动物营养学报    2020, Vol. 32 Issue (8): 3636-3653    PDF    
超微粉碎车前对沙门氏菌感染肉仔鸡生长性能、免疫功能和抗氧化功能的影响
万妍 , 许彦飞 , 董元洋 , 张炳坤     
中国农业大学动物科学技术学院, 动物营养学国家重点实验室, 北京 100193
摘要: 本试验旨在研究饲粮添加超微粉碎车前对沙门氏菌感染肉仔鸡生长性能、免疫功能和抗氧化功能的影响。试验选用840只1日龄雄性科宝肉鸡,采用5(超微粉碎车前添加量)×2(是否沙门氏菌感染)双因子随机区组设计10个处理,每个处理6个重复,每个重复14只鸡。试验所用超微粉碎车前为车前草和车前子的超微粉碎混合物,混合比例为1:1。超微粉碎车前的添加量分别为饲粮的0、0.25%、0.50%、1.00%和2.00%,通过替代基础饲粮中小麦麸添加。感染组于7日龄每只鸡口服感染1 mL新鲜培养的鼠伤寒沙门氏菌(CVCC 541,细菌浓度为1×109 CFU/mL),正常组于7日龄口服等量无菌营养肉汤。试验期为42 d。结果表明:1)饲粮添加超微粉碎车前对1~7日龄肉仔鸡生长性能无显著影响(P>0.05),沙门氏菌感染会显著降低肉仔鸡的生长性能(P < 0.05),但是饲粮中添加超微粉碎车前对肉仔鸡生长性能无显著影响(P>0.05)。2)与未添加超微粉碎车前相比,饲粮添加0.50%的超微粉碎车前可以显著提高14日龄感染组及42日龄正常组肉仔鸡的脾脏指数(P < 0.05),饲粮添加0.25%和1.00%超微粉碎车前显著降低感染组肉仔鸡回肠食糜分泌型免疫球蛋白A含量(P < 0.05),饲粮添加2.00%超微粉碎车前可显著提高肉仔鸡21和42日龄外周血单核细胞吞噬活性(P < 0.05),饲粮添加0.50%超微粉碎车前可显著提高感染组肉仔鸡21日龄外周血淋巴细胞刀豆蛋白A(ConA)刺激指数(P < 0.05),饲粮添加1.00%和2.00%超微粉碎车前可显著提高肉仔鸡42日龄外周血淋巴细胞ConA刺激指数(P < 0.05),饲粮添加0.50%和1.00%超微粉碎车前可显著提高肉仔鸡42日龄外周血淋巴细胞脂多糖刺激指数(P < 0.05)。3)与未添加超微粉碎车前相比,饲粮添加0.50%超微粉碎车前可以显著降低肉仔鸡14日龄肝脏丙二醛含量(P < 0.05),饲粮添加2.00%超微粉碎车前可以显著提高正常组肉仔鸡21日龄回肠总超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性(P < 0.05),饲粮添加0.50%超微粉碎车前显著降低感染组肉仔鸡肠道血红素氧合酶1基因表达量(P < 0.05)。4)与未添加超微粉碎车前相比,饲粮添加1.00%超微粉碎车前可以显著提高肉仔鸡14、21日龄肠道绒毛高度和14日龄肠道黏膜层厚度(P < 0.05)。综上所述,饲粮添加超微粉碎车前能够通过促进脾脏发育和淋巴细胞增殖分化来提高肉仔鸡机体的免疫能力,提高机体抗氧化能力,并对肉仔鸡肠道形态起到保护作用,在一定程度上缓解沙门氏菌感染对肉仔鸡的负面影响。
关键词: 肉仔鸡    超微粉碎    车前    沙门氏菌    免疫    抗氧化    
Effects of Superfine Grinding Plantain on Growth Performance, Immune Function and Antioxidant Function of Broilers with Salmonella Infection
WAN Yan , XU Yanfei , DONG Yuanyang , ZHANG Bingkun     
State Key Laboratory of Animal Nutrition, College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
Abstract: This experiment was conducted to study the effects of dietary superfine grinding plantain on growth performance, immune function and antioxidant function of broilers with Salmonella infection. A total of 840 1-day-old male Cobb broilers were selected and divided into 10 treatments by using a randomized block design of 5 (superfine grinding plantain supplementation levels)×2 (Salmonella infection or not) two factors with 6 replicates for each treatment and 14 chickens for each replicate. The superfine grinding plantain in this experiment was a mixture of superfine grinding plantain grass and plantain seed with 1:1 mixing ratio. The supplemental levels of superfine grinding plantain were 0, 0.25%, 0.50%, 1.00% and 2.00% of the diet, respectively, by replacing the wheat bran in the basal diet. Each broiler in the infected group was orally infected with 1 mL freshly cultured Salmonella Typhimurium (CVCC 541, bacterial concentration was 1×109 CFU/mL) at the age of 7 days, and that in the normal group was orally infected with the same amount of sterile nutrient broth at the age of 7 days. The experiment lasted for 42 days. The results showed as follows:1) dietary superfine grinding plantain had no significant effects on the growth performance of broilers from 1 to 7 days of age (P>0.05), and Salmonella infection significantly reduced the growth performance of broilers (P < 0.05), but dietary superfine grinding plantain had no significant effects on the growth performance of broilers (P>0.05). 2) Compared with no superfine grinding plantain supplementation, dietary 0.50% superfine grinding plantain significantly increased the spleen index of broilers at 14 days of age in the infected group and at 42 days of age in the normal group (P < 0.05), dietary 0.25% and 1.00% superfine grinding plantain significantly decreased the chyme secretory immunoglobulin A content in ileum of broilers in the infected group (P < 0.05), dietary 2.00% superfine grinding plantain significantly increased the peripheral blood monocyte phagocytic activity of broilers at 21 and 42 days of age (P < 0.05), dietary 0.50% superfine grinding plantain significantly increased the concanavalin A (ConA) stimulation index in peripheral blood lymphocytes of broilers at 21 days of age in the infected group (P < 0.05), dietary 1.00% and 2.00% superfine grinding plantain significantly increased the ConA stimulation index in peripheral blood lymphocytes of broilers at 42 days of age (P < 0.05), dietary 0.50% and 1.00% superfine grinding plantain significantly increased the lipopolysaccharide stimulation index in peripheral blood lymphocytes of broilers at 42 days of age (P < 0.05). 3) Compared with no superfine grinding plantain supplementation, dietary 0.50% superfine grinding plantain significantly decreased the malondialdehyde (MDA) content in liver of broilers at 14 days of age (P < 0.05), dietary 2.00% superfine grinding plantain significantly increased the activity of total superoxide dismutase and glutathion peroxidase in ileum of broilers at 21 days of age in the normal group (P < 0.05), and dietary 0.50% superfine grinding plantain significantly decreased the intestinal heme oxygenase 1 gene expression of broilers in the infected group (P < 0.05). 4) Compared with no superfine grinding plantain supplementation, dietary 1.00% superfine grinding plantain significantly increased the intestinal villus height of broilers at 14 and 21 days of age and intestinal mucosa thickness of broilers at 14 days of age (P < 0.05). In conclusion, dietary superfine grinding plantain can improve the immune ability of broilers by promoting the development of spleen and the proliferation and differentiation of lymphocytes, increase the antioxidant capacity, protect the intestine morphology of broilers, and alleviate the negative effect of Salmonella infection on broilers to some extent.
Key words: broilers    superfine grinding    plantain    Salmonella    immunity    antioxidant    

