我国是中草药的故乡，提取有效成分后产生的中药渣非常巨大，每年达到3 000万t以上。目前中药渣处理方式主要是堆放、焚烧与填埋等^[1]，需要投入大量资金，而且存在污染风险，也造成资源浪费。如何科学有效处理中药渣，使其无害化、减量化和资源化，已成为需要迫切解决的问题。中药渣含有粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、糖类、淀粉等物质，可以作为非常规饲料开发^[2]。此外，中药渣中还含有一些生物活性物质，具有一定的药用价值，如多糖类、黄酮类、生物碱和萜类等^[3]。有效利用中药渣资源，可以降低饲养成本，促进动物健康生长，改善畜产品质量^[4-5]。但是中药渣在饲料化应用中存在一些问题，如含有较高抗营养因子，影响动物吸收利用^[6]；存在大量味道较为浓烈的药效成分，直接饲喂时降低了动物适口性。有研究表明，通过厌氧发酵可以改善中草药的适口性，提高营养价值，而且可以长期储存^[7-8]。

本研究所用中药渣是一种保健型中成药浸提之后剩余物质，每天产生30 t左右，需要占据大量空地，另外由于水分和营养物质含量高(含水量为74.0%)，极容易发霉，若不及时清理，将影响生产进度和环境质量。因此，本试验拟研究不同起始pH对中药渣厌氧发酵的影响，并与常规饲粮比较饲喂肉羊的育肥效果，旨在为降低我国南方肉羊全舍饲条件下饲料成本问题提供可借鉴方法，也为开发新型功能性饲料做出积极探索。

1 材料与方法 1.1 试验材料

中药渣来自江西某大型中药企业，主要组成和含量分别为：葫芦巴、熟地黄、淫羊藿和金樱子各9.1%，枸杞子和菟丝子各6.4%，剩余16味药(制何首乌、补骨脂、蛇床子、肉苁蓉、五味子、覆盆子、黄芪、红参、白术、山药、茯苓、当归、川穹、小茴香、车前子和灸甘草)占50.8%，是纯中药的非处方药(OTC)药渣。中药渣中主要成分含量分别为：总多糖17.0%，总黄酮5.0%，其他成分如淫羊藿苷、蛇床子素、大黄素、补骨脂素、黄芪甲苷等0.05~2.50 mg/g。中药渣的营养成分见表 1。

1.2 试验设计 1.2.1 不同起始pH对中药渣发酵的影响

比较不同起始pH对中药渣厌氧发酵的影响，试验设3个组：A1组(中药渣直接厌氧发酵，中药渣本身pH为4.55)、A2和A3组(用食品级小苏打分别调整中药渣pH为5.50和6.90)。3个组均接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，菌种由研究室从青贮饲料中分离并保存，液体培养活菌数为6.0×10⁸ CFU/mL)，接种量为0.5%，混合均匀后装入安装单向排气阀的发酵袋，用真空机抽真空，密封后厌氧发酵。各取样时间点分别设3个重复，每个重复为30 kg中药渣。每次取样时弃去表层部分中药渣，取样之后迅速抽真空、密封，继续发酵。中药渣发酵温度为25 ℃左右，发酵时间为30 d。

1.2.2 发酵中药渣对肉羊育肥效果的影响

选择30只当年出生、体重为(35.0±2.0) kg的湖羊公羊作为试验对象，随机分为对照组和试验组，每组15只，单栏喂养。对照组饲喂常规基础饲粮，试验组饲喂发酵中药渣(起始pH为6.90，发酵30 d)饲粮。基础饲粮参照《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004)配制。由于发酵中药渣饲粮pH低于4.0，饲喂中药渣时加入适量小苏打中和有机酸(添加量约为0.1%)。饲粮组成及营养水平见表 2。

湖羊每日饲喂2次，饲喂时间分别为07:00和17:00，饲粮投喂量以剩余10%左右为度，采食后自由饮水。试验期间对肉羊及羊舍进行定期驱虫与消毒处理，每日准确记录饲喂量和剩料量，计算干物质采食量(DMI)。预试期15 d，正试期70 d。正式试验起始日称重记为始重，试验结束日称重记为末重。计算总增重、平均日增重和料重比。

