2. 临沂大学生命科学学院, 临沂 276005
2. College of Life Sciences, Linyi University, Linyi 276005, China
叶酸(folic acid, FA)也称蝶酰谷氨酸,是一种水溶性B族维生素,具有广泛的生物学功能。FA是机体细胞生长和繁殖所必需的物质,它对细胞的分裂生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成起着重要作用[1-3]。FA被动物小肠吸收后,通过二氢叶酸还原酶(dinhydrofolate reductase, DHFR)转化为四氢叶酸(tetrahydrofolate, THF),THF在氨基酸和核苷酸合成中作为一碳单位供体参与了关键的生物学反应[4-5]。甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)是DHFR有效抑制剂,使DHFR不能还原成为有生理活性的THF,细胞内有生物活性的还原型FA减少,而无活性的氧化型FA积累,导致DNA和RNA合成受到抑制[6-7]。动物胚胎期机体生长发育的状况对出生后生产性能等指标产生重要影响。鸡胚孵化过程与母体脱离,无法通过母体从外界获取营养物质,如果在这一时期出现营养物质不足,将会影响胚胎发育。通过胚蛋注射可以将外源物质注射到家禽胚蛋中,模拟外源性物质通过母体代谢在蛋中的沉积,为更好地研究胚期营养水平对出生后动物生长性状和繁殖性状的影响机理奠定基础。研究发现,怀孕小鼠FA缺乏可致后代血浆中同型半胱氨酸(homocystine, Hcy)含量升高,表现出短期的记忆损伤[8],并影响后代生长代谢相关基因的表达,通过母体补充FA可以缓解对这些基因表达的影响[9]。胚蛋注射FA可以提高肉鸡的生长性能和FA新陈代谢,并通过调节相关酶活性和基因表达增强雏鸡免疫功能[10-11],对肉鸡生长有一定的促进作用[11]。琅琊鸡是山东地方优良品种,其蛋素称“琅琊蛋”,以“红皮、黄大、质好”而驰名。尽管肉鸡胚蛋注射FA已有报道,但是琅琊鸡胚蛋注射MTX和FA尚未见报道。本研究以琅琊鸡为研究对象,旨在通过胚蛋注射MTX和FA,研究其对鸡胚孵化率以及雏鸡屠宰性能、血清生化指标和肝脏FA代谢相关基因表达的影响,为进一步研究琅琊鸡早期FA营养调控提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 种蛋的选择与孵化选用300枚琅琊鸡商品代种蛋(购于山东琅琊鸡种业有限公司),20 ℃小头向上保存3 d,各组种蛋重量无显著差异(P>0.05),符合蛋形和蛋壳质量的标准种蛋,随机分组。消毒后进行孵化试验,孵化前期(记为E1~10)控制温度在38.0~38.2 ℃,后期(记为E11~19)控制温度在37.8~38.0 ℃,整个孵化期相对湿度控制在45%~65%,翻蛋周期为120 min,翻蛋时间为180 s,孵化前期注意控温,孵化后期注意通风换气。
1.2 试验设计采用单因子完全随机试验设计,将孵化至第7天(E7)的鸡胚随机分为4组,每组5个重复,每重复15枚胚蛋。参考支丽慧等[12]的鸡胚FA注射剂量和我们前期MTX预试验结果,于卵黄囊(种蛋大头约1/3处)处进行以下处理:生理盐水组(作为对照组)每枚种蛋注射0.1 mL生理盐水,MTX组每枚种蛋注射0.1 mL MTX(5 μg)溶液,FA+MTX组每枚种蛋注射0.1 mL FA(90 μg)+MTX(5 μg)溶液,FA组每枚种蛋注射0.1 mL FA(90 μg)溶液。
1.3 样品采集和处理出雏后统计总出雏数,计算孵化率;从出壳第1天(D1)开始,每15 min观察1次,雏鸡从出壳开始禁食12 h后,每个组随机选择雏鸡10只,活体称重,每只鸡心脏采血0.1~1.0 mL,分别注入于已灭菌的EP管中,3 000 r/min离心10 min分离血清,置于-80 ℃冰箱保存备用。取血后雏鸡颈部脱臼致死,洗净沥干后进行屠宰性能测定,测定指标包括屠体重、半净膛重、全净膛重、心脏重量、肝重量、肌胃重量,计算屠宰率、半净膛率、全净膛率、心脏指数、肝脏指数、肌胃指数;同时立即采集部分肝脏,分别装入已标记好的1.5 mL RNase-Free离心管中,液氮速冻后-80 ℃冰箱保存备用。