现代肉鸡具有饲养周期短、增重快、采食量大等特点,这些特点使得肉鸡极易受到细菌、病毒等的侵袭。沙门氏菌种属就是其中一类危害巨大的食源性细菌[1]。沙门氏菌病是人畜共患病,人类感染沙门氏菌的一个重要途径是通过饮食了污染的鸡肉或鸡蛋[2]。为了防治沙门氏菌等肠道致病菌的感染与传播,饲粮中大规模添加抗生素造成了多种病原株的耐药性等一系列负面影响,而利用中药作为抗生素替代物已经成了目前研究的热点。车前草为车前科(Plantaginaceae)植物车前(Plantago asiatica L.)或平车前(Plantago depressa Willd.)的干燥全草,种子和全草皆收入我国药食同源饲料原料目录中,具有广泛生物学功效,如抗癌、抗氧化、免疫活性、降血脂血糖等作用;车前草也是我国传统药食同源天然植物,具有成本低、加工方便、资源丰富等优点。陈红云等[3]研究发现车前草无水乙醇提取物能有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活性,具有良好的抗菌效果;还有研究表明中药车前子提取物对鼠伤寒沙门氏菌引起的小鼠感染有良好的效果,可以减少鼠伤寒沙门氏菌引起的死亡、体重下降和盲肠病变等[4]。车前草还具有良好的免疫效果,陈家磊等[5]报道车前草多糖可以增加肉鸡的免疫器官指数和免疫细胞数量;田明等[6]发现车前草多糖可以通过提高抗炎症因子白细胞介素-10和转化生长因子-β mRNA的表达量来降低仔猪肠道炎症。由此可见,车前可以作为一种抗生素替代物用于缓解由病原菌造成的病理状态。超微粉碎技术是20世纪70年代开始,为了迎合市场需求而高速发展的新型技术,其可以将原材料加工成微米甚至纳米级别的超细粉末。超微粉碎技术在中药中已得到了广泛的应用,普通粉碎不能够破碎细胞膜,一些有效成分的溶出量低,使得这些活性成分不能被充分利用,而超微粉碎后的中药有较好的溶解性、吸附性、化学反应活性[7]。喻帅等[8]报道超微粉碎能够提高车前草的总黄酮有效成分提取率。因此,本试验主要探究饲粮中添加超微粉碎车前对口服感染沙门氏菌的肉仔鸡生长性能、免疫功能、抗氧化功能以及肠道健康的影响。

