2. 上海海洋大学农业部鱼类营养与环境生态研究中心, 上海 201120;
3. 上海市农业科学院畜牧兽医研究所, 国家家禽工程技术研究中心, 上海 201106;
4. 上海市农业发展促进中心, 上海 200335
2. Centre for Research on Environmental Ecology and Fish Nutrition of the Ministry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201120, China;
3. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, National Poultry Engineer Research Center, Shanghai 201106, China;
4. Shanghai Agricultural Development Promotion Center, Shanghai 200335, China
鸡蛋暗斑是品牌鸡蛋的主要瑕疵之一，Chousalkar等[1]发现暗斑蛋的严重程度与沙门氏菌和大肠杆菌对蛋壳的渗透作用显著相关。暗斑不仅影响蛋壳美观和鸡蛋品质，还影响鸡蛋的食用安全[2-3]，解决鸡蛋暗斑问题能够提高特色鸡蛋的品牌影响力。近年来我国有关鸡蛋暗斑的研究已经取得重要进展，研究者系统比较了暗斑鸡蛋和非暗斑鸡蛋的差异[3-6]。超微结构显示，鸡蛋暗斑位置的栅栏层结构致密性低于无暗斑位置，疏松多孔，乳突层与栅栏层连接处垮塌较严重，与纤维层连接空隙较大；鸡蛋暗斑位置的壳下膜厚度较薄，网孔较大，石灰质硬蛋壳中的空隙被蛋内水分所填充，填充水的位置是暗斑。鸡蛋暗斑存在于蛋壳，且随着时间延长而增加[3-4, 7-8]。影响暗斑的因素很多，既有品种因素，也有营养、环境和鸡蛋保存方式等因素[8]。
唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)具有较强的抑菌作用[9-10]和免疫调控作用[10-12]。多数唾液乳杆菌能产生Ⅱa、Ⅱb和Ⅱd亚类未修饰细菌素[13]，其中Ⅱd类细菌素A(bactofencin A)是一种广谱细菌素，抑制竞争菌，促进类杆菌等厌氧菌群、梭状芽孢杆菌和双歧杆菌的分布[14]。唾液乳杆菌分泌的核糖体蛋白质对其他细菌也有抑制作用[15]。唾液乳杆菌能促进能量代谢，分泌胆盐水解酶(BSH)[16]。唾液乳杆菌饲喂仔猪时能显著提高其平均日增重、体重和增重[17]；唾液乳杆菌CI1、CI2和CI3能显著提高肉鸡的体重、增重和饲料效率，降低血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯含量[18]；唾液乳杆菌DSPV 001P能显著提高低温饲养条件下科宝肉鸡42日龄时的体重[19]。严华祥等[20]研究发现，肠道微生物对鸡蛋暗斑有较大影响，比较暗斑鸡蛋和非暗斑鸡蛋的母鸡肠道菌群，回肠中唾液乳杆菌分布差异极显著，但其机制还不清楚。本研究拟通过饲喂产暗斑鸡蛋母鸡不同水平唾液乳杆菌SNK-6，研究唾液乳杆菌SNK-6的效应浓度区间及其对肠道菌群分布的影响，为避免鸡蛋暗斑建立理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计于上海市营房蛋鸡场1栋新杨黑羽蛋鸡舍中选择连续4 d产暗斑鸡蛋的45周龄母鸡64只，单笼饲养，随机分成7个组，对照组(16只鸡)饲喂基础饲粮(水平1)，其他6组(每组8只鸡)饲喂唾液乳杆菌SNK-6活菌数量分别为1.0×106 CFU/只(水平2)、5.0×106 CFU/只(水平3)、2.5×107 CFU/只(水平4)、1.25×108 CFU/只(水平5)、6.25×108 CFU/只(水平6)和3.125×109 CFU/只(水平7)的试验饲粮。基础饲粮为上海市营房蛋鸡场为生产鸡群配制的粉状配合饲料，其组成及营养水平见表 1。试验期间自由采食，自由饮水。预试期1周，正试期4周。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
唾液乳杆菌SNK-6：上海市农业科学院畜牧兽医研究所保存，从新杨黑羽蛋鸡回肠肠道分离培养，保藏号CCTCC No.：M2018044。
