温室气体排放是造成全球气候变暖的重要原因。据报道，过去130年间，全球地表平均温度上升了0.87 ℃，并正在以每10年0.2 ℃的速度增长^[1]。据联合国政府间气候变化专门委员会(IPCC)预计，2030—2052年，全球气温将比前工业时代增加1.5 ℃^[2]。甲烷(CH₄)是反刍动物瘤胃厌氧发酵的天然产物，是仅次于二氧化碳的第二大温室气体，但同体积甲烷的温室潜能是二氧化碳的28~34倍^[3]。据估测，农业甲烷排放量约占人类活动排放甲烷总量的50.6%^[4]，而反刍动物每年甲烷的排放量约占全球甲烷排放总量的16%^[5]。2015年我国反刍动物甲烷排放量约为10.2 Tg，占全国甲烷排放总量的20.5%^[6]。预计到2050年，世界人口将达到98亿^[7]，人类对肉类和牛奶的需求将分别比2010年增长73%和58%^[8]。毋庸置疑，反刍动物饲养数量也将大幅增加，这将为控制甲烷等温室气体的排放带来巨大挑战。

1 降低反刍动物瘤胃甲烷生成的调控措施

目前，降低反刍动物瘤胃甲烷生成的途径主要有3个：一是降低产甲烷菌的数量和活性^[5]。通过直接或间接降低产甲烷菌的数量，均能降低瘤胃甲烷的生成。研究表明，去除原虫能够间接降低瘤胃产甲烷菌的数量^[9]，一些植物提取物及其代谢产物，如皂苷、单宁、大蒜素等，都具有降低瘤胃产甲烷菌数量的作用^[10]。但瘤胃微生物具有自我调节能力，长期使用此类方法可能会使瘤胃微生物产生适应性，从而影响抑制甲烷产生的效果^[11-12]。二是降低瘤胃氢气的生成或者添加耗氢化合物争夺氢^[13]。反刍动物饲粮中添加的耗氢化合物可以被瘤胃微生物利用，通过代谢消耗一部分氢气，从而减少瘤胃甲烷的产生。主要的耗氢化合物及微生物有不饱和脂肪酸、延胡索酸、硫酸盐还原菌、产乙酸菌及酵母菌等^[14]。三是添加特异性抑制剂，抑制甲烷生成途径中某些酶的活性，如2-溴乙烷磺酸钠(BES)、溴氯甲烷等^[15]。但BES对瘤胃甲烷生成的抑制作用较短暂，且可能导致产甲烷菌产生耐性，而溴氯甲烷可能具有潜在的致癌性，危害人类和动物健康，因此二者无法应用于实际生产中^[16]。

2 3-硝基酯-1-丙醇(3-NOP)的功能及抑制反刍动物甲烷生成的机制

3-NOP是一种有机化合物，分子式为C₃H₇NO₄^[17]。研究表明，3-NOP抑制反刍动物瘤胃甲烷生成相对高效，可使瘤胃甲烷的产量减少20%~40%^[8]。3-NOP性质相对稳定，在牛奶、肉中无残留^[17-19]。针对3-NOP的安全性，Thiel等^[19]进行了毒药物动力学(ADME)试验，分别检测了3-NOP在大鼠、哺乳山羊及肉牛体内的吸收、分布、代谢及排泄变化等指标，结果表明3-NOP可以安全地用于反刍动物生产。在小鼠上进行的埃姆斯致突变性检测和小鼠淋巴瘤试验结果表明，3-NOP及其在血浆中的代谢产物无遗传毒性和致突变性^[17]。目前针对3-NOP在反刍动物上的安全性研究数量相对较少，还需要开展大量试验加以证实^[20]。

