2. 青岛农业大学动物科技学院, 青岛 266109
2. College of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China
霉菌毒素能够影响动物健康、降低免疫力，导致动物产品质量下降，给畜牧业生产带来损失。饲料中的霉菌毒素如黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)、玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)、伏马毒素B1(fumonisin B1, FB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)等能够影响动物健康、降低免疫力，导致动物产品质量下降，给畜牧业生产带来损失[1-4]。因此，控制饲料中霉菌毒素显得至关重要。
蒙脱石(montmorillonite, MMT)因为其独特的分子结构，具有良好的吸附特性，作为霉菌毒素吸附剂广泛应用于饲料生产中。MMT由上层氧硅四面体、中间氧铝八面体片、下层氧硅四面体的2 : 1型层状结构构成，这就出现了层间域，它使得MMT多了内表面积，同时表面分布众多的孔洞，增强了吸附能力[5]。此外，MMT层间中心离子铝被锌、镁等代替或者是硅氧四面体中硅被铝所替换而出现了大小不同的永久性负电荷，进而离子发生交换，从而获得静电吸附能力[5]。但是，MMT对极性比较弱的霉菌毒素(如DON)吸附效果比较差。可通过改性剂对MMT改性来提高MMT的吸附能力，增强其对霉菌毒素的吸附效果，尤其是吸附弱极性的霉菌毒素的能力，目前主要采用有机、无机和复合3种改性方法。MMT通过季铵盐等有机改性剂处理之后，增大了层间距，与原来相比获得了更多的比表面积，使得吸附能力增强[6]。研究表明，用十二烷基三甲基溴化铵(N, N, N-trimethyl-1-dodecanaminium bromide, DTAB)、十八烷基二甲基苄基氯化铵(octadearyl dimethyl benzyl ammonium chloride, SKC)以及十八烷基三甲基氯化铵(octadearyl dimethyl ammonium chloride, STAC)等季铵盐改性MMT，能够提高对霉菌毒素的吸附效果[7-8]。前人有关改性MMT的研究多是关于改性剂浓度的筛选，而对于反应时间、反应温度和pH的筛选的研究较缺乏，具体制备工艺的研究也较少；对于常见的AFB1、ZEN、DON的吸附效果的研究较多，对FB1的吸附效果的研究较少。因此，本试验拟筛选出十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)改性MMT的最佳改性条件，对CTAB改性MMT(CTAB-MMT)进行结构表征，并通过体外吸附确定CTAB-MMT对AFB1、ZEN、DON以及FB1的吸附效果，以提高MMT对弱极性霉菌毒素的吸附效果，为CTAB-MMT霉菌毒素吸附剂的开发利用提供理论支持。
1 材料与方法 1.1 药品与试剂钙基蒙脱石(Ca-MMT，山东西亚化工有限公司产品)，钠基蒙脱石(Na-MMT，动物营养代谢病与中毒病研究室制备)，CTAB(国药集团化学试剂有限公司产品)，AFB1、DON、ZEN、FB1标准品(青岛普瑞邦生物工程有限公司产品)。
1.2 仪器设备X射线多晶衍射(XRD)仪(德国布鲁克AXS有限公司)、JEOL-7500F扫描电子显微镜(SEM)(日本日立电子公司)、FTIR-8400傅里叶变换红外光谱(FTIR)仪(日本岛津制作所)。
1.3 CTAB-MMT制备工艺的优化 1.3.1 CTAB浓度的筛选试验取30 mL蒸馏水加入3 g Na-MMT，再分别加入50 mL浓度为1.2%、1.8%、2.4%、3.0%、3.6%的CTAB溶液，制成悬浮液，调节pH为7。在50 ℃条件下反应2 h后分别用蒸馏水、乙醇洗涤，4 000 r/min离心10 min，75 ℃烘干，研磨备用。
1.3.2 反应温度的筛选试验取30 mL蒸馏水加入3 g Na-MMT，再加入1.8%的CTAB溶液50 mL，制成悬浮液，调节pH为7，分别在40、50、60、70、80 ℃下反应2 h。其他处理同1.3.1。
1.3.3 反应时间的筛选试验取30 mL蒸馏水加入3 g Na-MMT，再加入1.8%的CTAB溶液50 mL，制成悬浮液，调节pH为7，50 ℃条件下分别反应0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h。其他处理同1.3.1。
1.3.4 pH的筛选试验取30 mL蒸馏水加入3 g Na-MMT，再加入1.8%的CTAB溶液50 mL，制成悬浮液，分别调pH为7、8、9、10、11，在50 ℃条件下反应2 h。其他处理同1.3.1。