1.3 鸡蛋暗斑检测 1.3.1 鸡蛋暗斑程度评价标准每天收集鸡蛋，贴标签记录鸡蛋编号，收集好的鸡蛋储存于室内阴凉处等待鸡蛋暗斑评价。根据暗斑的严重程度本研究将暗斑鸡蛋评分为0~5级。
0级：鸡蛋没有任何暗斑，在光源照射时，鸡蛋透光均匀，无任何透光点。刚产1 h内的鸡蛋为0级；鸡蛋继续放置后，外观依然如刚产的鸡蛋标记为0级暗斑鸡蛋。
1级：如果不通过光源照射较难观察到鸡蛋有暗斑点，在光源下可见零星的透光点。1级暗斑鸡蛋定义为非暗斑鸡蛋。
2级：鸡蛋有较多的直径较小的暗斑点，不通过光源照射仔细观察可以看到暗斑点，在光源照射时，透光小点遍布鸡蛋表面，但没有一般小透光点直径2~3倍以上光圈的透光点。
3级：鸡蛋有直径较大的零星暗斑点，无光源照射就可以较直观的观察到暗斑，在有光源照射时，除了有透光小点外，还有一般小透光点直径2~3倍以上光圈的零星的透光点。
4级：鸡蛋有较多直径较大的暗斑点，无光源照射就可以观察到，在有光源照射时除了有透光小点外，还有一般小透光点直径2~3倍以上光圈的透光点，鸡蛋四周暗斑点较多，但鸡蛋锐端位置没有或较少暗斑点。
5级：鸡蛋的暗斑较大且遍布鸡蛋大部分表面，锐端有较多较大暗斑点。
1.3.2 鸡蛋暗斑评价方法收集的鸡蛋放置2 d后，即所有鸡蛋产后48~60 h期间按上述鸡蛋暗斑程度评价标准评价鸡蛋暗斑，记录鸡蛋个体的暗斑评分。
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试验结束后，蛋鸡颈部放血致死，从腹部剪开皮肤和肌肉后，取出回肠和盲肠；并拢回肠和盲肠，从距离回盲点相同盲肠长度的位置剪断回肠，从空肠段挤出回肠内容物到2 mL冻存管中，至液氮罐中备存；从盲肠末梢剪开小口，挤出盲肠内容物到2 mL冻存管中，至液氮罐中备存；屠宰试验结束后，整理冻存管至-85 ℃超低温冰箱保存。委托上海派森诺生物科技股份有限公司进行宏基因组学检测分析；干冰专递内容物样品，Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit抽提回肠和盲肠内容物样品DNA，Picogreen荧光检测DNA样品纯度和浓度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段长度和完整性；等质量合并唾液乳杆菌SNK-6同一饲喂水平的合格DNA样品形成样品混池；基于Illumina NovaSeq高通量测序平台，采用全基因组鸟枪法(whole genome shotgun，WGS)策略，将提取混池总DNA随机打断为短片段，并构建合适长度的插入片段文库，对这些文库进行双端(paired-end，PE)测序；对高通量测序下机的双端序列原始数据进行质量筛查，获取可用于下游宏基因组学分析的高质量数据集；对每个样本的高质量序列分别进行宏基因组序列拼接组装，构建宏基因组Contigs和Scaffolds序列集，并进行基因预测，获得蛋白质序列集。
1.5 肠道微生物数据分析 1.5.1 肠道微生物物种分析Alpha多样性分析：度量指数主要包括Simpson指数、Chao1指数、ACE指数和Shannon指数。Simpson指数(https://www.mothur.org/wiki/Simpson)是评价菌群多样性的常用指数之一，Simpson指数值越高，表明菌群多样性越高。Shannon指数(https://www.mothur.org/wiki/Shannon)综合考虑了微生物的丰富度和均匀度。Chao1指数(Chao1 richness estimator，http://www.mothur.org/wiki/Chao)通过计数菌群中只检测到1次和2次的稀有物种(即“Singleton”和“Doubleton”)估计菌群中实际存在的物种数，估计物种丰富度指数。ACE指数(ACE richness estimator，http://www.mothur.org/wiki/Ace)的计算方法较复杂，默认将序列量10以下的物种都计算在内，从而估计菌群中实际存在的物种数，估计丰富度指数。
共有和独有物种类群分析：根据各样本(组)在各功能数据库中注释得到的种水平的组成谱，使用R软件计算它们共有类群的数量，并通过Venn图(https://en.wikipedia.org/wiki/Venn_diagram)直观地呈现各样本(组)所共有和独有的物种数量。