反刍动物瘤胃甲烷的生成过程比较复杂，简而言之是二氧化碳在一系列酶的作用下被还原，依次生成甲酰甲烷呋喃、甲川四氢甲烷蝶呤、甲叉四氢甲烷蝶呤、甲基四氢甲烷蝶呤、甲基辅酶M，最后释放出甲烷^[21]。根据碳代谢途径的差异，甲烷生成主要分为二氧化碳-氢气还原途径、甲基裂解途径和乙酸发酵途径^[22]。上述3种生成甲烷的途径最终都汇集到甲基辅酶M的生成。甲基辅酶M与辅酶B结合，在甲基辅酶M还原酶(MCR)的催化下生成甲烷及辅酶B的杂硫化合物^[23](图 1)。MCR是一种镍酶，由α₂、β₂、γ₂ 3个亚基和辅酶F₄₃₀组成，它是催化瘤胃甲烷生成最后一步的关键酶^[24-25]。F₄₃₀是一种镍卟啉，是MCR活化中心的必要组成部分，目前仅在瘤胃产甲烷古菌中发现有该物质^[26]。MCR中的镍结合在F₄₃₀辅因子上，只有当镍为+1价时，F₄₃₀才有活性。由于F₄₃₀的氧化还原电势极低(<-600 mV)，因此极易被氧化^[24]。Duin等^[27]采用分子对接试验发现，由于3-NOP与甲基辅酶M结构类似，可替代甲基辅酶M与MCR的活性位点结合，通过氧化MCR活性位点使其失活，从而抑制瘤胃甲烷的生成。也有研究表明，3-NOP可以通过减少瘤胃中产甲烷菌的数量来降低甲烷的生成。例如，Martínez-Fernández等^[28]给绵羊饲粮中添加3-NOP后，绵羊瘤胃中产甲烷古菌的数量减少。Haisan等^[29]在奶牛上的试验也发现了类似的产甲烷菌数量减少的现象。Meta分析显示，3-NOP可以降低瘤胃产甲烷古菌的数量，但对瘤胃中其他细菌和原虫的数量没有影响^[30]。

3 3-NOP在反刍动物生产中的应用研究 3.1 抑制反刍动物瘤胃甲烷生成效率及其影响因素

3-NOP抑制反刍动物瘤胃甲烷生成的效率受到其添加水平的影响。Romero-Perez等^[31]在安格斯肉牛饲粮中添加不同水平的3-NOP，每千克体重分别添加0、0.75、2.25和4.50 mg，发现4组肉牛瘤胃每天的甲烷产量随添加水平的升高而递减；Vyas等^[32]给阉牛添加不同水平(0、50、75、100、150和200 mg/kg DM)的3-NOP，6组阉牛每头每天的甲烷产量也呈线性递减；Hristov等^[33]给4组荷斯坦奶牛分别添加0、40、60和80 mg/kg DM的3-NOP，与空白组相比，饲喂3-NOP的3组奶牛每头每天的瘤胃甲烷产量依次下降了25%、31%和32%。而Meta分析显示，当饲粮每千克干物质中3-NOP的添加水平在0~280 mg时，随着添加水平的增加，瘤胃甲烷产量呈线性下降^[30]。

饲粮的纤维含量也是影响3-NOP作用效果的因素。Vyas等^[32]将阉牛分为3组，对照组不添加3-NOP，其他2组(高精料组和高粗饲料组)每天均添加200 mg/kg DM的3-NOP，与对照组相比，高精料组阉牛每天甲烷产量的下降幅度显著高于高粗饲料组(48.7% vs. 33.0%)。Meta分析显示，当反刍动物饲粮中中性洗涤纤维(NDF)含量从331 g/kg增加到341 g/kg时，3-NOP抑制甲烷生成的效率下降约1.64%^[34]。上述结果说明，3-NOP在低纤维饲粮中具有更大的抑制瘤胃甲烷生成的潜力，造成这一结果的原因可能是由于饲喂低纤维饲粮的牛瘤胃中MCR的浓度低于饲喂高纤维饲粮牛瘤胃中的MCR浓度^[35]，因此，在低纤维饲粮中添加3-NOP可以更有效地抑制MCR的活性，从而更高效地抑制瘤胃甲烷生成。此外，3-NOP抑制反刍动物瘤胃甲烷生成的效率在不同牛品种间存在差异。Dijkstra等^[34]发现，当给奶牛和肉牛饲粮中添加同等水平的3-NOP时，奶牛瘤胃甲烷产量的下降幅度显著高于肉牛(32.5% vs. 29.3%)。因此，若想让3-NOP对奶牛和肉牛的瘤胃甲烷生成产生相近的抑制效果，肉牛饲粮中需要添加更高水平的3-NOP。

3-NOP具有水溶性，进入瘤胃后会被吸收、代谢或稀释^[33]。动物采食3-NOP后，在瘤胃内的停留时间长短影响着其抑制甲烷生成的效果。McGinn等^[36]在饲粮中添加了125 mg/kg DM的3-NOP，肉牛采食后瘤胃甲烷产量明显下降，但几小时后，甲烷产量下降的幅度降低。Reynolds等^[37]在奶牛中也发现了类似的效果，动物采食含3-NOP饲粮2 h后瘤胃甲烷产量就开始明显减少，但随后3-NOP抑制甲烷生成的效率有所减弱。因此，如果只是给反刍动物间断补充3-NOP，可能无法达到持续抑制瘤胃甲烷生成的目的，并可能会增加动物应激，因此将3-NOP与全混合日粮(TMR)混合饲喂或许是最佳的饲喂方式。

