2. 生物饲料开发国家工程研究中心, 北京 100081
2. National Engineering Research Center for Biological Feed Development, Beijing 100081, China
在全球禁止使用促生长型抗生素的形势下，研发新型绿色生物饲料添加剂对于肉鸡产业稳定发展至关重要。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，可形成内生抗逆芽孢，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，具有良好的抗逆性，在含猪胆盐的培养基中仍可生长增殖；枯草芽孢杆菌能竞争性地排斥致病菌，促进有益菌株在肠道内定植[1-3]。研究表明，枯草芽孢杆菌能利用游离氮产生赖氨酸，减少氨的排放[4]；能提高坏死性肠炎科宝(Cobb)肉鸡的体重，降低死亡率[1]。枯草芽孢杆菌还能促进受损的绒毛隐窝结构的修复，以及增强有益菌的定植，提高生产性能[5]。Reis等[6]发现枯草芽孢杆菌能提高禽类生长性能和表观代谢率，降低生产成本。赵姝娴等[7]研究表明，饲粮添加0.5 g/kg枯草芽孢杆菌显著提高了73周龄蛋鸡钙的表观沉积量，显著降低了粪钙排泄量。目前，关于枯草芽孢杆菌对肉鸡胫骨指标的影响报道较少。本试验研究饲粮添加枯草芽孢杆菌对肉仔鸡生长性能、血清生化和胫骨指标的影响，为其在肉鸡生产应用中提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料枯草芽孢杆菌CA01216为粉状，菌粉中活菌数为1.0×1011 CFU/g。
1.2 试验设计选择180只体重相近1日龄健康爱拔益加(AA)肉仔鸡，随机分为3个组，每组6个重复，每个重复10只鸡。对照组饲喂基础饲粮，抗生素组在基础饲粮中添加5 mg/kg黄霉素、75 mg/kg金霉素和20 mg/kg吉他霉素，枯草芽孢杆菌组在基础饲粮中添加1.5×1010 CFU/kg枯草芽孢杆菌。基础饲粮采用玉米-豆粕型饲粮，参照《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)配制，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
饲养试验在中国农业科学院饲料研究所南口试验基地进行。采用立体笼养，4层笼，每笼饲养10只鸡；每天23 h光照、1 h黑暗；采用乳头式饮水器供水，自由采食饲粮(粉料)；水循环式暖气供热，前3 d鸡舍温度维持在33 ℃，此后每周降低2 ℃，直到24 ℃，并维持在24 ℃。肉仔鸡1日龄接种马立克疫苗，7日龄滴鼻点眼接种新城疫和肾传支二联苗。试验鸡饲养管理、免疫规程和鸡舍卫生管理均按AA肉鸡饲养规程进行。每天进行健康观察，试验期42 d。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 生长性能分别于肉仔鸡21和42日龄时，以重复为单位进行称重，统计试验期间各重复耗料量，计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。记录试验期间各组肉仔鸡的死亡和淘汰情况。
1.4.2 血清生化指标分别于21和42日龄，每重复随机选取1只肉仔鸡，颈静脉采血10 mL，分离血清用日立7600全自动生化分析仪测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、钙、磷、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿酸(UA)和氨(BA)含量以及碱性磷酸酶(ALP)活性。测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，测定方法和结果计算按说明书进行。
1.4.3 胫骨指标使用Wd-1电子万能试验机(长春非金属材料试验机器厂)测定胫骨断裂强度，记录断裂强度值。然后收集胫骨放入干净的塑料袋保存以备测定胫骨灰分含量等指标[8]。