1.5.2 肠道微生物蛋白质功能注释每个样本选取不小于200 bp的Scaffolds/Scaftigs序列，采用专门用于预测原核微生物和宏基因组基因序列的MetaGeneMark(https://exon.gatech.edu/GeneMark/metagenome)[21]进行基因预测，并识别开放阅读框(open reading frame，ORF)，获得对应的蛋白质序列。将蛋白质序列集与常用蛋白质数据库比对，从而对各样本中的基因功能进行注释分析，包括EggNOG(evolutionary genealogy of genes: non-supervised orthologous groups)注释、CAZy(carbohydrate-active enzymes database)注释和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)注释。
EggNOG注释：EggNOG数据库(https://eggnog.embl.de/version_4.0.beta/，v4.0)由欧洲分子生物学实验室(European molecular biology laboratory，EMBL)管理，是利用Smith-Waterman比对算法对直系同源基因簇(orthologous groups of genes)进行功能注释。将蛋白质序列集与EggNOG数据库使用DIAMOND进行BLASTP比对，从每条序列的比对结果中筛选出E值最低(< 0.001)的蛋白质序列作为比对结果，同时分别计算目标序列和参考序列各自的比对覆盖率(BLAST coverage ratio，BCR，即序列匹配长度与序列全长的比值)，要求目标序列和参考序列的BCR均>40%，从而获得各蛋白质的功能注释信息，并对注释结果进行汇总统计，获取各等级的注释结果及对应的丰度(深度)信息。
CAZy注释：CAZy数据库聚焦于降解、修饰或生成糖苷键(glycosidic bond)的碳水化合物活性酶，是研究相关酶类的专业数据库。采用基于隐马尔科夫模型序列谱(profile hidden Markov models，profile HMMs)的HMMER3，将蛋白质序列集在dbCAN(database for automated carbohydrate-active enzyme annotation，http://csbl.bmb.uga.edu/dbCAN/)中搜索，从而获得碳水化合物活性酶的功能注释信息，并对注释结果进行汇总统计，获取各等级的注释结果及对应的丰度(深度)信息。
KEGG注释：KEGG数据库的核心是生物代谢通路分析数据库，将蛋白质序列集上传至KAAS(KEGG automatic annotation server，http://www.genome.jp/kaas-bin/kaas_main?prog=GHOSTX&way=s)进行功能注释，并对返回的注释结果进行汇总统计，获取各等级的注释结果及对应的丰度(深度)信息。
2 结果与分析 2.1 唾液乳杆菌SNK-6对鸡蛋暗斑的影响由图 1可知，饲喂唾液乳杆菌SNK-6后，鸡蛋暗斑的降低效果明显，较低唾液乳杆菌SNK-6水平组(水平2、3、4)的鸡蛋暗斑程度显著低于较高水平组(水平5、6、7)；饲喂水平4唾液乳杆菌SNK-6降低鸡蛋暗斑的效果最好，能最大程度减少鸡蛋暗斑，第4周鸡蛋暗斑等级都为0和1，鸡蛋暗斑率降为0。
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图 1 不同水平唾液乳杆菌SNK-6对鸡蛋暗斑的影响 Fig. 1 Effects of different levels of Lactobacillus salivarius SNK-6 on egg translucency |
微生物组学检测了对照、水平4和水平7组的回肠和盲肠菌群，在回肠中检测到12 808个微生物物种(图 2-A)，在盲肠中检测到23 140个微生物物种(图 2-B)，盲肠微生物物种数是回肠的1.8倍。