3.2 对反刍动物瘤胃发酵的影响

瘤胃发酵参数是评价反刍动物瘤胃发酵模式的重要指标，主要包括瘤胃液pH、NH₃-N浓度、挥发性脂肪酸(VFA)的摩尔比例以及总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度等指标。有研究报道，饲喂3-NOP会提高反刍动物瘤胃液的pH。Romero-Perez等^[38]给安格斯牛饲粮中每天加入2 g的3-NOP，瘤胃液pH从5.67上升到5.89。Martinez-Fernandez等^[39]在婆罗门牛饲粮中每天加入60 mL的3-NOP，瘤胃液pH由6.87升高到6.96。Jayanegara等^[30]指出，饲喂3-NOP使瘤胃液pH升高可能与瘤胃液中TVFA浓度下降有关。Melgar等^[40]给荷斯坦奶牛饲粮中添加3-NOP，TVFA浓度下降了9.3%。Romero-Perez等^[31]给安格斯肉牛饲粮添加4.5 mg/kg BW的3-NOP，瘤胃液中丙酸摩尔比例升高了22%，乙酸摩尔比例降低了15%，且丁酸、戊酸和异丁酸的摩尔比例随着3-NOP添加水平的增加而提高。正常情况下，反刍动物瘤胃内的微生物可以利用葡萄糖和氧化型辅酶Ⅰ(NAD⁺)生成丙酮酸、ATP和还原型辅酶Ⅰ(NADH)。随后，丙酮酸可进一步发酵成VFA，而NADH则被氧化为NAD⁺。NAD⁺和NADH之间的循环保证了葡萄糖酵解的顺利进行。此外，NADH转化为NAD⁺还可通过氢气的生成途径来完成。而一旦瘤胃内氢气的分压(P_H2)提高时将影响NAD⁺的产量、葡萄糖的酵解及后续VFA的生成。瘤胃产甲烷菌可利用二氧化碳和氢气生成甲烷，然而当3-NOP在瘤胃内抑制了产甲烷菌生成甲烷时，P_H2将增高，这会降低NAD⁺的生成并影响葡萄糖酵解过程，最终引起瘤胃TVFA浓度下降^[41]。此外，添加3-NOP后瘤胃液中丙酸摩尔比例升高，可能是由于瘤胃中丙酸的合成与甲烷生成过程存在氢竞争的关系，当甲烷产量下降时，更多的氢可用于丙酸的合成^[30]。Martínez-Fernández等^[28]发现，饲喂3-NOP组绵羊的瘤胃液NH₃-N浓度与对照组相比无显著差异。Romero-Perez等^[31]指出，瘤胃内原虫以细菌为食，可分解菌体蛋白产生氨气(NH₃)，饲粮中添加3-NOP虽然会使古菌数量减少，但不会影响细菌和原虫的数量，这可能是造成瘤胃NH₃-N浓度无显著变化的部分原因。

3.3 对反刍动物生产性能的影响

Meta分析结果显示，3-NOP对采食量、产奶量无显著影响，但可改善奶牛的乳脂率以及肉牛的饲料效率^[30]。Haisan等^[29]给荷斯坦奶牛每天提供2.5 g的3-NOP，发现奶牛的干物质采食量和产奶量均无显著变化，乳脂率较对照组提高了0.32%。Hristov等^[33]在荷斯坦奶牛饲粮中添加80 mg/kg DM的3-NOP，奶牛的干物质采食量和产奶量无显著变化，乳脂率比对照组提高了0.17%。Vyas等^[42]在肉牛饲粮中添加200 mg/kg DM的3-NOP，肉牛的增重饲料比得到提高。Martinez-Fernandez等^[39]给肉牛每天提供2.5 g的3-NOP，发现日增重较对照组提高了0.61 kg。饲喂3-NOP降低了瘤胃甲烷产量，降低了能量损失，所节约的能量可更多的用于泌乳牛乳脂的合成或肉牛的体增重^{[30, 39]}。

4 小结

3-NOP可通过氧化MCR的活性位点使其失活，从而高效抑制反刍动物瘤胃甲烷的生成。3-NOP对反刍动物的采食量和产奶量无显著影响，但可改善奶牛的乳脂率及肉牛的饲料效率，影响瘤胃的发酵模式，增加丙酸的产量。目前，针对3-NOP在动物生产中的应用已经开展了大量研究工作，但关于3-NOP安全性评价的研究较少，这也是3-NOP仍处于试验阶段，还未被商品化的主要原因。因此，未来可将3-NOP的安全性评价作为研究重点。此外，3-NOP在反刍动物生产中的应用效果受不同因素的影响，为了实现在不影响饲料消化率和动物生产性能的条件下，持续降低甲烷产量的目的，还需要对3-NOP的理想添加水平、补充方式做进一步探讨。