1.4 指标检测方法 1.4.1 器官指数器官指数用下列公式计算:
利用ELx800TM酶标仪(BioTek公司),采用鸡专用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒分别检测血清中亚甲基四氢叶酸还原酶(methyenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)(Cat. No.:CK-E69224)、DHFR(Cat. No.:CK-E69222)活性和胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2, IGF2)(Cat. No.:CK-E63056)、FA(Cat. No.: CK-E60311)、Hcy(Cat. No.:CK-E60216)含量。指标检测所用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自上海裕平生物科技有限公司。
1.4.3 肝脏FA代谢相关基因表达量的测定 1.4.3.1 总RNA提取采用Trizol试剂盒(TIANGEN公司),参照Trizol试剂盒说明书提取总RNA。
1.4.3.2 cDNA反转录使用北京聚合美生物科技有限公司的M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover试剂盒,按说明书操作步骤进行mRNA反转录,合成cDNA。
1.4.3.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测目的基因表达水平根据鸡的目的基因及管家基因β-肌动蛋白(β-actin)mRNA序列用Primer Premier(6.25)设计引物,引物序列见表 1。
利用HieffTM qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)试剂盒(Yeasen公司)进行qRT-PCR扩增。qRT-PCR反应条件为:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性30 s,退火温度(表 1)退火30 s,72 ℃延伸1 s,40次循环。每个样本设3个重复,并设阴性对照,以β-actin为内参,采用2-ΔΔCt法计算目的基因的表达量。
1.5 数据统计与分析用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。试验结果的组间差异除孵化率采用卡方检验外,其他均采用单因素方差分析(one-way ANOVA),并用Duncan氏法进行多重比较,数据以“平均值±标准误”表示;目的基因的表达量与血清MTHFR、DHFR活性和IGF2含量采用Pearson’s进行相关性分析。P < 0.05和P < 0.01分别为显著和极显著水平。
2 结果 2.1 胚蛋注射MTX和FA对鸡胚孵化率以及雏鸡屠宰性能和器官指数的影响胚蛋注射MTX和FA对鸡胚孵化率、雏鸡屠宰性能影响的结果见表 2。卡方检验结果显示,胚蛋注射MTX显著降低了鸡胚孵化率(P < 0.05),注射FA+MTX和FA对鸡胚孵化率没有显著影响(P>0.05)。雏鸡屠宰性能以及雏鸡器官重量和器官指数各组之间差异均不显著(P>0.05)。
胚蛋注射MTX和FA对雏鸡血清生化指标影响的结果见表 3。与对照组相比,胚蛋注射MTX极显著降低了血清中FA含量(P < 0.01)并极显著增加了血清中Hcy的含量(P < 0.01);注射FA+MTX或FA极显著增加了血清中FA含量(P < 0.01);注射FA极显著降低了血清中Hcy含量(P < 0.01);注射MTX、FA+MTX和FA均极显著提高了血清中MTHFR活性(P < 0.01)。此外,MTX组血清中MTHFR活性显著高于FA+MTX组和FA组(P < 0.05),FA+MTX组和FA组之间差异不显著(P>0.05);MTX组、FA+MTX组和FA组血清中DHFR活性与IGF2含量均极显著高于对照组(P < 0.01),且各组之间差异均达到极显著水平(P < 0.01)。
