断奶仔猪腹泻的发生引起动物消化机能紊乱，严重降低断奶仔猪生长性能和存活率，添加饲用抗生素是减缓仔猪腹泻的有效措施之一^[1-2]。随着饲用抗生素将于2020年7月全面禁用，寻找抗生素替代物、有效防控仔猪腹泻成为亟待解决的问题。单宁(酸)是广泛存在于植物中的多酚类活性物，因酚羟基极易结合蛋白质、淀粉和金属离子等养分，从而降低养分消化吸收，同时影响适口性，是植物饲料原料中一类重要的抗营养因子^[3-5]。随着植物化学快速发展，在分子水平确认了五倍子等传统中草药中的单宁酸具有收敛抗腹泻^[6]、抗氧化^[7]、抗菌^[8]、抗病毒^[8]、抑制肿瘤细胞增殖^[9]、调节细胞凋亡^[9]等作用，在食品、医药、化妆品和制革等行业得到了广泛应用。单宁酸在非反刍动物生产应用中也越来越受到关注^{[7, 10-12]}。因单宁酸作用效果的差异和作用机制不清，使得单宁酸的应用有很大争议。关于单宁酸是否会抑制消化酶活性以及降低养分消化吸收的问题鲜有报道。因此，本试验旨在通过研究五倍子单宁酸(Gallnut tannic acid，GTA)对断奶仔猪生长性能、腹泻、养分表观消化率和消化酶活性的影响，以期得到仔猪饲粮中GTA的适宜添加量，为GTA在断奶仔猪生产中的应用提供技术支撑。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验用GTA自五倍子中提取，环糊精包被，单宁酸含量为40%，由贵阳某生物科技有限公司生产提供。15%金霉素购自金河某生物科技公司，4%恩拉霉素预混料购自某制药公司。

1.2 试验动物与试验设计

饲养试验在贵阳台农种养殖有限公司试验场进行。选取健康、体重为(7.07±0.06) kg的(24±2)日龄“杜×长×大”断奶仔猪150头，采用单因子试验设计，随机分为5组，每组5个重复，每个重复6头仔猪，公母各占1/2。对照组仔猪饲喂基础饲粮，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组则分别饲喂在基础饲粮中添加抗生素(0.7 mg/kg金霉素和0.22 mg/kg恩拉霉素)、700、1 200和1 700 mg/kg GTA的试验饲粮。预试期4 d，正试期28 d。

1.3 基础饲粮

参照NRC(2012)猪营养需要和《中国饲料成分及营养价值表》(2018)设计玉米-豆粕型基础饲粮，制成颗粒饲料，基础饲粮组成及营养水平见表 1。

1.4 饲养管理

在保育舍内饲养仔猪，保证室温在25~28 ℃，自由采食和饮水。每日打扫畜舍，记录舍内温度、湿度和各项试验数据，仔猪防疫、药物保健、屋舍消毒、驱虫等程序严格按照试验场操作规程执行。

1.5 消化试验

采用4 mol/L盐酸不溶灰分(AIA)法进行消化试验。在试验结束前5天，每重复按粪样5%收集，每100 g鲜粪中加入10%盐酸10 mL以固氮和数滴二甲苯以防腐，并置于-20 ℃保存，将5 d的粪样混合均匀，于65 ℃下制成风干样本，粉碎过60目筛，于-20 ℃保存以备分析。

1.6 测定指标及方法 1.6.1 生长性能及腹泻

于试验开始和结束时分别空腹称量仔猪体重。每日收集记录仔猪喂料量和剩料量、死亡仔猪数和死亡仔猪体重，计算仔猪平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

每日观察仔猪粪便，进行粪便评分，记录腹泻发生情况，计算腹泻率和腹泻指数^[13]。计算公式如下：

每周从各圈中连续取3 d粪样混合后，测定猪粪中水分含量^[14]。

1.6.2 养分含量和表观消化率

测定饲粮和粪中总能(ISO 9831:1998，全自动量热仪VBR-6000型)及干物质(DM，GB/T 6435—2014)、粗蛋白质(CP，GB/T 6432—1994)、粗脂肪(EE，GB/T 6433—2006)、钙(Ca，GB/T 6436—2002)、磷(P，GB/T 6437—2002)和酸不溶灰分(AIA，GB/T 23742—2009)含量。参照文献[15]的AIA法计算养分表观消化率。计算公式如下：