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A：回肠 ileum；B：盲肠 caecum。下图同 The same as below。 图 2 不同水平唾液乳杆菌SNK-6对蛋鸡肠道共有和独有物种类群的影响 Fig. 2 Effects of different levels of Lactobacillus salivarius SNK-6 on common and unique species in intestine of laying hens |
由图 2可知，蛋鸡采食唾液乳杆菌SNK-6后，肠道微生物物种数量发生了较大变化。水平4组有31.5%的回肠微生物物种与对照组不同，共有物种占2组物种总数的52.2%；有8.3%的盲肠微生物物种与对照组不同，共有物种占2组物种总数的80.9%。饲喂唾液乳杆菌SNK-6对蛋鸡回肠微生物分布的影响大于对盲肠的影响(32% vs. 8%)。蛋鸡采食不同水平唾液乳杆菌SNK-6，肠道微生物种类也会有较大变化，水平4和水平7组的共有物种占2组物种总数的53%，水平4组中有37.9%的物种在水平7组中缺失，水平7组中有22.2%的物种在水平4组中缺失。
2.2.2 唾液乳杆菌SNK-6对蛋鸡肠道微生物分布的影响由图 3可知，饲喂不同水平唾液乳杆菌SNK-6后，蛋鸡回肠微生物分布存在较大差异，而盲肠微生物分布差异较小。蛋鸡产蛋后期的肠道微生物主要有厚壁菌门、衣原体、变形菌门、放线菌门和类杆菌，其中厚壁菌门占微生物总数的40%以上。唾液乳杆菌SNK-6对厚壁菌门、衣原体、变形菌门和放线菌门有较大影响，而对类杆菌影响较小。
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图 3 不同水平唾液乳杆菌SNK-6对蛋鸡肠道门水平的宏基因组物种分类组成和丰度分布的影响 Fig. 3 Effects of different levels of Lactobacillus salivarius SNK-6 on species composition and abundance distribution of metagenome at intestinal hilus level of laying hens |
由表 2可知，饲喂唾液乳杆菌SNK-6改变了蛋鸡肠道微生物物种分布，对回肠微生物的影响较大，对盲肠微生物的影响较小；水平4组的回肠微生物物种分布Alpha多样性Simpson指数、Chao1指数、ACE指数和Shannon指数都大于对照组和水平7组，分别比对照组增加2.6%、6.7%、19.5%和20.6%；饲喂唾液乳杆菌SNK-6后较多地提高了回肠微生物稀有物种的含量。
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表 2 不同水平唾液乳杆菌SNK-6对蛋鸡肠道微生物物种分布Alpha多样性的影响 Table 2 Effects of different levels of Lactobacillus salivarius SNK-6 on species distribution Alpha diversity of intestinal microorganisms of laying hens |
由图 3可知，饲喂唾液乳杆菌SNK-6后增加了厚壁菌门的总量，且随着唾液乳杆菌SNK-6水平的增加回肠厚壁菌门的占有量提高；水平4组的回肠厚壁菌门比对照组增加了1.9%，水平7组比对照组增加了14.1%。饲喂唾液乳杆菌SNK-6后回肠中含量较多和变化较大的菌种是果囊乳杆菌(Lactobacillus ingluviei)和唾液乳杆菌。在对照组、水平4和水平7组的回肠果囊乳杆菌含量分别为0.65%、1.00%和3.70%，唾液乳杆菌含量分别为0.297%，1.007%和2.704%，水平4和水平7组的回肠唾液乳杆菌量分别比对照组提高了239%和810%。
由图 3可知，饲喂唾液乳杆菌SNK-6对肠道微生物影响最大的菌门是衣原体门，从对照组占微生物总量的40.0%下降到水平4组的20.2%；衣原体门中含量最多的2个菌种是流产衣原体(Chlamydia abortus)和鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)，在对照组分别占回肠微生物总量的27.2%和7.1%，饲喂水平4的唾液乳杆菌SNK-6后，流产衣原体和鹦鹉热衣原体分别占回肠微生物总量的13.3%和3.7%，下降了约50%。
