2. 山西祥和岭上农牧开发有限公司, 右玉 037200;
3. 山西安弘检测技术有限公司, 太原 030008
2. Shanxi Xianghelingshang Farm Animal Husbandry Development Co., Ltd., Youyu 037200, China;
3. Shanxi Anhong Testing Technology Co., Ltd., Taiyuan 030008, China
微生态制剂作为一种新型的绿色添加剂，近年来在动物生产上的应用越来越广泛，且生产效益显著，主要分为乳酸菌类微生态制剂、芽孢杆菌类微生态制剂、酵母菌类微生态制剂、光合细菌类微生态制剂及复合微生态制剂等[1]。酿酒酵母和地衣芽孢杆菌是较为常用的微生态制剂，具有提高营养物质利用率、改善瘤胃发酵、增强免疫力、提高反刍动物生长性能等作用[2-4]，但二者组合应用对反刍动物生长性能、营养物质消化代谢及能量代谢方面的研究甚少，仍需进一步探索。因此，本试验通过在饲粮中添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌探究其对绵羊生长性能、营养物质消化代谢及能量代谢的影响作用，旨在为酿酒酵母和地衣芽孢杆菌在肉羊饲粮中的合理添加提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验时间及地点试验于2018年1月1日至3月23日在山西省晋中市太谷县山西农业大学牧站进行。
1.2 试验设计及饲粮采用完全随机分组试验设计，选用4月龄、体重[(22.96±2.00) kg]相近、健康的杜泊×小尾寒羊杂交F1代公羔48只，随机分为4组：D组(对照组，饲喂基础饲粮)、D1组(在基础饲粮中添加6×1010 CFU/kg酿酒酵母)、D2组(在基础饲粮中添加2×1010 CFU/kg地衣芽孢杆菌)、D3组(在基础饲粮中添加6×1010 CFU/kg酿酒酵母+2×1010 CFU/kg地衣芽孢杆菌)，每组12只。酿酒酵母购买于安琪酵母股份有限公司，为颗粒状制剂，实测活菌数为2×1010 CFU/g；地衣芽孢杆菌购于天津坤禾生物科技集团股份有限公司，为粉状制剂，实测活菌数为2×1010 CFU/g。基础饲粮参考NRC(2007)[5]绵羊营养需要中体重20 kg、日增重300 g公羔的营养需要配制，精粗比为60 : 40，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
试验羊舍为封闭式圈舍。试验开始前用消毒液对羊舍的地面、羊栏、食槽等喷洒消毒。所有试验羊经检疫驱虫后，打好耳标。试验羊均单栏饲养，每天分别于08:00和18:00进行饲喂，自由采食和饮水。预试期15 d，正试期60 d。
1.4 生长性能的测定正试期内每天准确称量记录每只试验羊的喂料量和剩料量，计算平均日采食重[ADFI，非干物质(DM)基础]。在正试期第1、30、60天晨饲前对试验羊进行称重，计算平均日增重(ADG)。根据ADFI和ADG计算料重比(F/G)。
1.5 样品采集与处理正试期结束后，采用全收粪收尿法，将所有试验羊置于自制消化代谢笼中饲养，预试期4 d，试验期3 d。
1.5.1 粪样的收集晨饲前收集每只羊24 h所排全部粪便，并称重记录。连续收集3 d，按排粪量的10%四分法取样，记录粪样重。一部分粪样加入10%的硫酸(每100 g粪样加10 mL 10%的H2SO4)固氮，充分混匀后置于-20 ℃保存，用于测定蛋白质含量；一部分粪样直接置于-20 ℃保存，用于测定其他常规营养物质含量和粪能。
1.5.2 尿样的收集于采样前1天向每只尿桶中加入100 mL 10%的硫酸固氮，晨饲前收集每只羊24 h所排全部尿液，用量筒量其体积并记录。将尿样摇匀后，经4层纱布过滤，按1/10取样，连续收集3 d，将样品充分混匀后置于-20 ℃保存，用于测定尿氮、尿酸、尿囊素、黄嘌呤、次黄嘌呤含量和尿能。
1.6 样品测定 1.6.1 饲粮常规营养物质含量的测定参考AOAC(2000)[6]方法测定饲粮的DM、粗灰分(Ash)、粗脂肪(EE)和粗蛋白质(CP)含量；参考Van Soest等[7]方法测定饲粮的中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量；采用原子吸收分光光度计法[8]测定饲粮中钙(Ca)含量；采用钒钼黄比色法[9]测定饲粮中磷(P)含量。
1.6.2 营养物质表观消化率的测定将粪样置于恒温鼓风干燥箱中，65 ℃烘干48 h，回潮24 h后称重，计算得出初水分含量。粉碎过40目筛后用于测定营养成分含量(同1.6.1)。参考杨胜[10]的方法测定饲粮、粪样和尿样中的氮含量。相关计算公式如下：
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饲粮、粪样和尿样的总能用氧弹量热仪(TJHY-5000，天健电子科技有限公司)测定。对于饲粮和粪样能量的测定，取5张称量纸称重后分别测定能值，计算出称量纸的平均能值，称取0.9~1.1 g(精准到0.000 2 g)的待测样品，再用称量纸包紧放于燃烧皿中(由于样品较轻，燃烧时易于飞溅)测定能值，减去称量纸能值即可得到待测样品的能值。对于尿能的测定，取5张定量滤纸称重后分别测定能值，计算出滤纸的平均能值，将1 mL尿液滴在滤纸上，65 ℃烘干后测定能值，减去滤纸能值即可得到尿能。
甲烷产量使用MA-10甲烷分析仪(Sable Systems International，亨德森，美国)测定。将试验羊的头部固定在小型反刍动物专用的聚碳酸酯头箱中，每日正常饲喂后密封头箱，适应24 h后，进行24 h实时测定。利用标准气将MA-10甲烷分析仪校准后，通过Sable开路式呼吸测热系统采集并计算数据，即得到甲烷产量。相关计算公式如下：