1.3 指标测定及方法

中药渣发酵时，前期每隔1 d取样测定pH，每次取20 g鲜样后加100 mL蒸馏水充分混匀后测pH。发酵结束时测定中药渣中微生物蛋白、乳酸、挥发性脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)、重金属(铬、镉、铅、汞)、砷和黄曲霉毒素B₁(AFB₁)含量，稀释比例与pH相同，稀释液先用滤纸过滤，再经0.45 μm滤膜过滤得到滤液。微生物蛋白含量用考马斯亮蓝比色法测定，乳酸含量用对羟基联苯法测定，挥发性脂肪酸含量用气相色谱法测定，重金属含量用原子吸收光谱仪测定，AFB₁含量用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定，测定条件参见文献[9-11]。

发酵中药渣每周取样1次，用Illumina Miseq高通量测序技术研究细菌群落多样性。采用玻璃珠细胞破碎仪破碎细胞，苯酚氯仿抽提方法提取中药渣中细菌基因组。细菌扩增区域为16S rRNA V3+V4区，扩增引物为341F/806R^[12]。细菌基因文库构建及上机测序分析均由北京诺禾致源科技有限公司完成。

试验结束后从肉羊颈静脉抽取血液，4 500 r/min离心15 min得到血清，-20 ℃保存。肉羊血清生化、免疫和激素指标采用全自动生化分析仪(OLYMPUS AU400)测定，所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4 统计分析

试验数据用Excel 2016进行预处理，采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法多重比较检验组间差异显著性，以P＜0.05表示差异显著，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析 2.1 不同起始pH对中药渣发酵后pH变化的影响

由表 3可知，A1、A2和A3组的pH在前2天下降最迅速，此后趋于平缓，8 d后pH基本稳定。发酵第6天，所有组pH均低于4.0，pH低于4.0后有利于中药渣长期保存。提高起始pH，前期发酵pH下降明显，后期变化较平缓。

2.2 不同起始pH对发酵中药渣有机酸和微生物蛋白含量的影响

由表 4可知，A2和A3组乳酸含量分别比A1组提高25.95%和49.93%，A3与A1组差异达到显著水平(P＜0.05)，A2和A3组乙酸含量分别比A1组提高17.36%和22.77%，差异均达到显著水平(P＜0.05)。A1组丙酸含量最高，但是不同组间差异没有达到显著水平(P＞0.05)，没有检测到丁酸。调节中药渣发酵起始pH可以促进微生物生长，A2和A3组微生物蛋白含量分别比A1组显著提高了10.0%和14.72%(P＜0.05)。

2.3 不同起始pH对发酵中药渣细菌多样性的影响

Shannon指数和Simpson指数用于衡量群落多样性，受样品群落中物种丰度和物种均匀度的影响，Chao指数、Ace指数和Observed species指数反映群落中物种的数量。由表 5可知，与A1组比较，A2和A3组中药渣中细菌的多样性和数量均有所提高，其中A2组的Observed species指数、Shannon指数和Simpson指数与A1组差异达到显著水平(P＜0.05)，A3组Shannon指数和Simpson指数与A1组差异达到显著水平(P＜0.05)。从不同取样时间看，第1周中细菌Observed species指数最高，与其他时间比较差异达到显著水平(P＜0.05)，随着时间延长，Observed species指数逐渐下降，第4周有所回升，其他多样性指数变化趋势也是逐渐下降，第4周回升。

由表 6可知，调节起始pH可以提高乳酸杆菌属(Lactobacillus)相对丰度，与A1组比较，差异均达到显著水平(P＜0.05)，此结果与乳酸含量变化规律一致。A1组肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、独岛氏菌属(Dokdonella)相对丰度均为最高，且前3个菌属相对丰度与A2和A3组比较差异达到显著水平(P＜0.05)。A3组沙雷氏菌属(Serratia)相对丰度最高，显著高于A1和A2组(P＜0.05)。乳酸杆菌属相对丰度随时间逐渐提高，第3周达到最高，且显著高于其他时间(P＜0.05)。肠杆菌属和泛菌属相对丰度变化规律相同，第3周最低，且显著低于前2次取样(P＜0.05)。