1.3.5 正交试验根据每个单因素试验得到的适宜参数，取适宜参数附近的3个水平，进行4因素3水平L9(34)正交试验。正交试验因素水平表如表 1。
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表 1 正交试验因素水平表 Table 1 Factor and level of orthogonal test |
采用灼烧法对CTAB-MMT的灼失重进行测定。取CTAB-MMT 1 g，放入烧至恒重的坩埚里，以每分钟升温10 ℃的速率升温至350 ℃，恒温3 h，等降至室温后称量CTAB-MMT的灼失重。
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式中：V为CTAB-MMT的灼失重(%)；W0为产物灼烧前的重量(g)；W1为产物灼烧后的重量(g)。
1.4 CTAB-MMT的结构与表征通过SEM对MMT改性前后的表面形态进行观察：用牙签蘸取少量干燥后的样品，将其用导电胶粘在样品台上，样品喷金镀膜3次，然后置于样品室中抽真空，观察并对所需样品图像拍照。
使用XRD仪进行表征分析，检测条件为：铜靶，特征射线Kα(λ=1.541 8×10-10 m)，电流40 mA，工作电压40 kV，扫描速度8.000°/min，步长0.02°，扫描范围2.5°~45.0°。
称取干燥样品与恒重的溴化钾(KBr，分析纯)粉末[样品与KBr比例为1 : (100~200)]置于玛瑙研钵中混合，充分研磨(操作全部在红外灯照射下进行)。用药匙取混合物粉末注于仪器中压模，将得到的样品薄片放入FTIR仪中分析。其检测范围为500~4 000 cm-1。
1.5 CTAB-MMT对霉菌毒素的体外吸附试验 1.5.1 对AFB1体外吸附能力的测定试验共分为4组，每组3个重复。第1组为空白对照组，50 mL浓度为1 μg/mL的AFB1溶液；第2、3和4组分别在空白对照组的基础上添加0.1 g Ca-MMT、Na-MMT、CTAB-MMT，各组37 ℃、120 r/min条件下振荡反应8 h，3 500 r/min离心10 min。无菌注射器吸取上清液3~4 mL转至洁净试管中，用固相萃取柱过滤，取上层液体1 mL将其缓慢过0.22 μm有机相膜于液相小瓶中，高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)法检测各组中AFB1含量。
1.5.2 对ZEN体外吸附能力的测定试验共分为4组，每组3个重复，第1组为空白对照组，50 mL浓度为1 μg/mL的ZEN溶液；第2、3和4组分别在空白对照组的基础上添加0.1 g Ca-MMT、Na-MMT、CTAB-MMT。其他同步骤1.5.1。
1.5.3 对DON体外吸附能力的测定试验共分为4组，每组3个重复。第1组为空白对照组，50 mL浓度为1 μg/mL的DON溶液；第2、3和4组分别在空白对照组的基础上添加0.1 g Ca-MMT、Na-MMT、CTAB-MMT。其他同步骤1.5.1。
1.5.4 对FB1体外吸附能力的测定试验共分为4组，每组3个重复。第1组为空白对照组，50 mL浓度为1 μg/mL的FB1溶液；第2、3和4组分别在空白对照组的基础上添加0.1 g Ca-MMT、Na-MMT、CTAB-MMT。其他同步骤1.5.1。
1.5.5 检测指标与方法吸附量和吸附率计算公式如下：
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式中：Q为吸附量(mg/kg)；A为加入溶液中的霉菌毒素总量(mg)；B为加入吸附剂后上清液中的霉菌毒素总量(mg)；m为溶液中吸附剂的添加量(kg)；Y为吸附率(%)。
1.6 霉菌毒素检测质量控制根据DB 37/T 3856—2019采用HPLC-MS法检测AFB1、ZEN、DON、FB1的准确度与精密度，见表 2。
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表 2 HPLC-MS法检测AFB1、ZEN、DON、FB1的准确度与精密度 Table 2 Accuracy and precision of AFB1, ZEN, DON and FB1 by HPLC-MS method |
利用SAS 9.2.0统计软件的单因素方差分析和Duncan氏多重比较法进行分析。数据均采用平均值±标准差(mean±SD)表示。P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