右侧胫骨高温蒸煮6 min后剥离所有软组织，105 ℃烘干24 h脱水后用纯度为99.5%的乙醚浸泡96 h，65 ℃烘干4 h至恒重，称重，胫骨粉碎过40目筛，混匀550 ℃马弗炉中灰化24 h，称重计算灰分含量。灰分含量测定参照GB/T 6438—1992的方法，灰分中钙含量测定采用乙二胺四乙酸(EDTA)直接容量法(GB/T 6436—1992)，灰分中磷含量测定采用钒钼酸铵法(GB/T 6437—1992)。胫骨灰分和胫骨钙、磷含量均以风干胫骨重为基础。
1.5 数据统计分析用Excel 2016对试验数据进行整理，采用SPSS 21.0软件中的独立样本t检验进行统计分析，以P < 0.05作为差异显著的判断标准，P < 0.01作为差异极显著的判断标准，试验数据均表示为“平均值±标准差(mean±SD)”。
2 结果 2.1 饲粮添加枯草芽孢杆菌对肉仔鸡生长性能的影响由表 2可知，1~21日龄，与对照组相比，饲粮添加抗生素和枯草芽孢杆菌显著降低了肉仔鸡ADFI(P＜0.05)，分别降低了8.91%、7.21%，对肉仔鸡末重、ADG、F/G无显著性影响(P＞0.05)。22~42日龄，与对照组相比，饲粮添加枯草芽孢杆菌对肉仔鸡末重、ADG和ADFI无显著性影响(P＞0.05)，但显著提高了肉仔鸡F/G(P＜0.05)；饲粮添加抗生素显著提高了肉仔鸡末重、ADG和ADFI(P＜0.05)，极显著降低了肉仔鸡F/G(P＜0.01)。
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表 2 饲粮添加枯草芽孢杆菌对肉仔鸡生长性能的影响 Table 2 Effects of dietary Bacillus subtilis on growth performance of broilers |
由表 3可知，21日龄，与对照组相比，饲粮添加枯草芽孢杆菌和抗生素均显著提高了肉仔鸡血清TC含量，分别提高了72.67%(P＜0.01)、54.65%(P＜0.05)；枯草芽孢杆菌组肉仔鸡血清TG含量极显著提高了70.00%(P＜0.01)。42日龄，与抗生素组相比，枯草芽孢杆菌组肉仔鸡血清TC含量极显著提高了42.08%(P＜0.01)，对照组肉仔鸡血清TC含量显著提高(P＜0.05)；各组间肉仔鸡血清TG含量无显著性差异(P＞0.05)。
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表 3 饲粮添加枯草芽孢杆菌对肉仔鸡血清脂类含量的影响 Table 3 Effects of dietary Bacillus subtilis on serum lipid contents of broilers |
由表 4可知，各组间肉仔鸡血清钙、磷含量无显著性差异(P＞0.05)。21日龄，与对照组相比，枯草芽孢杆菌组和抗生素组肉仔鸡血清ALP活性均有提高，分别提高了9.24%(P＞0.05)、29.20%(P＜0.01)，并且抗生素组肉仔鸡血清ALP活性显著高于枯草芽孢杆菌组(P＜0.05)。42日龄，与对照组和抗生素组相比，枯草芽孢杆菌组肉仔鸡血清ALP活性极显著提高(P＜0.01)。
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表 4 饲粮添加枯草芽孢杆菌对肉仔鸡血清钙、磷含量及ALP活性的影响 Table 4 Effects of dietary Bacillus subtilis on serum contents of calcium and phosphorus and ALP activity of broilers |