1 材料与方法 1.1 试验设计和饲粮

试验选用840只1日龄雄性科宝肉鸡,采用5(超微粉碎车前添加量)×2(是否沙门氏菌感染)双因子随机区组设计10个处理,每个处理6个重复,每个重复14只鸡。试验所用超微粉碎车前为车前草和车前子的超微粉碎混合物,混合比例为1 : 1,其营养成分见表 1。试验所用基础饲粮为玉米-豆粕型,参照我国《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)配制,其组成及营养水平见表 2。超微粉碎车前的添加量分别为饲粮的0、0.25%、0.50%、1.00%和2.00%,通过替代基础饲粮中小麦麸添加。感染组于7日龄每只鸡口服感染1 mL新鲜培养的鼠伤寒沙门氏菌(CVCC 541,细菌浓度为1×109 CFU/mL,菌株由中国兽医养殖采集中心从1例临床沙门氏菌病例中分离得到),正常组于7日龄口服等量无菌营养肉汤。试验于中国农业大学动物科学技术学院试验鸡场进行,鸡只按照肉鸡饲养管理方法饲养,人工控制温度,每天24 h光照,自由采食与饮水,进行常规的免疫接种。试验期为42 d。

表 1 车前营养成分 Table 1 Nutrients in plantain
表 2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis)  
1.2 测定指标和方法 1.2.1 健康状况和生长性能

每日观察鸡只的健康状况,监测是否有死亡情况。分别于7、14、21和42日龄肉仔鸡空腹10 h后,以重复为单位称重,并计算每只鸡的平均采食量、平均体增重和料重比。

1.2.2 免疫器官指数

分别于14、21和42日龄从每个重复中挑选1只接近平均体重的鸡称重,颈静脉放血致死后取其胸腺、脾脏和法氏囊,剔除脂肪后称重,计算免疫器官指数,计算公式如下:

1.2.3 血清沙门氏菌特异性抗体含量

分别于14、21和28日龄从每个重复中挑选1只接近平均体重的鸡,翅静脉采血制备血清,采用美国Bethyl Laboratories生产的鸡定量免疫球蛋白G(IgG)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定血清沙门氏菌特异性抗体IgG含量。

1.2.4 回肠分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量

分别于14、21和42日龄从每个重复中挑选1只接近平均体重的鸡,取回肠前半段食糜,采用放射性免疫法测定回肠食糜中sIgA含量,测定由北京华英生物科技有限公司完成。

1.2.5 外周血淋巴细胞刺激指数和单核细胞吞噬活性

分别于21和42日龄从每个重复中挑选1只接近平均体重的鸡,翅静脉无菌采抗凝血2 mL,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定T淋巴细胞和B淋巴细胞转化率,结果以刺激指数表示:

采用淋巴细胞体外培养法和中性红法测定血液中单核细胞吞噬活性,具体操作参照阎桂玲[9]的方法。

1.2.6 抗氧化指标

分别于14和21日龄从每个重复中挑选1只接近平均体重的鸡,颈静脉放血致死,取空肠、回肠、肝脏液氮冷冻后,置于-20 ℃冰箱保存。各肠段在冰上解冻后,用剪刀剪开,除去食糜,轻轻刮取肠黏膜于离心管中称重,并按1 : 9的比例加入生理盐水后用高通量组织匀浆机匀浆,离心,取上清,配成20%的组织匀浆,并于-20 ℃冰箱保存。采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定空肠、回肠和肝脏组织中的丙二醛(MDA)含量以及总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。

1.2.7 肠道组织形态和杯状细胞数量

于14和21日龄时分别从车前添加量为0、0.50%和1.00%处理的每个重复中随机挑选1只鸡,取回肠中段约1 cm,于4%多聚甲醛固定,进行苏木精-伊红(HE)和高碘酸希夫氏(PAS)染色,制作成切片后在显微镜下观察。

1.2.8 实时荧光定量PCR检测肠道相关基因表达

于21日龄,每个重复随机挑选1只鸡屠宰取回肠,液氮速冻后置于-80 ℃保存,用于测定相关基因的表达量。用Trizol法提取总RNA,在核酸蛋白仪(AG 22331,德国)上测定RNA浓度和纯度,然后将其反转录成cDNA(反转录试剂盒采用TaKaRa公司的RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit),反转录产物按照1 : 4稀释后备用进行实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR试剂盒为TaKaRa公司生产的SYBR Premix EX TaqTM Ⅱ(Perfect Real Time);反应仪器为7500荧光检测系统(Appied Biosystems,美国)。目标基因和内参基因β-肌动蛋白(β-actin)的引物序列见表 3。实时荧光定量PCR条件如下:95 ℃预热30 s,95 ℃变性5 s,60 ℃退火34 s,共40个循环;结果以2-△△Ct计算。

表 3 引物序列 Table 3 Primer sequences
1.3 数据统计分析

试验数据采用SPSS 17.0统计软件进行线性分析,运用一般线性模型(GLM)进行双因素方差分析,主效应和交互效应差异显著时,利用Duncan氏法进行多重比较,1~7日龄生长性能数据用“平均值±标准差”表示,其他试验结果用平均值和均值标准误(SEM)表示,P < 0.05表示差异显著,0.05 < P < 0.10表示有变化趋势。

2 结果与分析 2.1 超微粉碎车前对肉仔鸡生长性能的影响

饲养过程中鸡只健康状况如表 4所示。饲养过程中,沙门氏菌感染会引起个别鸡腹水,从而导致死亡,但大多数鸡没有明显的病理状况出现;饲粮添加超微粉碎车前对肉仔鸡的健康状况也没有显著的影响。

表 4 鸡只健康状况 Table 4 Health condition of broilers

表 5可知,饲粮添加超微粉碎车前对1~7日龄肉仔鸡平均采食量和料重比无显著影响(P>0.05),在一定程度上有提高平均体增重的趋势(P=0.055)。

表 5 超微粉碎车前对1~7日龄肉仔鸡生长性能的影响 Table 5 Effects of superfine grinding plantain on growth performance of broilers from 1 to 7 days of age

表 6可知,沙门氏菌感染显著降低肉仔鸡1~14日龄和1~21日龄平均体增重(P < 0.05),显著提高1~21日龄料重比(P < 0.05);有降低1~14日龄平均采食量的趋势(P=0.051),有提高1~42日龄料重比的趋势(P=0.059)。这说明沙门氏菌感染会显著降低肉仔鸡的生长性能,但是饲粮中添加超微粉碎车前对肉仔鸡生长性能无显著影响(P>0.05)。

表 6 超微粉碎车前对1~42日龄肉仔鸡生长性能的影响 Table 6 Effects of superfine grinding plantain on growth performance of broilers from 1 to 42 days of age
2.2 超微粉碎车前对肉仔鸡免疫器官指数的影响

表 7可知,沙门氏菌感染可以显著提高肉仔鸡14日龄的脾脏指数(P < 0.05);饲粮添加超微粉碎车前和沙门氏菌感染对肉仔鸡14和42日龄脾脏指数存在显著的交互作用(P < 0.05),与未添加超微粉碎车前相比,饲粮添加0.50%的超微粉碎车前可以显著提高14日龄感染组及42日龄正常组肉仔鸡的脾脏指数(P < 0.05)。