由图 3和表 3可知，饲喂唾液乳杆菌SNK-6改变了变形菌门在肠道中的分布，与对照组相比，水平4组的回肠内容物变形菌门细菌数增加了200%，水平7组的变形菌门细菌数降低了27.8%。唾液乳杆菌SNK-6对变形菌门的影响主要体现在γ-变形菌纲和ε-变形菌纲，水平4组回肠内容物的γ-变形菌纲和ε-变形菌纲细菌数分别比对照组提高了270%和84%，水平7组比对照组分别降低了25%和29%。尽管饲喂水平4唾液乳杆菌SNK-6导致变形菌总量上升，但是一些条件性人禽共患致病菌如肠炎沙门氏菌、大肠杆菌和空肠弯曲杆菌的数量在水平4和水平7时都是下降的，其中饲喂水平4唾液乳杆菌SNK-6后回肠内容物大肠杆菌数降低28.2%，盲肠内容物大肠杆菌数降低39.5%，下降幅度较大。
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表 3 不同水平唾液乳杆菌SNK-6对蛋鸡人禽共患致病菌数的影响 Table 3 Effects of different levels of Lactobacillus salivarius SNK-6 on number of human avian co morbidity pathogenic bacteria of laying hens |
由图 4可知，在蛋鸡回肠和盲肠中分别获得12 469和37 776个微生物EggNOG注释蛋白质；饲喂不同水平唾液乳杆菌SNK-6回肠和盲肠中共有EggNOG注释蛋白质数分别占总EggNOG蛋白质数的42.9%和65.9%；回肠微生物EggNOG注释蛋白质数在组间差异较大，对照组、水平4和水平7组分别有EggNOG注释蛋白质8 595、9 652和7 480个，水平4回肠微生物EggNOG注释蛋白质比对照组多12.3%。
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图 4 不同水平唾液乳杆菌SNK-6对蛋鸡肠道微生物EggNOG注释蛋白数的影响 Fig. 4 Effects of different levels of Lactobacillus salivarius SNK-6 on number of EggNOG annotation proteins of intestinal microorganisms of laying hens |
由表 4可知，检索EggNOG数据库，获得25类信息中的23类同源基因注释蛋白质信息；唾液乳杆菌SNK-6水平越高，获得肠道微生物EggNOG注释信息量越大，饲喂水平4和水平7唾液乳杆菌SNK-6蛋鸡的回肠微生物EggNOG注释信息量分别是对照组的130%和156%，其中代谢功能注释分别是对照组的131%和171%；饲喂水平4唾液乳杆菌SNK-6回肠微生物EggNOG注释信息量超过对照组131%以上的有6个大类，分别是复制重组和修复(replication, recombination and repair)、细胞壁/膜/包膜生物合成(cell wall/membrane/envelope biogenesis)、防御机制(defense mechanisms)、能量生产和转换(energy production and conversion)、氨基酸转运与代谢(amino acid transport and metabolism)和碳水化合物转运与代谢(carbohydrate transport and metabolis)，水平4分别为对照组的153%、144%、138%、140%、139%和134%。
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表 4 不同水平唾液乳杆菌SNK-6对蛋鸡肠道微生物EggNOG注释蛋白质功能的影响 Table 4 Effects of different levels of Lactobacillus salivarius SNK-6 on function of EggNOG annotation protein of intestinal microorganisms of laying hens |