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参考Chen等[12]方法，利用紫外分光光度计(UV-1800PC，上海美谱达仪器有限公司)测定黄嘌呤、次黄嘌呤和尿囊素含量，利用酶标仪测定尿酸含量，根据尿嘌呤衍生物(PD)含量计算MCP含量。计算公式如下：
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数据用Excel 2010进行初步整理，采用SPSS 22.0进行单因素方差分析，当差异显著时用Duncan氏法进行多重比较，以P < 0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对绵羊生长性能的影响由表 2可知，添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对试验羊的终末体重及平均日采食量的影响均不显著(P>0.05)。D3组的ADG显著高于D组(P < 0.05)。与D组相比，D1、D2和D3组的F/G分别显著降低了9.87%、9.12%和31.14%(P < 0.05)，但D1和D2组之间差异不显著(P>0.05)。
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表 2 添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对绵羊生长性能的影响 Table 2 Effects of supplement of Saccharomy cescerevisiae and Bacillus licheniformis on growth performance of sheep (n=12) |
由表 3可知，D3组的DM、OM、NDF和ADF表观消化率显著高于D组(P < 0.05)，分别提高了9.64%、8.86%、9.27%和3.47%，但D1和D2组之间均差异不显著(P>0.05)。
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表 3 添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对绵羊营养物质表观消化率的影响 Table 3 Effects of supplement of Saccharomyces cerevisiae and Bacillus licheniformis on nutrient apparent digestibility of sheep (n=12) |
由表 4可知，饲粮中添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对摄入氮、粪氮和尿氮的影响不显著(P>0.05)，对氮表观消化率、沉积氮和氮沉积率影响显著(P < 0.05)。D3组的氮表观消化率、沉积氮和氮沉积率与D组相比分别显著提高了12.04%、41.39%和40.95%(P < 0.05)，D1和D2组之间均差异不显著(P>0.05)。
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表 4 添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对绵羊氮消化代谢的影响 Table 4 Effects of supplement of Saccharomyces cerevisiae and Bacillus licheniformis on nitrogen digestion and metabolism of sheep (n=12) |
由表 5可知，饲粮中添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对尿酸含量没有显著影响(P>0.05)，但对尿囊素、黄嘌呤和次黄嘌呤、总尿嘌呤衍生物和MCP含量的影响显著(P < 0.05)。D1、D2和D3组的尿囊素、黄嘌呤和次黄嘌呤和MCP含量均显著高于D组(P < 0.05)。D3组总尿嘌呤衍生物含量显著高于D组(P < 0.05)，但与D2和D3组之间差异不显著(P>0.05)。
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表 5 添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对绵羊尿嘌呤衍生物和MCP含量的影响 Table 5 Effects of supplement of Saccharomy cescerevisiae and Bacillus licheniformis on urinary purine derivatives and MCP content of sheep (n=12) |
由表 6可知，饲粮中添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对摄入总能、表观消化能和总能表观消化率的影响均不显著(P>0.05)，对粪能、尿能和甲烷能影响显著(P < 0.05)。D组的粪能和尿能均显著高于其他3组(P < 0.05)，D组的甲烷能显著高于D3组(P < 0.05)。
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表 6 添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对绵羊能量代谢的影响 Table 6 Effects of supplement of Saccharomyces cerevisiae and Bacillus licheniformis on energy metabolism of sheep (n=12) |