2.4 发酵中药渣安全性指标测定

检测发酵中药渣饲粮中4种重金属、砷和AFB₁含量(表 7)，结果符合国家饲料安全性要求(饲料卫生标准GB 13078—2017)。中药渣发酵结束时，通过高效液相色谱质谱联用仪(HPLC/MS)定性分析A2组发酵中药渣中代谢物质成分，主要有三羧酸循环相关的有机酸(乳酸、草酸、酒石酸和苹果酸等)、醇类(乙醇、丙二醇和丁二醇等)、脂肪酸类(棕榈酸、亚油酸、氯化亚油酸和顺-油酸等)、酯类(油酸乙酯、亚油酸乙酯和棕榈酸乙酯等)、5种不同结构的呋喃酮以及乙烯基苯酚、蛇床子素和川芎内酯等30多种物质。这些代谢产物有些与中药渣本身所含的药用植物成分有关，有些是微生物发酵产生。

2.5 发酵中药渣对肉羊育肥效果的影响

由表 8可知，试验组平均日增重比对照组提高6.4%左右，差异没有达到显著水平(P＞0.05)，料重比比对照组降低8.63%，差异也没有达到显著水平(P＞0.05)。

由表 9可知，试验组血清葡萄糖(GLU)、胆固醇(CHO)、白蛋白(ALB)含量与对照组之间差异均不显著(P＞0.05)，且在正常范围内。比较血清总抗氧化能力(T-AOC)以及过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、溶菌酶(LZM)活性和丙二醛(MDA)含量，差异也均不显著(P＞0.05)。试验组血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量和对照组之间差异达到极显著水平(P＜0.01)。发酵中药渣显著提高了血清中生长激素(GH)含量(P＜0.05)，而对睾酮(T)、双氢睾酮(DHT)、脱氢表雄酮(DHEA)和雄烯二酮(ASD)含量的影响均不显著(P＞0.05)。

3 讨论 3.1 中药渣营养价值和利用方式

李艳军^[13]研究2种中药渣营养成分，“清瘟败毒”药渣的粗蛋白质含量为14.1%、粗脂肪含量为1.7%、粗纤维含量为15.8%、钙含量为1.7%、磷含量为0.3%；“藿香正气”药渣粗蛋白质含量为13.1%、粗脂肪含量为3.2%、粗纤维含量为8.5%、钙含量为1.3%、磷含量为4.8%，营养价值较高。有些中药渣营养价值相对较低，粗蛋白质含量为2.4%~2.6%，粗脂肪含量为0.2%左右^[14]。中药渣饲料化利用主要测定营养成分是粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、粗灰分和钙、磷等，其中粗蛋白质和粗纤维含量是主要考虑因素^{[6, 15]}。本研究所用中药渣的粗蛋白质和粗脂肪含量远远高于花生蔓(粗蛋白质和粗脂肪含量分别为11.0%和1.5%)；而粗纤维含量低于花生蔓(粗纤维含量为29.6%)，另外，总多糖含量为17.0%，总黄酮含量为5.0%，营养价值非常高，适合饲料化开发。中药渣利用方式有多种，有直接饲喂、厌氧发酵处理以及干燥打粉等。由于多数中药渣有特殊性味道，直接饲喂影响动物适口性，一般添加量也较少。中药渣干燥处理需要压滤脱水和高温干燥等过程^[16]，能耗较大，影响中药渣大量开发应用。研究人员在中药渣中接种乳酸杆菌混合菌剂，25~37 ℃下密闭发酵2 d后即可使用或长期存放，且发酵之后降低了粗纤维和粗灰分含量，提高了粗蛋白质、各种有机酸等含量^[7]。