由表 4可知，21日龄，与对照组相比，枯草芽孢杆菌组肉仔鸡血清TP含量显著提高(P＜0.05)，枯草芽孢杆菌组和抗生素组肉仔鸡血清ALB含量均显著提高，分别提高55.20%(P＜0.01)、47.96%(P＜0.05)；抗生素组肉仔鸡血清GLB含量无显著性差异(P>0.05)，但枯草芽孢杆菌组肉仔鸡血清GLB含量显著提高(P＜0.05)；枯草芽孢杆菌组肉仔鸡血清UA含量极显著降低(P＜0.01)，抗生素组肉仔鸡血清UA含量显著降低(P＜0.05)；枯草芽孢杆菌组和抗生素组肉仔鸡血清BA含量均极显著降低(P＜0.01)。
42日龄，与对照组相比，饲粮添加抗生素对肉仔鸡血清TP、ALB和GLB含量无显著性影响(P＞0.05)；与对照组和抗生素组相比，饲粮添加枯草芽孢杆菌极显著提高了肉仔鸡血清TP和ALB含量(P＜0.01)；与对照组相比，饲粮添加枯草芽孢杆菌显著提高了肉仔鸡血清GLB含量(P＜0.05)；与对照组相比，饲粮添加枯草芽孢杆菌和抗生素均显著降低了肉仔鸡血清BA含量，分别降低了19.08%(P＜0.05)、26.42%(P＜0.01)；各组间肉仔鸡血清UA含量无显著性差异(P＞0.05)。
2.4 饲粮添加枯草芽孢杆菌对肉仔鸡胫骨指标的影响由表 5可知，21日龄，与对照组相比，饲粮添加枯草芽孢杆菌显著降低了肉仔鸡胫骨强度(P＜0.05)，抗生素组肉仔鸡胫骨强度极显著降低(P＜0.01)；饲粮添加枯草芽孢杆菌和抗生素均提高了肉仔鸡胫骨钙含量，分别提高了15.32%(P＞0.05)、18.33%(P＜0.05)；与抗生素组相比，枯草芽孢杆菌组肉仔鸡胫骨磷含量显著提高(P＜0.05)，较对照组差异不显著(P＞0.05)；各组间肉仔鸡胫骨灰分含量无显著性差异(P＞0.05)。
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表 5 饲粮添加枯草芽孢杆菌对肉仔鸡血清蛋白及其代谢物含量的影响 Table 5 Effects of dietary Bacillus subtilis on serum contents of protein and its metabolites of broilers |
42日龄，枯草芽孢杆菌组肉仔鸡胫骨灰分含量较对照组无显著性差异(P＞0.05)，但抗生素组肉仔鸡胫骨灰分含量显著降低(P＜0.05)。与抗生素组相比，饲粮添加枯草芽孢杆菌显著提高了肉仔鸡胫骨强度(P＜0.05)，对照组和枯草芽孢杆菌组间差异不显著(P＞0.05)；与对照组相比，饲粮添加枯草芽孢杆菌极显著提高了肉仔鸡胫骨钙和磷含量(P＜0.01)，分别提高了32.45%、22.90%；抗生素组与对照组之间肉仔鸡胫骨磷和钙含量差异不显著(P＞0.05)。
3 讨论 3.1 饲粮添加枯草芽孢杆菌对肉仔鸡生长性能的影响枯草芽孢杆菌能以孢子的形式在肠道内迅速增殖，消耗掉肠道内的氧气，抑制有害菌生长，促进有益菌增殖，改善肠道菌群结构，从而改善饲料的利用效率，促进动物健康生长[9]。彭豫东等[10]研究表明，饲粮添加300、600 mg/kg枯草芽孢杆菌均未显著影响28日龄石门土鸡的ADG、ADFI和F/G。钟光等[11]研究发现，饲粮添加枯草芽孢杆菌显著降低了肉鸡1~21日龄末重、ADG和ADFI，显著提高了肉鸡22~42日龄ADG。Abudabos等[12]研究发现，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌均可通过减轻沙门氏菌病的有害作用来改善肉鸡的生长性能和肠道形态。Jacquier等[13]研究发现，饲粮添加枯草芽孢杆菌能极显著降低42日龄Cobb肉鸡的饲料转化率，显著提高体增重，但对采食量和死亡率影响不显著。本试验结果表明，饲粮添加枯草芽孢杆菌显著提高了22~42日龄肉仔鸡的F/G，显著降低了1~21日龄肉仔鸡的ADFI。本试验结果与前人研究结果不尽相同的原因可能与菌株差异或试验动物品种、生长阶段不同有关。
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表 6 饲粮添加枯草芽孢杆菌对肉仔鸡胫骨指标的影响 Table 6 Effects of dietary Bacillus subtilis on tibia indices of broilers |