2 结果与分析 2.1 制备CTAB-MMT的最佳工艺条件由图 1可知，随着CTAB浓度的增加，CTAB-MMT灼失重逐渐增大，在CTAB浓度达3.0%时达最大值。CTAB-MMT灼失重随反应温度的增加逐渐增大，在反应温度增加到70 ℃时达最大值。随反应时间增加CTAB-MMT灼失重先增大，当反应时间为2.0 h时不再增加。CTAB-MMT灼失重随pH的提高先增大后减小，在pH为10时达最大值。
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图 1 CTAB浓度、反应温度、反应时间及pH对CTAB-MMT灼失重的影响 Fig. 1 Effects of CTAB concentration, reaction temperature, reaction time and pH on ignition loss of CTAB-MMT |
由表 3可知，因素A即CTAB浓度极差最大(R=3.03)，其次是因素C、D和B。可排出各因素对产物影响的次序为：A>C>D>B。每个因素下，3个水平的影响程度为A3>A2>A1、B1>B3>B2、C2>C1>C3、D3>D1>D2。制备CTAB-MMT的最佳工艺条件为：CTAB浓度2.4%、反应温度60 ℃、反应时间2 h、pH 11。
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表 3 正交试验结果 Table 3 Orthogonal test results |
由图 2可知，Ca-MMT的性状为连片状物质，颗粒较大，片体较厚，分布零星，边缘不规则；Na-MMT为层状结构，呈颗粒状，分散较均匀，有团聚现象；CTAB-MMT为卷曲的片层结构，呈颗粒状，颗粒相互粘连在一起。
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A：钙基蒙脱石Ca-MMT；B：钠化蒙脱石Na-MMT；C：十六烷基三甲基溴化铵改性蒙脱石CTAB-MMT。 图 2 不同种类MMT的SEM图谱 Fig. 2 SEM patterns of different kinds of MMT (1 500×) |
由图 3可知，从衍射峰位置来看，首峰(d001)表示的是MMT的层间距。Ca-MMT的XRD图谱中层间距为1.49 nm，Na-MMT的XRD图谱中层间距为1.25 nm，CTAB-MMT的XRD图谱中层间距为1.91 nm。
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A：钙基蒙脱石Ca-MMT；B：钠化蒙脱石Na-MMT；C：十六烷基三甲基溴化铵改性蒙脱石CTAB-MMT。 图 3 不同种类MMT的XRD图谱 Fig. 3 XRD patterns of different kinds of MMT |
由图 4可知，对比3种MMT的FTIR图谱，发现在1 033、1 633、3 618、3 422 cm-1附近都出现了伸缩振动吸收峰。此外，Na-MMT的FTIR图谱中出现了1个在1 459 cm-1附近的吸收峰；CTAB-MMT的FTIR图谱中在1 462、2 850、2 929 cm-1处出现了吸收峰。
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A：钙基蒙脱石Ca-MMT；B：钠化蒙脱石Na-MMT；C：十六烷基三甲基溴化铵改性蒙脱石CTAB-MMT；D：十六烷基三甲基溴化铵CTAB。 图 4 不同种类MMT和CTAB的FTIR图谱 Fig. 4 FTIR patterns of different kinds of MMT and CTAB |
由表 4可知，对AFB1、DON、ZEN和FB1 4种霉菌毒素的吸附量最大的是CTAB-MMT，相比Ca-MMT差异极显著(P < 0.01)；从对AFB1的吸附量来看，CTAB-MMT极显著高于Ca-MMT(P < 0.01)，同时显著高于Na-MMT(P < 0.05)；CTAB-MMT对DON、ZEN、FB1的吸附量极显著高于Ca-MMT、Na-MMT(P < 0.01)。由表 5可知，CTAB-MMT对AFB1、DON、ZEN和FB1的吸附率极显著高于Ca-MMT、Na-MMT(P < 0.01)。
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表 4 不同种类MMT对4种霉菌毒素的吸附量 Table 4 Adsorption of four mycotoxins by different kinds of MMT |
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表 5 不同种类MMT对4种霉菌毒素的吸附率 Table 5 Adsorption rates of four mycotoxins by different kinds of MMT |