3.2 不同起始pH对发酵中药渣细菌多样性的影响

起始pH是影响乳酸细菌青贮发酵效果的关键因素之一。孙丹丹等^[17]研究3种因素(碳源、氮源和起始pH)对植物乳杆菌青贮发酵万寿菊效果，起始pH为6.0~7.0最佳，乳酸细菌含量最高。洪梅^[18]研究2株乳酸细菌对全株玉米青贮发酵时发现，1株乳酸细菌最佳起始pH为5.47，另外1株乳酸细菌最佳起始pH为6.5，最佳起始pH与所用乳酸细菌种类密切相关。本研究中，所用中药渣本身pH较低，测定值仅为4.55。调整起始pH为6.90后，发酵中药渣的微生物蛋白含量最高，且显著高于对照组。比较酸度变化趋势，第6天所有组pH小于4.0，之后缓慢下降。中药渣发酵中产生了大量乳酸，其次为乙酸，最少为丙酸，不含丁酸，丁酸是衡量饲料发酵品质的一项重要指标，高品质的发酵饲料不含丁酸^[19]。发酵后的中药渣有光泽，气味芬芳醇香，符合优质饲料发酵标准^[20]。提高中药渣起始pH显著提高了乳酸杆菌属相对丰度，降低肠杆菌属、泛菌属、苍白杆菌属、独岛氏菌属相对丰度，结果表明乳酸细菌发酵造成的酸性环境抑制了一些条件病原菌生长^[12]。比较不同取样时间细菌多样性变化情况，乳酸杆菌属相对丰度第3周达到最高，且显著高于其他时间，结果与刘蓓一等^[21]研究青贮中微生物多样性变化趋势类似。

3.3 发酵中药渣活性成分含量和安全性评价

本试验的中药渣发酵后产生大量代谢物质，发酵产物种类丰富，主要是小分子有机酸、醇、脂肪酸和酯类等。丰富的代谢物质冲淡了浓重中药味道，改善了中药渣气味，具有较好的诱食性和适口性。发酵之后保留的药理活性物质，具有提高动物免疫能力、降低胆固醇和改善心率失衡等综合作用^[22]。有研究对比中药渣发酵前后活性物质变化，结果是黄酮类含量明显提高，原因是微生物降解了药渣中的粗纤维，有利于黄酮类物质析出^[23]。通过发酵还可以降低毒性物质含量，刘亮镜等^[24]通过发酵使马钱子中药的毒性下降而镇痛和抗炎作用不受影响。中药渣发酵之后安全性是需要关注的问题，本研究发酵中药渣的重金属和AFB₁含量检测合格。中药安全性指标主要包括三大类：重金属及有害元素残留、真菌毒素和农药残留^[25]。王少欢^[23]分析了3种发酵中草药AFB₁和玉米赤霉烯酮(ZEN)含量。高华君等^[26]研究了金莲花药渣发酵后铅、铬和汞含量，测定之后这些指标均达到国家饲料安全标准。

3.4 发酵中药渣对肉羊育肥效果的影响

饲喂发酵中药渣具有促进生长、改善肉品质、提高抗氧化和免疫力等作用^[4-6]。与常规基础饲粮比较，本研究所用发酵中药渣提高了肉羊平均日增重，降低了料重比，促生长效果与血清中GH含量提高有一定关系。饲喂发酵中药渣可以提高肉羊育肥效果，代替部分精、粗饲料，降低饲养成本。血清中GLU、CHO和ALB含量与对照组差异不显著，抗氧化指标(T-AOC、CAT和T-SOT)和LZM活性稍高于对照组，差异也不显著。饲喂发酵中药渣肉羊的3种免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM)含量和对照组之间差异达到极显著水平。断奶仔猪饲喂发酵五味子药渣可以显著提高空肠黏膜分泌型免疫球蛋白A(SIgA)含量^[27]，在热应激条件下添加藿香正气中药渣对獭兔血清中IgA、IgM和IgG以及三碘甲腺原氨酸(T₃)、四碘甲腺原氨酸(T₄)含量均有显著提高，表明中药渣中的有效活性成分提高了机体的免疫机能^[28]。本试验检测了血清睾酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮和雄烯二酮含量，试验组和对照组没有显著差异，表明饲喂中药渣对公羊发育和繁殖力没有显著影响。

4 结论

① 本研究所用中药渣营养价值高，含有较高的粗蛋白质、粗脂肪和总多糖等物质，而粗纤维含量低。中药渣起始pH调整到6.90厌氧发酵效果最好，微生物蛋白和有机酸含量最高。发酵好的中药渣中重金属和AFB₁含量符合国家饲料标准。

② 发酵中药渣饲喂肉羊，与常规基础饲粮比较，平均日增重提高6.4%，显著提高了血清中GH含量，极显著提高了血清IgA、IgG和IgM含量，对血清中常规生化指标、抗氧化指标和4种性激素含量没有显著影响。