血清中TG、TC含量变化反映了脂肪代谢水平[14]。Hussein等[15]在饲粮中无论单独或混合添加酵母菌和枯草芽孢杆菌，均极显著降低了肉鸡血清中总脂质和胆固醇含量。孙玲玲等[16]研究表明，饲粮添加枯草芽孢杆菌对28日龄雏鹅血清TG含量影响不显著。李卫芬等[17]研究表明，饲粮添加枯草芽孢杆菌显著降低了肉鸡血清中TC和TG含量。本试验结果表明，饲粮添加枯草芽孢杆菌极显著提高了21日龄肉仔鸡血清TC、TG含量和42日龄血清TC含量。
ALP主要由成骨细胞和肝脏合成分泌，与钙、磷的代谢活动密切相关。高活性的ALP能促进骨形成和骨盐沉积，从而加快机体代谢，促进动物生长发育。孙玲玲等[16]研究表明，饲粮添加枯草芽孢杆菌对28日龄雏鹅血清ALP活性影响不显著。李卫芬等[17]研究表明，饲粮添加枯草芽孢杆菌显著提高了血清ALP活性。孙焕林等[18]在饲粮中添加5%枯草芽孢杆菌发酵棉籽粕，发现能显著提高28、42及64日龄黄羽肉鸡血清钙含量，显著提高14日龄黄羽肉鸡血清磷含量。另有研究发现枯草芽孢杆菌能显著提高14日龄肉鸡血清钙含量，但对血清磷含量影响不显著[19]。本试验中，与对照组相比，饲粮添加枯草芽孢杆菌极显著提高了42日龄肉仔鸡血清ALP活性，但对血清钙、磷含量的提高效果不显著。与前人研究结果不同的原因有2点：1)血清钙、磷含量可能与饲粮钙、磷含量有关；2)可能是试验动物和采样时间的差异，导致了观测的随机性和滞后性。当成骨细胞活跃时，骨源ALP的合成活性提高，分泌进入血清的ALP能促进血清中的钙、磷转运至骨细胞中完成骨形成和骨盐沉积，所以血清与胫骨中钙、磷是否呈线性传递有待进一步研究。
3.3 饲粮添加枯草芽孢杆菌对肉仔鸡血清蛋白及其代谢物含量的影响血清中TP的含量是反映蛋白质在动物机体中沉积量的重要指标，ALB主要由肝脏合成，具有运输体内代谢物质、维持胶体渗透压稳定性和保护血液中GLB等功能。血清中的BA和UA是蛋白质的代谢产物，其含量的多少能间接地反映禽类对于蛋白质的利用情况，同时UA也是反映动物脏肾功能的指标。许运岑等[14]研究发现，与对照组相比，枯草芽孢杆菌显著提高了AA肉鸡血清TP和GLB含量，未显著影响血清ALB含量。王佰魁等[20]研究表明，与抗生素组相比，枯草芽孢杆菌B10显著降低了血清UA含量，对血清TP、ALB和GLB含量影响不显著。本试验结果显示，饲粮添加枯草芽孢杆菌能够降低肉仔鸡血清BA和UA含量，并提高血清TP、ALB和GLB含量，与前人研究结果相似。这说明饲粮添加枯草芽孢杆菌不仅能提高肉仔鸡合成蛋白质的能力，促进蛋白质在体内沉积，还能帮助缓解肾脏的压力，降低血清UA含量。
3.4 饲粮添加枯草芽孢杆菌对肉仔鸡胫骨指标的影响钙、磷是羟基磷灰石的主要成分，羟基磷灰石是骨矿基质的主要形式，决定胫骨的抗压强度和硬度。枯草芽孢杆菌可能通过提高肉鸡中枢血清素的水平，抑制交感神经兴奋所造成的骨吸收[21]，从而改善肉鸡的骨骼发育。毕云天[22]发现，饲粮添加枯草芽孢杆菌显著提高了21日龄肉鸡的胫骨钙含量。但葛文华等[23]研究发现，饲粮添加枯草芽孢杆菌显著提高了11周龄五龙鹅的胫骨密度、胫骨强度、胫骨灰分含量，对胫骨钙含量影响不显著。本试验结果显示，饲粮添加枯草芽孢杆菌极显著高了42日龄肉仔鸡胫骨钙、磷含量，而对血清钙、磷含量无显著性影响，这说明枯草芽孢杆菌可能提高了肉鸡对钙、磷的吸收与沉积。此外，饲粮添加枯草芽孢杆菌显著提高了42日龄肉仔鸡血清ALP活性，与此同时枯草芽孢杆菌组胫骨钙、磷含量随之提高；而抗生素组肉仔鸡42日龄血清ALP活性较对照组显著降低，其胫骨钙、磷含量也未得到提高。由此可推测，饲粮添加枯草芽孢杆菌可能通过提高骨源ALP的合成与分泌来促进胫骨钙、磷的沉积。
4 结论本试验条件下，饲粮添加枯草芽孢杆菌显著降低了1~21日龄肉仔鸡ADFI，显著提高了22~42日龄肉仔鸡料重比，改善了肉仔鸡脂代谢能力，提高了血清蛋白质含量，降低了血清氮含量，增强了42日龄肉仔鸡胫骨强度，促进了肉仔鸡胫骨中钙、磷的沉积。
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