表 7 超微粉碎车前对肉仔鸡免疫器官指数的影响 Table 7 Effects of superfine grinding plantain on immune organ indices of broilers  
2.3 超微粉碎车前对肉仔鸡血清沙门氏菌特异性抗体含量的影响

表 8可知,沙门氏菌感染显著提高肉仔鸡21和28日龄血清沙门氏菌特异性抗体IgG含量(P < 0.05),但饲粮添加超微粉碎车前对肉仔鸡血清沙门氏菌特异性抗体含量无显著影响(P>0.05)。

表 8 超微粉碎车前对肉仔鸡血清沙门氏菌特异性抗体含量的影响 Table 8 Effects of superfine grinding plantain on serum Salmonella specific antibody content of broilers
2.4 超微粉碎车前对肉仔鸡回肠食糜sIgA含量的影响

表 9可知,沙门氏菌感染显著降低肉仔鸡14和42日龄回肠食糜中sIgA含量(P < 0.05);沙门氏菌感染和饲粮添加超微粉碎车前对肉仔鸡42日龄回肠食糜中sIgA含量存在显著的交互作用(P < 0.05),与未添加超微粉碎车前相比,饲粮添加0.25%和1.00%超微粉碎车前显著降低感染组肉仔鸡回肠食糜sIgA含量(P < 0.05)。

表 9 超微粉碎车前对肉仔鸡回肠食糜sIgA含量的影响 Table 9 Effects of superfine grinding plantain on chyme sIgA content in ileum of broilers  
2.5 超微粉碎车前对肉仔鸡外周血淋巴细胞刺激指数和单核细胞吞噬活性的影响

表 10可知,沙门氏菌感染和饲粮添加超微粉碎车前对肉仔鸡外周血淋巴细胞刺激指数和单核细胞吞噬活性有显著影响(P < 0.05)。超微粉碎车前添加量为2.00%时,肉仔鸡21和42日龄外周血单核细胞吞噬活性显著高于其他添加量(P < 0.05)。沙门氏菌感染和饲粮添加超微粉碎车前对肉仔鸡42日龄外周血单核细胞吞噬活性和21日龄外周血淋巴细胞ConA刺激指数存在显著的交互作用(P < 0.05),在感染和正常饲养条件下,与未添加超微粉碎车前相比,饲粮添加2.00%超微粉碎车前均可显著提高肉仔鸡42日龄外周血单核细胞吞噬活性(P < 0.05);在感染沙门氏菌条件下,与未添加超微粉碎车前相比,饲粮添加0.50%超微粉碎车前可显著提高肉仔鸡21日龄外周血淋巴细胞ConA刺激指数(P < 0.05);与未添加超微粉碎车前相比,饲粮添加1.00%和2.00%超微粉碎车前可显著提高肉仔鸡42日龄外周血淋巴细胞ConA刺激指数(P < 0.05),饲粮添加0.50%和1.00%超微粉碎车前可显著提高肉仔鸡42日龄外周血淋巴细胞LPS刺激指数(P < 0.05)。超微粉碎车前添加量与肉仔鸡21日龄、42日龄外周血单核细胞吞噬活性均存在显著的线性相关关系(P < 0.05)。

表 10 超微粉碎车前对肉仔鸡外周血淋巴细胞刺激指数和单核细胞吞噬活性的影响 Table 10 Effects of superfine grinding plantain on peripheral blood lymphocyte stimulation index and monocyte phagocytic activity of broilers
2.6 超微粉碎车前对肉仔鸡抗氧化功能的影响

表 11可知,沙门氏菌感染对肉仔鸡肠道T-SOD活性和肝脏MDA含量有显著影响(P < 0.05),沙门氏菌感染显著降低肉仔鸡14日龄回肠和21日龄空肠T-SOD活性(P < 0.05),显著提高肉仔鸡21日龄肝脏MDA含量(P < 0.05)。与其他添加量相比,饲粮添加0.50%超微粉碎车前可以显著降低肉仔鸡14日龄肝脏MDA含量(P < 0.05)。与未添加超微粉碎车前相比,饲粮添加1.00%和2.00%超微粉碎车前可显著提高肉仔鸡14日龄空肠MDA含量(P < 0.05),且MDA含量随着超前粉碎车前添加量的增加呈现线性增加(P < 0.05)。饲粮添加超微粉碎车前显著降低肉仔鸡14日龄回肠T-SOD活性(P < 0.05)。沙门氏菌感染和饲粮添加超微粉碎车前对肉仔鸡21日龄回肠T-SOD活性和GSH-Px活性存在显著的交互作用(P < 0.05),在未感染沙门氏菌的条件下,与除超微粉碎车前添加量为1.00%以外的其他添加量相比,饲粮添加2.00%超微粉碎车前可以显著提高肉仔鸡21日龄回肠T-SOD和GSH-Px活性(P < 0.05)。