由图 5可知，在蛋鸡回肠和盲肠中分别获得246和306个CAZy注释蛋白质，3组共有CAZy注释蛋白质分别占CAZy注释蛋白质总数的74.4%和84.5%。
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图 5 不同水平唾液乳杆菌SNK-6对蛋鸡肠道微生物CAZy注释蛋白质数量的影响 Fig. 5 Effects of different levels of Lactobacillus salivarius SNK-6 on number of CAZy annotation protein of intestinal microorganisms of laying hens |
由表 5可知，尽管回肠差异蛋白质数为15%，但水平4和水平7组的CAZy注释功能信息量分别为对照组的139%和166%，其中水平4的碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases，CEs)、辅助活动(auxiliary activities，AAs)、糖基转移酶(glycosyl transferases，GTs)和多糖裂解酶(polysaccharide lyases，PLs)分别达对照组的140%、154%、159%和402%；糖基转移酶是CAZy注释最多的蛋白质，其中糖基转移酶47是水平4回肠微生物表达较高的酶，且水平4的表达量为对照组的1 120%(4 022.6/359.3)，为水平7的510%(4 022.6/791.1)。
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表 5 不同水平唾液乳杆菌SNK-6对蛋鸡肠道微生物CAZy注释蛋白质功能的影响 Table 5 Effects of different levels of Lactobacillus salivarius SNK-6 on function of CAZy annotation protein of intestinal microorganisms of laying hens |
由图 6可知，在蛋鸡回肠和盲肠中分别注释到8 256和6 679个KEGG蛋白质，3组共有KEGG注释蛋白质分别占KEGG注释蛋白质总数的54.1%和68.7%；回肠水平4和水平7组分别有20.2%和14.3%的KEGG注释蛋白质与对照组不同，盲肠分别有8.6%和13.3%与对照组不同。
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图 6 不同水平唾液乳杆菌SNK-6对蛋鸡肠道微生物KEGG注释蛋白质数量的影响 Fig. 6 Effects of different levels of Lactobacillus salivarius SNK-6 on number of KEGG annotation protein of intestinal microorganisms of laying hens |
由表 6可知，饲喂唾液乳杆菌SNK-6影响蛋鸡肠道微生物KEGG注释蛋白质功能，回肠水平4的组织系统(organismal systems)、人类疾病(human diseases)和细胞过程(cellular processes)分别为对照组的72.4%、81.6%和82.5%，而代谢(metabolism)和其他路径或分类(not included in pathway or brite)分别为对照组的124.7%和125.9%。
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表 6 不同水平唾液乳杆菌SNK-6对蛋鸡肠道微生物KEGG注释蛋白质功能的影响 Table 6 Effects of different levels of Lactobacillus salivarius SNK-6 on function of KEGG annotation protein of intestinal microorganisms of laying hens |