以雏鸡肝脏组织cDNA为模板,以β-actin为内参基因,利用RT-qPCR检测雏鸡肝脏FA代谢相关基因的表达量,结果如表 4。与对照组相比,胚蛋注射FA极显著降低了MTHFR在肝脏中的表达量(P < 0.01),注射MTX或FA+MTX未显著影响MTHFR在肝脏中的表达量(P>0.05);注射MTX极显著增加了还原型叶酸载体(RFC)在肝脏中的表达量(P < 0.01),注射FA或FA+MTX未显著影响RFC在肝脏中的表达量(P>0.05)。胚蛋注射MTX或/和FA对DHFR、IGF2和质子耦合叶酸转运体(PCFT)在肝脏中的表达量未产生显著影响(P>0.05)。
胚蛋注射MTX和FA雏鸡FA代谢相关基因表达量与血清MTHFR、DHFR活性和IGF2含量的相关性见表 5。肝脏MTHFR表达量与血清MTHFR活性呈负相关,与血清DHFR活性和IGF2含量呈正相关;肝脏DHFR表达量与血清MTHFR、DHFR活性和IGF2含量均呈负相关;肝脏IGF2表达量与血清MTHFR、DHFR活性和IGF2含量均呈正相关,但以上相关性均未达到显著水平(P>0.05)。
目前,FA调控动物胚胎发育的研究多集中于哺乳动物的妊娠阶段,FA调控鸡胚发育的研究报道较少。Li等[10]和Liu等[14]报道,给11胚龄的鸡胚分别注射100和150 μg FA可显著提高种蛋孵化率;Nouri等[11]报道,7胚龄时注射40、80和120 μg FA并未对孵化率产生显著影响。本研究结果与Nouri等[11]报道一致。本研究表明,胚蛋注射MTX会造成胚期FA含量降低,导致鸡胚孵化率下降,说明较低的FA水平不利于鸡胚孵化。胚蛋注射FA对雏鸡生长性能和器官指数的影响也有报道。Liu等[14]认为肉鸡胚蛋注射150 μg FA显著提高了雏鸡出生重、肝脏和法氏囊器官指数,但对心脏和脾脏指数没有产生显著影响;支丽慧等[12]报道,肉鸡鸡胚注射90 μg FA显著提高了1日龄雏鸡的脾脏指数,但对21和42日龄脾脏指数均未产生显著影响。另外,也有研究显示肉鸡胚蛋注射FA使雏鸡日增重和体重增加,但是对雏鸡胴体性状和器官重量没有产生显著影响[10-11]。本研究中发现琅琊鸡胚蛋注射MTX和FA对屠宰性状和器官指数均未产生显著影响,与上述研究部分结果一致。由此可见,胚蛋注射FA的时间、剂量和鸡品种对鸡胚孵化率、雏鸡的生长性状和器官指数等造成不同的影响。所以,何时补充FA、补充多大剂量FA最有利于鸡胚发育,有待设置不同FA浓度梯度和注射胚龄、选择多个鸡品种对比进一步深入研究。
3.2 胚蛋注射MTX和FA对雏鸡血清生化指标的影响在胚胎发育期间,FA代谢最重要的反应是蛋氨酸和胸腺嘧啶的从头合成,DHFR是负责维持这2个途径所需的维生素还原状态的唯一酶[15]。MTX是FA代谢途径中DHFR的特异性抑制剂,它导致FA不能还原为THF,从而导致FA代谢障碍。Hcy是一种含硫氨酸,是蛋氨酸和半胱氨酸代谢的中间产物,而FA是机体Hcy代谢过程中的底物,其代谢产物THF参与了Hcy生成蛋氨酸的再甲基化反应,所以当机体FA缺乏时Hcy代谢受阻,导致Hcy含量升高[13, 16]。研究表明,怀孕小鼠注射MTX使血清中Hcy含量显著升高[17],关节炎病人注射MTX后血浆中FA含量显著降低[6]。在家禽上的研究也证明了FA可降低家禽血清中Hcy含量[13, 16, 18]。本研究结果表明, 鸡胚注射MTX显著降低了雏鸡血清中FA含量,升高了血清中Hcy含量;同时,胚蛋注射FA使雏鸡血清中FA含量增高,Hcy含量下降。总之,这些研究表明MTX通过抑制DHFR活性而引起细胞内叶酸多聚谷氨酸分布发生变化,使细胞处于FA耗竭和Hcy增多状态[6],而补充FA可以使这一状态缓解。
MTHFR是催化FA代谢及甲硫氨酸代谢通路的关键酶。孟苓凤等[18]研究发现,在饲粮中添加1、2 mg/kg FA显著提高了鹅血清中MTHFR活性,添加1 mg/kg FA显著降低了血清中DHFR活性;而本研究中胚蛋注射FA+MTX和FA均显著提高了雏鸡血清中MTHFR和DHFR活性,本课题组前期的研究也发现母鸡FA缺乏导致子代肉鸡血清中MTHFR、DHFR活性和IGF2含量升高[19],与本研究结果基本一致。然而,本研究中胚蛋注射MTX也增加了血清中MTHFR和DHFR活性,其机理有待进一步探讨。