表 11 超微粉碎车前对肉仔鸡抗氧化功能的影响 Table 11 Effects of superfine grinding plantain on antioxidant function of broilers
2.7 超微粉碎车前对肉仔鸡肠道组织形态和杯状细胞数量的影响

表 12可知,沙门氏菌感染有增加肉仔鸡14日龄肠道杯状细胞数量的趋势(P=0.069)。与未添加超微粉碎车前相比,饲粮添加0.50%和1.00%超微粉碎车前可以显著提高肉仔鸡14日龄、21日龄肠道绒毛高度(P < 0.05),饲粮添加1.00%超微粉碎车前可以显著增加肉仔鸡14日龄肠道黏膜层厚度(P < 0.05),且上述指标与饲粮超微粉碎车前添加量有显著的线性关系(P < 0.05);饲粮添加超微粉碎车前有增加肉仔鸡14日龄肠道隐窝深度(P=0.077)和21日龄肠道黏液层厚度的趋势(P=0.083)。

表 12 超微粉碎车前对肉仔鸡肠道组织形态和杯状细胞数量的影响 Table 12 Effects of superfine grinding plantain on intestinal morphology and number of goblet cells of broilers
2.8 超微粉碎车前对肉仔鸡肠道相关基因表达的影响

表 13可知,饲粮添加超微粉碎车前显著降低肉仔鸡肠道血红素氧合酶1(HMOX1)基因的表达量(P < 0.05)。沙门氏菌感染可显著提高肉仔鸡肠道超氧化物歧化酶1(SOD1)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和HMOX1基因的表达量(P < 0.05),有提高肉仔鸡肠道过氧化氢酶(CAT)基因表达量的趋势(P=0.096)。饲粮添加超微粉碎车前和沙门氏菌感染对肉仔鸡肠道HMOX1基因表达量有显著的交互作用(P < 0.05),在感染沙门氏菌的条件下,与其他添加量相比,饲粮添加0.50%超微粉碎车前显著降低肉仔鸡肠道HMOX1基因表达量(P < 0.05)。

表 13 超微粉碎车前对肉仔鸡肠道相关基因表达的影响 Table 13 Effects of superfine grinding plantain on intestinal related gene expression of broilers
3 讨论 3.1 超微粉碎车前对沙门氏菌感染肉仔鸡生长性能的影响

肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌对于小于3日龄的肉鸡具有很高的毒力作用,但对于大于3日龄的肉鸡则会长期在其体内定植而并不引起明显的疾病,而肉鸡生长性能则会因此下降[10-11]。本研究也表明沙门氏菌感染会显著降低肉鸡的生长性能。关于车前对肉鸡生长性能的影响目前鲜有研究。赵必迁[12]报道鲜绿车前草可以显著改善育肥猪的采食量、料重比和增重性能;唐胜球等[13]的研究结果表明饲粮中添加车前草对黄羽肉仔鸡的增重和料重比均无显著影响。本试验中,饲粮添加超微粉碎车前对各日龄肉鸡生长性能的影响均不显著,仅有提高1~7日龄肉仔鸡平均体增重的趋势,这可能是因为车前具有免疫和抗炎作用,从而减少了营养物质用于免疫的消耗而导致的。此外,当超微粉碎车前添加量为2.00%时,肉仔鸡平均采食量和平均体增重均在数值上出现降低,一种原因可能是因为车前添加量过多从而影响了饲粮的适口性,而且虽然车前混合物作为小麦麸替代物加入饲粮,仍有可能由于车前混合物的添加导致不同组饲粮营养成分有些许差别;另一种原因可能是车前具有的免疫活性使机体处于免疫激活状态,从而增加了营养物质的消耗。