1.6.3 肠道消化酶活性

试验第28天时，每个重复随机选择1头仔猪，每组共5头仔猪，戊巴比妥钠麻醉后屠宰，快速打开腹腔，结扎胃幽门下端起始、回盲瓣，取全肠段，剪开十二指肠、空肠和回肠肠壁，收集内容物并用玻璃棒搅拌均匀。全部样品置于-80 ℃冰箱冷冻保存。测定时称取解冻待测样品于研钵内，加10倍体积0.01 mol/L盐酸及少许石英砂，研磨后置4 ℃冰箱1 h提取酶液，再用高速离心机于4 ℃条件下以18 400 r/min速度离心30 min，取上清液用来测定胰蛋白酶、α-淀粉酶(α-AMS)及脂肪酶(LPS)活性活性。其中胰蛋白酶、α-AMS和LPS活性分别采用紫外比色法、碘-淀粉比色法和甲基试卤灵底物法(微板法)测定，所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.7 数据处理与分析

利用SPSS 26.0统计软件先对数据进行正态性(one simple K-S test)和方差齐性检验，再进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法进行多重比较。结果采用平均值±标准差表示。P < 0.05表示差异显著。

2 结果与分析 2.1 GTA对断奶仔猪生长性能的影响

由表 2可知，与对照组相比，试验Ⅰ组和Ⅳ组ADG显著高于对照组(P < 0.05)，但试验Ⅰ组和Ⅳ组间无显著差异(P>0.05)，对照组、试验Ⅱ组和Ⅲ组间亦无显著差异(P>0.05)。仔猪饲粮中添加抗生素和GTA有促进仔猪ADFI的趋势(P=0.055)。抗生素和GTA的添加对F/G无显著改善作用(P>0.05)。

2.2 GTA对仔猪腹泻和粪中水分含量的影响

由表 3可知，与对照组相比，添加GTA显著降低仔猪腹泻率、腹泻指数和粪中水分含量(P < 0.05)，并且随着GTA添加量的增加，腹泻率、腹泻指数和粪中水分含量逐渐降低，当GTA添加量为1 700 mg/kg时，腹泻率、腹泻指数和粪中水分含量达到最小值；试验Ⅰ组仔猪腹泻率、腹泻指数和粪中水分含量无显著差异(P>0.05)，表明GTA可有效减缓仔猪腹泻和腹泻程度。

2.3 GTA对断奶仔猪养分表观消化率的影响

由表 4可知，与对照组相比，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的DM、GE、CP、EE和P表观消化率无显著差异(P>0.05)，但添加GTA有增加钙表观消化率的趋势(P=0.070)，且随着GTA添加量增加，钙表观消化率也随之增加，GTA添加量为1 200 mg/kg时达到最大值。这提示添加700~1 700 mg/kg GTA不影响饲粮养分消化利用。

2.4 GTA对断奶仔猪肠道消化酶活性的影响

由表 5可知，与对照组相比，添加GTA显著增加十二指肠胰蛋白酶活性(P < 0.05)，但并未引起α-AMS和LPS活性的显著增加(P>0.05)。与对照组相比，添加抗生素亦不能显著提高胰蛋白酶、α-AMS和LPS活性(P>0.05)。试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组仔猪空肠和回肠中胰蛋白酶、α-AMS和LPS活性与对照组无显著差异(P>0.05)。

3 讨论 3.1 GTA对断奶仔猪生长性能的影响

采食量是决定畜禽生产性能的关键因素，促进动物采食在很大程度上意味着生产性能的提高。单宁广泛分布于植物的茎、叶、花、果中^[3]。本试验结果显示，添加GTA有增加仔猪ADFI趋势，当GTA添加量为1 700 mg/kg(以净含量计为680 mg/kg)时，仔猪ADFI与试验Ⅰ组相近。环糊精包被可改善GTA的适口性^[16]，促进仔猪采食，提高仔猪ADG^{[11, 17]}。Ramah等^[18]还认为适度涩味可以刺激单胃动物的食欲，提高ADFI。添加1.02~10.20 g/kg(以净含量计)鞣酸蛋白对仔猪采食、增重和饲料转化效率无显著影响^[10]，然而添加382.5~1 147.5 mg/kg栗木单宁却提高了断奶仔猪生长性能^[12]。单宁酸添加量高于3%时降低公猪采食和生长^[10]。研究还显示，当饲粮单宁含量超过4%~5%时会明显抑制动物采食，使生长减慢^{[3, 10]}。上述研究提示，一定剂量单宁酸不会抑制甚至还可促进仔猪采食和生长，但过高剂量则抑制。单宁酸结构和分子质量等也是影响单宁酸作用效果的因素，缩合单宁的抗营养作用高于水解单宁^[19]。试验也表明，栗木单宁酸^[12]和鞣酸蛋白^[10]不影响仔猪采食，而本试验结果显示GTA促进了仔猪采食。即使同为GTA，因产地和提取方法等不同，其中没食子酸和鞣花酸含量、比例和与其相结合的葡萄糖棓酰基数^[20]会明显差别，意味着功能的差异^[11]。是否是因为产品来源、分子结构等原因差异造成有待于进一步探讨。单宁酸对单胃动物的促生长作用机制尚不清楚，可能是通过影响收敛、消炎抗菌、抗氧化、消化酶活性和肠道微生物区系等方式来实现^{[3, 6]}。