3.3 胚蛋注射MTX和FA对雏鸡FA代谢相关基因表达的影响MTHFR可将5,10-亚甲基四氢叶酸还原为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸(5-MTHF),5-MTHF作为甲基供体为Hcy的代谢提供甲基,从而生成蛋氨酸,参与甲基化反应[20-21]。据报道,肉鸡鸡胚注射150 μg FA使1和42日龄雏鸡肝脏MTHFR表达量显著增高,50 μg FA使21日龄雏鸡肝脏MTHFR表达量最高,但在42日龄时100 μg FA使肝脏MTHFR表达量低于对照组和150 μg FA组[10]。本研究发现,90 μg FA显著降低了1日龄雏鸡肝脏MTHFR的表达量,而其他组与对照组间则不存在显著差异,与上述结果相反。在鹅上的研究发现MTHFR在肝脏中的表达量随着FA添加水平的上升呈现先上升后下降的趋势,当饲粮FA添加水平超过4 mg/kg时MTHFR表达量反而下降[18]。由此可见,MTHFR的表达量与家禽品种、FA添加水平、家禽生长阶段存在一定关系。在本试验中,肝脏MTHFR表达量与血清MTHFR活性呈负相关,孟苓凤等[18]也曾报道鹅育成期肝脏MTHFR表达量与血清MTHFR活性呈负相关,可能与动物器官组织代谢减缓,四氢叶酸需求量减少有关,具体调控机理有待进一步研究。
DHFR是利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)还原二氢叶酸产生四氢叶酸的氧化还原酶。它在核酸和氨基酸的生物合成中起着重要的辅助作用,在维持细胞内FA稳态方面起着关键作用,DHFR活性被MTX抑制导致细胞内叶酸盐的部分减少,进而限制了细胞的生长[22-23]。DHFR对维持足够的脑脊液和红细胞FA含量也是必要的[23]。本研究中尽管MTX降低了雏鸡肝脏DHFR的表达量,但差异不显著。
IGF2与胰岛素具有相似的结构,参与机体DNA和蛋白质合成,在体内葡萄糖和脂质代谢过程中均发挥重要作用。杨小军课题组系统地研究了鸡体内FA含量和IGF2基因表达与甲基化之间的关系,结果表明鸡胚注射不同浓度的FA对不同发育日龄的雏鸡的肝脏、胸腺和脾脏组织中IGF2基因的表达和甲基化产生不同的效应,认为FA可通过影响基因启动子区的甲基化水平和染色质构象来调控组织中IGF2的表达,并且存在组织器官和时间特异性[14, 24-25],本研究结果与上述研究结果基本一致。在人上的研究表明母体补充FA与婴儿IGF2基因甲基化较低有关[26],胎盘或脐带血中IGF2基因表达没有显著性差异[27]。但同时,也有研究表明,母体妊娠12周后补充FA与脐带血IGF2基因高甲基化水平相关,而在12周内补充FA则无显著影响[28]。补充FA对IGF2基因的表达调控存在不同影响,相关调控机理有待进一步研究。
叶酸受体、PCFT和RFC是3种已经发现的用于转运FA和FA拮抗剂的特殊转运载体,其中PCFT是小肠酸性pH环境下吸收FA的主要载体[29],RFC是哺乳动物细胞和组织中转运FA的主要转运载体[30]。此外,MTX和FA还可以通过胞饮进入细胞[31]。研究发现,FA吸收不良可能与结肠中PCFT和RFC表达下调有关[32]。据报道PCFT和RFC在蛋鸡肠道中的表达量不受FA添加量的影响[13, 33]。本研究发现MTX增加了RFC在雏鸡肝脏中的表达量,而FA降低了RFC在雏鸡肝脏中的表达量,但差异不显著。Gorlick等[34]曾报道RFC对还原型FA的亲和力相对较高,所以在恶性肿瘤中RFC是MTX的重要转运物质。这些研究提示FA调控PCFT和RFC的表达可能是通过转录机制实现的[13, 33, 35]。
4 结论① 胚蛋注射MTX能显著降低鸡胚孵化率,但对雏鸡屠宰性能和器官指数没有显著影响。
② 胚蛋注射MTX和FA对雏鸡血清叶酸代谢酶和Hcy有重要调控作用。
③ 胚蛋注射MTX能增加RFC在雏鸡肝脏中的表达,注射FA能降低MTHFR在雏鸡肝脏中的表达。
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