3.2 超微粉碎车前对沙门氏菌感染肉仔鸡免疫功能的影响

沙门氏菌感染开始时,鸡的单核-巨噬细胞系统先发挥非特异性免疫作用,通过活化吞噬细胞促进病原体清除。单核细胞能吞噬、清除受伤、衰老的细胞及其碎片,参与免疫反应,在吞噬抗原后将所携带的抗原决定簇转交给淋巴细胞,诱导淋巴细胞的特异性免疫反应;单核细胞也是细胞防卫系统的重要组成,既能抵抗细胞内致病细菌和寄生虫的侵袭,还具有识别和杀伤肿瘤细胞的能力[14]。在非特异性免疫启动的同时,树突状细胞识别抗原之后,将抗原呈递给T淋巴细胞激活细胞免疫,产生CXCLi1、CXCLi12和干扰素-γ(IFN-γ),使粒细胞和巨噬细胞在感染部位发生浸润[15]。Henderson等[16]报道鸡感染沙门氏菌后异嗜细胞数量增加,在本次试验中也同样发现沙门氏菌感染可以提高21日龄肉仔鸡外周血单核细胞吞噬活性和淋巴细胞ConA刺激指数。

sIgA是肠黏膜表面的一种重要免疫球蛋白,可增加黏液的黏稠性,提高其对病原微生物的防御作用[17],但在本试验中发现,42日龄时沙门氏菌感染和饲粮添加超微粉碎车前对肉仔鸡回肠食糜sIgA含量有显著交互作用,与未添加超微粉碎车前相比,饲粮添加0.25%和1.00%超微粉碎车前却显著降低了感染组肉仔鸡回肠食糜sIgA含量;且本试验结果表明饲粮添加超微粉碎车前对于肉仔鸡血清沙门氏菌特异性抗体IgG含量的影响并不显著,这与预期结果相反,可能是由于由于沙门氏菌可以被固定在某种特定的细胞中,从而避免被某种特定的抗体攻击,此前也有研究表明体液免疫对清除沙门氏菌不起作用[18],一些针对沙门氏菌的疫苗有时并无效果也是因为这个原因,也有多项报道说明细胞免疫在清除肉鸡中沙门氏菌起更重要的作用[19-20]。目前已发现的车前中主要的具有免疫活性成分有车前子多糖、毛蕊花苷、异毛蕊花苷和桃叶珊瑚苷等。有研究发现使用车前草多糖可以显著增加大鼠的白细胞、T淋巴细胞亚群和淋巴细胞的数量[21]。从车前草提取的多糖可以与IFN-γ共同作用来激活巨噬细胞从而提高一氧化氮和肿瘤坏死因子-α的产生[22]。本试验结果也表明,饲粮饲粮添加超微粉碎车前可以显著提高肉仔鸡21日龄外周血单核细胞吞噬指数,这说明饲粮添加超微粉碎车前可以有效提高机体对吞噬清除病原体的能力;而饲粮添加超微粉碎车前可以显著提高肉仔鸡21、42日龄外周血淋巴细胞ConA刺激指数及42日龄外周血淋巴细胞LPS刺激指数,也说明其可以提高肉仔鸡T、B淋巴细胞的增殖分化能力。

鸡机体免疫器官指数的高低可以用来评价机体的免疫状态,脾脏是禽类最大的外周免疫器官,它参与全身的细胞免疫和体液免疫。研究表明,鼠伤寒沙门氏菌感染会使鸡使脾脏发生肿大,脾脏指数升高[23],这与本试验结果相符合。郑业龙[24]和刘师旗等[25]的研究都表明使用车前草多糖饲喂肉仔鸡可以显著提高其脾脏指数、胸腺指数和法氏囊指数。而本试验发现,饲粮添加一定量的超微粉碎车前对肉仔鸡的脾脏指数有显著提高作用,这与超微粉碎车前能够提高21和42日龄肉仔鸡外周血的淋巴细胞刺激指数这一结果相吻合,说明饲粮添加超微粉碎车前可以促进肉鸡脾脏的发育。但本试验中并未发现超微粉碎车前对肉仔鸡法氏囊指数和胸腺指数有显著影响,这可能是由于胸腺和法氏囊是中枢免疫器官,受后天影响小,而脾脏作为外周免疫器官,发育时间是在胚胎晚期及出生后,更易受到后期环境因素的影响。