前人研究表明，益生菌对动物机体消化道微生物及其功能有改善作用，可以促进小肠发育，有利于维持幼龄反刍动物小肠绒毛形态结构完整，并且酵母菌和芽孢杆菌在反刍动物消化道内可代谢产生多种酶类和非特异性免疫调节因子[13-15]，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和B族维生素等，还可以增加瘤胃蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的活性[16]，这些物质能降解饲料中的碳水化合物，促进纤维素的消化，提高动物对饲料的利用率，从而促进机体对营养物质的消化吸收[17]，提高动物的生长速度。另有报道表明，益生菌可以提高奶牛血清总抗氧化能力，降低丙二醛含量，增加机体抗应激能力[18]，从而减少机体因应激而产生的损耗。因此，本试验中饲粮中添加不同益生菌可能改善机体的消化机能和健康状况，对绵羊的生长均产生了积极的影响。
杨春涛等[19]研究证明，饲粮中添加地衣芽孢杆菌及其复合菌可以提高断奶应激条件下犊牛瘤胃pH的稳定性，改善瘤胃发酵状况，丰富瘤胃纤维分解菌种类并增加瘤胃内优势菌群数量，因此促进营养物质在瘤胃内的降解和利用。Masuccli等[20]研究表明，饲粮中添加酿酒酵母或地衣芽孢杆菌可以提高犊牛的生长性能和营养物质消化率。DM、OM、NDF和ADF消化率是衡量动物对饲粮消化利用程度的重要指标[21]。本试验中同时添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌使得DM、NDF、ADF和OM表观消化率均高于对照组，且对试验动物的ADG和F/G效果最佳，说明2种益生菌能提高营养物质利用率，最终起到促进动物生长的作用。从生长性能来看，组合饲喂具有协同作用，且效果最佳。但也有报道提出饲喂酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对生长性能没有显著的改善作用[22-24]，可能是因为添加水平、试验环境、试验动物或者试验饲粮组成等因素造成的。
反刍动物的代谢蛋白质主要由小肠可吸收饲粮蛋白质和小肠可吸收MCP组成。瘤胃微生物利用饲粮中的碳水化合物和含氮物质的降解产物合成MCP，MCP中75%~85%的氮以蛋白质、肽或游离氨基酸形式存在，15%~25%的氮存在于核酸中，核酸被降解形成的嘌呤进入小肠黏膜，最终以嘌呤衍生物的形式从尿中排出，因此通常利用尿嘌呤衍生物的含量间接推算MCP合成量[25-26]。本试验中，添加酿酒酵母组和地衣芽孢杆菌组的氮表观消化率、氮沉积率和MCP含量均高于对照组，可能是酿酒酵母促进瘤胃微生物的生长和繁殖，使其对氮的利用率提高，通过肝脏转变为尿素的量减少，排出的粪氮浓度降低，这与前人的研究结果[27-28]相似；并且地衣芽孢杆菌在胃肠道定植后具有一定的固氮能力[29]，可以提高含氮物质的利用率，从而提高MCP的合成及减少粪氮尿氮的排出。2种益生菌同时添加的效果均好于单独添加，说明二者之间具有协同效应，但具体的互相作用机制还需进一步探究。
有研究表明，反刍动物在消化过程中，总能摄入量的增加可能会导致粪能的相应增加。饲粮在瘤胃中发酵产生大量的甲烷(CH4)，从而造成饲粮总能损失2%~15%[30]。本试验中，添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对表观消化能和总能表观消化率均没有显著影响，虽然总能摄入量差异不显著，但是对照组的粪能和尿能的排出量显著高于试验组，说明添加益生菌对能量的利用产生了积极作用。添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌降低了甲烷能可能是因为酿酒酵母可以刺激乙酸生成菌对氢的利用[31]，从而减少CH4的排放；地衣芽孢杆菌在一定条件下可以产生脂肽类、磷脂类、多烯类和氨基酸类等多种抗生素[32]，减少甲烷菌和产氢菌的数量，提高动物机体的抵抗力，从而促进机体的新陈代谢，减少CH4的合成和对环境的应激[33]，所以提高了能量利用率。二者共同作用相比较于单独添加能够更有效地提高能量利用率，减少甲烷能、粪能和尿能，说明益生菌复合应用后在动物消化道内表现为协同效应。本试验虽然证明酿酒酵母和地衣芽孢杆菌可以提高绵羊对饲粮中营养物质和能量的利用率，但其详细具体的作用机理仍需要进一步研究。
本试验购买的酿酒酵母为45元/kg，地衣芽孢杆菌为25元/kg，试验中的添加剂量分别为3和1 g/kg饲粮。根据育肥出栏羊现行价格每kg活重28元，试验天数为60 d，每只羊平均采食量为1.77 kg/d计算，对照组的每只试验羊增加的出栏活重价值为471.24元。仅饲喂酿酒酵母组和仅饲喂地衣芽孢杆菌组的每只试验羊增加的出栏活重价格分别为498.96和485.52元，同对照组相比分别增加了27.72和14.28元，增加的投入分别为14.34和2.66元，投入产出比(增加的出栏活重价值/增加的投入)分别为1.93和5.38。同时添加2种菌的试验组，每只试验羊增加的出栏活重价格为567.28元，同对照组相比增加了96.04元，增加的投入为16.99元，投入产出比为5.68。本试验中，同时添加2种菌的试验组的投入产出比最高，经济效果最好。
4 结论饲粮中单独添加6×1010 CFU/kg酿酒酵母和2×1010 CFU/kg地衣芽孢杆菌可以对营养物质消化代谢和能量代谢产生积极影响，提高营养物质和能量的利用率，促进动物消化吸收，从而改善绵羊的生长性能。在本试验中酿酒酵母(6×1010 CFU/kg)+地衣芽孢杆菌(2×1010 CFU/kg)组合饲喂效果更加显著。
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