本试验结果表明，仔猪腹泻率、腹泻指数和粪中水分含量均随GTA添加量的提高而逐渐降低，添加抗生素也可降低腹泻率和腹泻指数，但降低幅度不如GTA，表明GTA控制仔猪腹泻的效果优于抗生素。400 mg/kg没食子酸(GTA主要成分)通过下调回肠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核因子受体-κβ(NF-κβ)和白细胞介素-6(IL-6)等炎症因子表达，提高仔猪肠道绒毛高度，维护肠道完整性，从而降低仔猪腹泻^[21]。Han等^[22]发现添加250 mg/kg葡萄籽原花青素可显著改善仔猪肠道结构，降低仔猪腹泻，增加仔猪ADG，与添加GTA的结果相似。Dong等^[23]研究还表明，单宁可以干扰细菌细胞壁的完整性，抑制病原微生物的繁殖，尤其是大肠杆菌^[24]。GTA本身具有较强的抗菌活性^[8]，而且它的加入容易与消化道黏液形成保护膜，降低胃肠机械性损伤，减少肿瘤坏死因子诱导的肠道上皮受损，改善肠道结构，降低仔猪腹泻，增加肠道对食糜中水分的吸收^[25-27]，对提高饲料利用率和生长性能具有重要的作用^{[12, 24]}。

3.2 GTA对断奶仔猪肠道消化酶活性和养分表观消化率的影响

仔猪采食饲粮后，通过口腔咀嚼和润湿作用，将食糜送入小肠，在消化系统中通过酶的高效催化作用，对养分进行消化和吸收^[28]。陈宝江等^[29]研究发现，适量的单宁酸可提高肉鸡肠道消化酶活性，并提出单宁对不同动物的影响存在显著差别。苏成文等^[11]报道，坚木单宁降低肉鸡肠道pH。刘华伟^[30]发现，添加栗树单宁增加了肉兔十二指肠胰蛋白酶活性，增加了十二指肠、空肠和回肠AMS活性，对LPS活性无显著影响。然而，本试验结果显示，GTA仅提高仔猪十二指肠胰蛋白酶活性，但对LPS和AMS活性均无显著影响。这可能是因为GTA促进胰腺分泌胰蛋白酶，提高胰蛋白酶活性^[30-31]。同时，胰蛋白酶与单宁结合的最适pH为7.5^[30]，十二指肠pH低于空肠和回肠^[32]，这种差异影响了单宁与酶的化学结合。此外，消化酶空间结构、单宁化学结构以及单宁与消化酶底物比也与酶的活性密切相关^[30]，但它们之间的相互关系仍有待研究。

本试验表明，添加不同剂量的GTA对钙表观消化率有增加的趋势，而对其他养分表观消化率无显著影响。然而，王亚等^[5]模拟生长猪胃-小肠仿生消化试验表明，饲粮中添加10和20 mg(约4和8 g/kg)单宁酸1后，消化0.5 h胃蛋白酶活性和胰蛋白酶活性得到显著提高，而添加10和20 mg(约3.7和7.4 g/kg)单宁酸2后，胃蛋白酶和胰蛋白酶活性却并未得到提高。GTA由没食子酸与葡萄糖结合而成，在酸性条件下不分解，在碱性条件下则分解成没食子酸与葡萄糖，没食子酸是强酸性物质，推测GTA降低了小肠食糜pH^[5]，增加养分溶解度，有提高钙吸收的趋势^[30]。也可能是因为GTA显著降低仔猪腹泻，延长钙离子在肠道中停留时间^[25]，增加机体肠道对钙的吸收，引起钙表观消化率的升高。潘发明等^[33]在饲粮中添加不同含量单宁对羯绵羊钙消化率无显著影响。造成这种差异的原因可能是试验动物不同。

4 结论

饲粮添加GTA促进仔猪采食，抑制仔猪腹泻，提高仔猪生长性能，增加肠道胰蛋白酶活性，且不降低养分消化吸收。断奶仔猪饲粮中GTA适宜添加量为1 700 mg/kg。