本试验中，CTAB-MMT灼失重随CTAB浓度的增加逐渐增大，在CTAB浓度达3.0%时不再增加，反呈下降的趋势。这可能是因为CTAB过量而产生了解离，引起MMT复合物的胶溶，重新构成了MMT扩散双电层[9]。随反应温度的增加，CTAB-MMT灼失重随之增大，在反应温度增加到70 ℃达最大值，之后不再增加。这是因为虽然提高反应温度便于离子交换，但温度过高会使得交换平衡受到破坏，使交换容量下降，产物灼失重降低[10]。CTAB-MMT灼失重随反应时间的增加而增大，当反应时间为2 h时到达最大，之后随时间增加而减少。MMT与改性剂反应需要足够的时间，但是反应时间过长，会导致灼失重下降[4]。随pH的增加，CTAB-MMT灼失重随之增加，当pH为10时最大，之后随pH增加而减少。受体系pH的影响，pH>9时反应体系中负电荷变多，阳离子交换量增加，pH < 9时则相反；pH过高时也会引起MMT中部分硅酸铝盐的溶解[11]。极差分析结果表明，A3B1C2D3为本试验最优水平组合，即制备CTAB-MMT的最佳工艺条件为：CTAB浓度2.4%，反应温度60 ℃，反应时间2 h，pH 11。
3.2 不同种类MMT的结构表征从SEM表征结果看，Ca-MMT的性状为片状物质，颗粒较大，边缘不规则；Na-MMT与Ca-MMT相比结构没有大的变化，分散较均匀，呈层状结构且颗粒相互粘连，这是因为MMT端面具有亲水性且存在静电荷，颗粒间有静电引力存在[12]；CTAB-MMT颗粒相互粘连在一起，这是因为极性使得CTAB的大分子紧密排列在一起[5]。MMT经CTAB改性后仍边缘不规则，出现了大小和形状不等的孔洞分布在MMT片层间[8]，这表明CTAB在MMT的层间存在且分布不均匀。
从XRD表征结果看，当CTAB进入MMT的层间后，CTAB的阳离子端结合到MMT硅氧层或其他有机离子层上的孔隙中，使之形成排列紧密的平卧单层状态[10]。CTAB-MMT层间距相比Ca-MMT和Na-MMT扩大至1.91 nm，除首峰位置外，其余变化不大，表明CTAB插入到了MMT层间并没有破坏原有结构。
从FTIR表征结果看，Na-MMT图谱中有1个较弱的吸收峰在1 459 cm-1附近，一般来说Ca-MMT无吸收峰在此附近[13]。相比Ca-MMT和Na-MMT的图谱，CTAB-MMT的图谱中出现了新的吸收峰。CTAB-MMT的图谱中在2 929和2 850 cm-1处存在-CH2的特征吸收峰、在1 462 cm-1处存在-CH-的特征吸收峰[14]，说明改性后的MMT由亲水性向疏水性转变[15]。通过比较发现Ca-MMT的图谱中没有出现以上吸收峰，而CTAB-MMT的图谱中在3 627、3 425、1 645、1 036 cm-1等附近均出现了MMT的特征吸收峰，这说明CTAB进入了MMT层间并没有改变其原有的结构。
3.3 不同种类MMT体外吸附霉菌毒素的效果天然MMT通常对极性强的AFB1的吸附效果良好，对极性比较弱的DON、ZEN的吸附效果较差。经CTAB改性后的MMT层间距被扩大，使得它能够容纳更多的霉菌毒素；并且，CTAB中的烷基链改善了层间疏油性环境，进而增强了吸附能力[3]。CTAB-MMT对AFB1的吸附量和吸附率分别极显著和显著高于Ca-MMT、Na-MMT；CTAB-MMT对DON、ZEN、FB1的吸附量和吸附率均极显著高于Ca-MMT、Na-MMT。CTAB-MMT对AFB1、DON、ZEN、FB1的吸附量相比Ca-MMT分别提高48.33、374.20、190.53、102.47 mg/kg，相比Na-MMT分别提高3.17、194.49、145.45、11.58 mg/kg；吸附率相比Ca-MMT分别提高9.61、73.12、38.8、20.12个百分点，相比Na-MMT分别提高0.70、37.30、29.62、2.27个百分点。研究显示，DTAB改性MMT、STAC改性MMT、SKC改性MMT均提高了对霉菌毒素的吸附能力[7-8]，其中CTAB-MMT对DON的吸附效果优于STAC改性MMT、SKC改性MMT，吸附率相比上述二者分别提高28.12、33.83个百分点。可以看出，CTAB-MMT对霉菌毒素的吸附能力得到明显增强，尤其是显著提高了对DON和ZEN的吸附能力。
4 结论① CTAB-MMT最佳工艺条件为：CTAB浓度2.4%，反应温度60 ℃，反应时间2 h，pH 11。
② CTAB成功插层到MMT层间，同时没有改变MMT原本结构。
③ CTAB-MMT对弱极性的霉菌毒素的吸附能力明显增强，显著提高了对ZEN和DON的吸附能力，具有更强更广谱的吸附能力，是良好的霉菌毒素吸附剂。
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