生物钟基因的表达程度，发现在同等光照条件下肠道菌群失调能够改变生物钟基因表达，表明肠道菌群对宿主生物钟基因表达的维持有重要作用，其中肠道菌群的结构及组成改变会影响生物钟基因调控网络的平衡，由此影响代谢平衡并引发病理改变。

中央生物钟协调周围组织的生理活动，使外周组织能够适应外部环境的需要，同样机体的中枢生物节律通过各种神经和体液信号协调外周生物节律。研究发现，肠道菌群与外周生物钟也密切相关。肠道作为机体最重要的免疫器官，其主要成分肠道菌群的结构和功能与肠黏膜免疫功能的昼夜节律性有密切联系^[4]。研究发现，GF小鼠的盲肠和结肠上皮细胞的核受体、生物钟基因的表达谱表达与正常上皮细胞不同^[28]。此外，对于肝脏的外周生物钟，比较GF小鼠与SPF小鼠的肝脏生物钟基因(Bmal1、Rev-erbα、Rev-erbβ、Per1、Per2、Cry1)的mRNA翻译方式，结果发现两者显著不同^[28]；高脂饮食的小鼠肠道菌群代谢产物的平衡稳态将会消失，肝细胞内Per2和Bmal1基因节律性表达也有影响^[9]；通过小鼠肝脏对过量的乙酰氨基酚的解毒效果比较发现，早晨和傍晚的毒性差异明显，主要是肠道菌群产生的代谢产物水平存在昼夜节律性，这种节律改变了小鼠肝脏中编码代谢酶的基因表达^[3]。这些结果都表明肝脏生物钟节律、宿主器官昼夜节律活动均与肠道菌群节律有关。目前一项研究指出肠道菌群定期的运动会将肠道组织与不同的微生物或代谢产物接触，改变宿主的昼夜节律性^[3]。

3.2 宿主生物钟对肠道菌群的调控作用

肠道菌群的影响因素有年龄、饮食、药物、体质等，其中也包括宿主生物钟的调控。宿主昼夜节律紊乱引发的肠道菌群紊乱，能够直接影响肠道的免疫和营养代谢功能^[28]。上文论述了肠道菌群对中枢生物钟及外周生物钟的调控，反之这两者对肠道菌群调控也有着重要作用。小鼠生物钟基因Per1和Per2敲除试验发现，宿主生物钟紊乱将引起菌群改变^[12]，菌群改变导致肠道菌群昼夜节律改变，直接说明肠道菌群的昼夜节律受到宿主生物钟基因的调控。Oh-Oka等^[29]通过比较生物钟阻遏蛋白基因Per2突变型小鼠和野生型体内闭合蛋白(occluding)和密封蛋白-1(claudin-1)的mRNA的表达水平以及结肠通透性的差异，发现中枢生物钟紊乱的小鼠肠上皮屏障均被破坏，肠道通透性增强，间接说明生物钟紊乱能引起肠道菌群的紊乱。此外，中枢生物钟可通过调节生物钟基因表达实现对外周生物钟的调节^[4]，如肝脏、胰腺和肠道生物钟也会导致肠道菌群节律紊乱。研究还发现糖尿病与胰腺生物钟功能损伤有密切关系^[30]，在胰腺生物钟网络及糖尿病相互作用下，肠道菌群发生不同的失调，导致病情加深^[31-32]。近年来的研究发现，褪黑素是宿主生物钟对肠道菌群组成(例如降低厚壁菌门与拟杆菌门的比例)造成改变的重要调节因子，褪黑素能够影响肠毒素大肠杆菌在宿主肠道中的定植^[33]。

4 肠道菌群与宿主生物钟互作对代谢的影响

昼夜节律对宿主各个代谢有重要影响^[34]，在代谢过程中，肠道菌群的昼夜波动也是重要组成^[35]。宿主和肠道菌群之间的互作对于宿主代谢稳态十分重要，这种节律一旦失去调控，可能导致肥胖、代谢紊乱及其他综合病症^[18]。因此，宿主节律与肠道菌群的相互作用是代谢类疾病的一个重要突破，能够为其提供新的切入点。已有研究发现，这种互作能够对免疫和营养代谢等方面产生影响。