综合已有研究结果，鸡蛋暗斑产生在蛋壳栅栏层致密性较差、蛋壳水分含量较高的位置[3, 6]，显然这些位置的化合物成分发生了变化。致密性与蛋壳的矿物质和有机质密度相关，蛋壳含水量与蛋壳有机质的亲水性相关。影响蛋壳暗斑的外在因素主要包括营养、疾病和鸡蛋保鲜，其中营养和疾病影响蛋壳矿物质和有机质的组成，鸡蛋保鲜影响蛋壳有机质的含水量。唾液乳杆菌SNK-6对蛋鸡营养吸收的影响不仅是自身菌株的作用，更重要的是通过影响肠道生态结构，微生态上调营养代谢通路。饲喂水平4和水平7唾液乳杆菌SNK-6的蛋鸡回肠宏基因组EggNOG注释代谢功能每一大类都高于对照组，总体代谢功能信息分别是对照组的131%和171%，CAZy注释的各类酶和KEGG注释的代谢途径也各约为对照组的130%和170%。肠道微生物代谢产物进入体液参与蛋壳的组分或调控蛋壳成分的代谢和沉积，至少应含2类相关物质，一类是有机物代谢，另一类是矿物质代谢。肠道微生物在其中如何发挥作用还有待进一步研究。
本研究显示，饲喂唾液乳杆菌SNK-6产生降低鸡蛋暗斑的效应需要适宜的活菌水平，超过效应活菌数后降低鸡蛋暗斑的效率下降，甚至不能降低鸡蛋暗斑。不同水平唾液乳杆菌SNK-6的肠道菌群分布差异较大，水平4的微生物种类比对照和水平7较多，水平4有2 560个物种是对照和水平7缺乏的。水平4独有的某些物种可能是影响鸡蛋暗斑的关键物种，这些物种种类及其属性、唾液乳杆菌SNK-6与这些物种的协同作用及其对暗斑形成的影响还有待进一步研究。
研究证明，暗斑鸡蛋蛋壳微生物的增长显著快于非暗斑鸡蛋[2, 3]，沙门氏菌更容易从蛋壳进入蛋内[1]，但没有直接证据说明病菌如何影响鸡蛋暗斑的产生。鸡蛋品质与母鸡健康直接相关，鸡的肝肾功能影响钙磷代谢，影响蛋壳质量，提高鸡的肝肾等组织器官的健康水平是降低鸡蛋暗斑的基础。本研究充分展示了唾液乳杆菌SNK-6抑制疫病的能力，不仅降低肠道中人禽共患病大肠杆菌数28%、空肠弯曲杆菌数24%，还降低KEGG注释蛋白质疫病功能通路约20%(人类疾病：水平4/对照=37 135/45 503)，提高EggNOG防御机制约40%(防御机制：水平4/对照=5 424/3 922)。疫病对鸡蛋暗斑形成的机制涉及2个方面有待研究：一方面是鸡蛋产出后蛋壳表面的微生物种类和分布，哪些微生物导致鸡蛋产生暗斑；另一方面是蛋壳抗菌物质的种类和含量，哪些抗菌物质产生暗斑。唾液乳杆菌SNK-6是否改变了鸡蛋蛋壳微生物，是否改变了蛋壳表面的抗菌物质还有待进一步研究。
3.2 饲养环境对蛋鸡肠道微生物种类和分布的影响本研究前期曾开展了新杨黑羽蛋鸡45周龄肠道菌群研究[22]和55周龄肠道菌群研究[23]，其中45周龄鸡群饲养于上海某祖代种鸡场，饲喂种鸡粉状饲料，55周龄鸡群饲养于安徽农业科学院试验鸡场，饲喂商品鸡颗粒饲料。3次肠道菌群检测都委托同一家公司进行DNA抽提和序列分析。3次肠道菌群门水平各主要菌门的种类和分布如表 7。本研究对照组回肠有43.8%衣原体门细菌，而在前期新杨黑羽蛋鸡肠道菌群研究中回肠仅有0.006%的衣原体门细菌。低丰度的细菌分布也存在差异，如前期研究中蓝藻门细菌含量为0.1%，而本研究含量为0.01%(对照和水平7)和0.05%(水平4)。盲肠菌群也存在较大差异，本研究盲肠厚壁菌门细菌较少，而拟杆菌门和变形菌门细菌较多。肠道菌群的种类和分布受环境影响较大，有利于建立以益生菌为主的生态饲养环境，提高蛋鸡生产性能，改善鸡蛋品质。
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表 7 不同来源新杨黑羽蛋鸡肠道细菌主要门类和分布 Table 7 Main phylums and distribution of intestinal bacteria of Xinyang blacK-feathered laying hens from different sources |
① 饲喂2.5×107 CFU/只唾液乳杆菌SNK-6可显著降低鸡蛋暗斑。
② 饲喂唾液乳杆菌SNK-6可改变蛋鸡回肠和盲肠的微生物种类和分布，提高厚壁菌门菌群的种类和分布，降低大肠杆菌和空肠弯曲杆菌数。
③ 饲喂唾液乳杆菌SNK-6后蛋鸡肠道微生物蛋白质种类和丰度差异较大，预测饲喂唾液乳杆菌SNK-6能提高核酸代谢、能量代谢和防疫机制，减少疫病通路。
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