3.3 超微粉碎车前对沙门氏菌感染肉仔鸡抗氧化功能的影响

本试验结果显示,沙门氏菌感染可显著增加肉仔鸡21日龄肝脏MDA含量,显著降低肉仔鸡14日龄回肠和21日龄空肠T-SOD活性,显著提高肉仔鸡21日龄回肠SOD1、HIF-1α和HMOX1基因的表达量。这表明,沙门氏菌感染引起了机体的氧化应激。沙门氏菌感染后,肠道屏障会被破坏,病原菌进入肉鸡体内肝脏等器官。为了清除病原菌,吞噬细胞会产生一些细胞毒素,如酶、裂解肽还有高度活化的氧自由基(ROS)和氮自由基(RNS)[26-27]等,破坏机体的自由基平衡状态,导致大量的自由基出现,超出机体清除的正常范围。过量的自由基会对细胞产生很强的毒害作用,使脂类物质发生过氧化反应,最终导致机体内的细胞膜发生损伤。车前提取物中含有黄酮类、苯乙醇苷类、多糖类等抗氧化成分。Yoon等[28]报道称车前草乙醇提取物对ROS的清除存在剂量依赖性,对一氧化氮的产生也有显著的抑制作用,这说明了车前可以起到抗氧化的作用。李守汉[21]研究发现服用车前草多糖可以显著提高大鼠肌肉内GSH-Px、超氧化物歧化酶和CAT的活性,车前草多糖通过提高体内抗氧化酶的活性来减轻细胞内部自由基的损伤。但是本试验中,14日龄时,饲粮添加超微粉碎车前显著提高了肉仔鸡空肠MDA含量,而显著降低了回肠T-SOD活性,这可能是由于肉仔鸡在前期采食量少所以摄入的车前中的活性成分少,也可能是由于14日龄正处在沙门氏菌感染的初级阶段,此时肠道内ROS正在大量产生,MDA不断积累,而抗氧化酶的活性也受到抑制;与其他添加量相比,饲粮添加0.50%超微粉碎车前可显著降低肉仔鸡14日龄肝脏MDA含量,而与除添加量为1.00%以外的其他添加量相比,饲粮添加2.00%超微粉碎车前可显著提高未感染沙门氏菌组肉仔鸡21日龄回肠T-SOD和GSH-Px活性,这显示出车前具有抗氧化效果,能缓解沙门氏菌感染引起的氧化还原失衡并提高肠道的抗氧化能力,从而起到保护机体的作用。

HMOX1的诱导表达是细胞对氧化和炎症损伤作出反应过程中的重要事件之一[29],是反映氧化应激的敏感指标,其表达量的升高表明机体受到氧化应激。本试验发现,沙门氏菌感染显著提高肉仔鸡回肠HMOX1基因表达量,表明沙门氏菌感染后机体出现氧化应激;而在感染条件下,饲粮添加一定量的超微粉碎车前显著降低了该基因表达,可能的原因是车前具有的抗氧化作用可以减少ROS的产生,从而减少了ROS对HMOX1表达的诱导作用,这一结果也同样表明超微粉碎车前具有缓解沙门氏菌感染导致肠道氧化应激的作用。

3.4 超微粉碎车前对沙门氏菌感染肉仔鸡肠道健康的影响

绒毛高度和隐窝深度是衡量肠道完整及健康的一个指标,杯状细胞同样也在肠道黏膜免疫功能中起重要作用,它分泌的黏液素覆盖在肠道黏膜表面,参与调节肠道特异性和非特异性免疫反应。本试验结果表明,饲粮添加超微粉碎车前可以显著提高肉仔鸡肠道绒毛高度,显著增加肉仔鸡黏膜层厚度,可能是因为车前中的一些活性物质,如苯乙醇苷类、环烯醚萜类物质[30-31]在肠道中起到了良好的抗菌抗炎作用,能够促进小肠绒毛发育来提高肠道黏膜屏障完整性,从而显著降低鸡肠道沙门氏菌的定植和入侵。与之相似,侯海锋等[32]的研究也表明,饲粮添加中药组方(包括茯苓、杜仲等富含苯乙醇苷和环烯醚萜等类物质的中药)可以增加肉鸡十二指肠和空肠的绒毛高度。

4 结论

在本试验条件下,饲粮添加超微粉碎车前能够通过促进脾脏发育和淋巴细胞增殖分化来提高肉仔鸡机体的免疫能力,可以通过提高抗氧化酶的活性来起到抗氧化的作用,此外对肉仔鸡肠道形态也具有保护作用,这表明其在一定程度上缓解了沙门氏菌感染对肉仔鸡的负面影响。

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