4.1 免疫应答

肠道是机体最大的免疫系统，对人或对动物的免疫功能都起着重要作用。生物钟能够改变肠道通透性，突变的宿主生物钟基因引发肠黏膜通透性升高，从而使肠道菌群失调，最终加重脂代谢紊乱，增加脂肪肝的发生率^[20]；给予小鼠高脂高糖饮食且昼夜颠倒，对其结肠生物钟基因检测和粪便进行16S rRNA测序，分别发现了Per2表达的昼夜节律变化及肠道菌群的构成和结构变化^[36]；生物钟基因Bmal1具有抗炎作用，所以缺失了生物钟基因Bmal1则会导致菌群向致炎表型改变^[37]。以上结果均表明宿主生物钟紊乱将导致菌群紊乱，进而发生代谢类疾病。此外，肠道菌群的昼夜节律紊乱会改变宿主生物钟基因的转录产物集合，破坏血清中氨基酸和多胺类等代谢产物的稳定，并影响肝脏的解毒功能^[3]，这直接说明肠道菌群紊乱导致肝脏生物钟基因表达的改变，进而导致肝脏生物钟紊乱和代谢功能的破坏。综上所述，菌群节律性与宿主节律性的互作对机体免疫起着重要作用。

4.2 养分代谢

营养物质的正常吸收和消化对机体具有重要作用，一旦这种平衡态，主要是肠道菌群与宿主间的平衡被打破时，代谢类疾病的发生和发展就更容易。研究发现，肠道菌群主要是通过鞭毛蛋白和脂多糖(LPS)激活髓样分化因子88(MyD88)释放白细胞介素-23(IL-23)，然后刺激3型天然淋巴细胞(ILC3)释放白细胞介素-22(IL-22)，接着激活细胞通信的传导过程及转录激活蛋白3(STAT3)，实现对宿主生物钟的调控，进而使节律基因Nr1d1的转录活性抑制，使肠道菌群进入肠道内壁细胞并改变细胞的生物钟功能，从而实现机体对脂肪的摄入和储存的调节^[38]。同时，进食节律性改变会导致肠道菌群组成改变，可以通过降低拟杆菌门含量、增加厚壁菌门含量增加肥胖发生率^[20]。最近有研究发现，菌群、昼夜节律和宿主新陈代谢之间的重要桥梁就是作为肠道关键代谢活动中枢的蛋白质白细胞介素3调节核因子(NFIL3)。肠道菌群产生鞭毛蛋白和LPS调控NFIL3昼夜循环，继而对脂肪代谢通路的昼夜节律进行调控^[39]，反之，肠道菌群紊乱引起的宿主生物节律改变，使得NFIL3表达下调从而导致脂质代谢紊乱^[40]。Govindarajan等^[41]研究发现，肠道菌群的胆盐水解酶(BSH)等代谢产物具有参与肠道及肝脏生物钟调控的可能性，还能够通过胆酸代谢作用于宿主的昼夜节律，此外，BSH凭借“肠肝循环”作用于宿主的脂类和胆固醇的消化吸收。以上结果表明，宿主生物钟与肠道菌群互作平衡对养分的正常代谢有着重要的作用。

5 小结

对肠道菌群的调控因素研究目前已经大致掌握，但其内在机制及具体如何影响不够清楚，而是否还有其他影响因素也值得探索。研究肠道菌群的昼夜节律性及其与宿主间代谢互作可为代谢类疾病的研究提供新的起点，但由于菌群失调导致的宿主病理状态下肠道菌群的节律产生变化的机理如何，仍是未来我们需要研究的方向。毋庸置疑的是，无论是动物还是人类代谢类疾病的研究发展，肠道菌群昼夜节律性的研究都是一个非常重要的切入点。