2. 石河子大学动物科技学院, 石河子 832003;
3. 伊利诺伊大学香槟分校动物科学系, 厄巴纳 61801;
4. 中国农业大学动物科技学院, 北京 100083
2. College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 832003, China;
3. Department of Animal Sciences and Division of Nutritional Sciences, University of Illinois, Urbana 61801, USA;
4. College of Animal Science and Technology, China Agriculture University, Beijing 100083, China
通过添加剂来调控营养物质在瘤胃的发酵降解速率是提高泌乳奶牛饲料利用率的方向之一。丝兰植物粉末(Yucca plant powder)含有丝兰酚、逆转醇、固醇类皂素等天然活性物质[1]。丝兰植物粉末可以降低小鼠亚硝酸盐或者重金属砷导致的氧化应激[2]，缓解肥胖小鼠的代谢应激[3]，降低泌乳奶牛的氧化应激[4]。丝兰植物粉末除了可以减缓氧化应激及代谢应激，还可以在体外发酵时降低甲烷和氨氮生成，提高饲粮利用率[5]；有研究表明丝兰植物所含有的皂苷可以在不影响干物质降解率的情况下降低体外发酵甲烷产量[6]。丝兰植物粉末调控瘤胃发酵的机制有很多，唐彦君等[7]试验表明，丝兰植物粉末中的丝兰皂苷可抑制瘤胃内脲酶活性，且瘤胃内脲酶活性与瘤胃内蛋白质和非蛋白氮降解速率相关；刘春龙等[8]通过在东北细毛羊饲粮中添加丝兰皂苷，发现瘤胃中纤维素酶活性有上升趋势，原虫数量有下降趋势，原虫数量的降低可以降低因细菌周转而造成的可利用蛋白质的损失[9-10]；牛俊丽等[11]通过在饲粮中添加25和125 g/kg的丝兰植物粉末，有效提高了瘤胃体外发酵挥发性脂肪酸(VFA)含量，降低了氨氮含量, 其中125 g/kg的添加水平占饲粮干物质的12.5%，除了发挥作用的主效成分外，还引入了大量可降解的营养物质，对基础饲粮粗蛋白质和能量水平有很大影响，间接影响了与之相关的发酵指标。Holtshausen等[12]在泌乳奶牛饲粮中添加15、30、45 g/kg的丝兰植物粉表明，在较高水平的添加量下，丝兰植物粉末虽然可以降低甲烷排放，但是有降低泌乳效率的负面作用。Benchaar等[13]通过饲养试验证明，每头牛每天补饲60 g丝兰植物粉末(皂素含量10%)降低了采食量。丝兰植物粉末对于降低甲烷排放、降低氨氮含量的作用受到添加剂量的影响[14]。目前丝兰植物粉末影响瘤胃发酵、降低氨氮含量等的作用已被证实，但是对于丝兰植物粉末的适宜添加剂量仍然不确定[15]。因此，在前人研究的基础上本研究设置不同丝兰植物粉末添加剂量，通过瘤胃体外发酵试验，测定产气、VFA含量、干物质降解率等指标，从而分析丝兰植物粉末对瘤胃降解特征的影响，为丝兰植物粉末作为饲料添加剂应用于奶牛生产提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料丝兰植物粉末：购于北京某商贸有限公司。取自生长于美国西南部及墨西哥北部半沙漠地区的丝兰类植物麟凤兰，纯植物粉末状，食品级，主要有效成分为8%的丝兰皂苷。
瘤胃液：以4头经产泌乳中期荷斯坦奶牛为供体牛，于饲喂后3 h通过瘤胃瘘管采集瘤胃液，混合后装于保温瓶迅速带回实验室，用4层纱布过滤(同时通入二氧化碳)，整个操作于39 ℃水浴中进行。
发酵底物：参照NRC(2001)奶牛营养需要配制泌乳中期荷斯坦奶牛基础饲粮，烘干后粉碎(粉碎粒度≤1 mm)。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
缓冲液配制：液体培养基采用Menke等[16]的方法配制。微量元素溶液A：每100 mL溶液A含CaCl2·2H2O 13.2 g、MnCl2·4H2O 10 g、CoCl·6H2O 1 g和FeCl3·6H2O 8 g；碳酸盐缓冲溶液B：每升溶液B含NH4HCO3 4 g和NaHCO3 35 g；磷酸盐缓冲溶液C：每升溶液C含Na2HPO4 5.7 g、KH2PO4 6.2 g和MgSO4·7H2O 0.6 g；还原剂溶液：每100 mL还原剂溶液含NaOH 160 mg、Na2S·9H2O 625 mg。配制好溶液后按比例混合：400 mL H2O、0.1 mL微量元素溶液A、200 mL碳酸盐缓冲溶液B、200 mL磷酸盐缓冲溶液C、40 mL还原剂溶液。接种前需向瓶中充入二氧化碳。
1.2 试验设计应用64通道体外发酵产气系统构建瘤胃液体外发酵环境。依据发酵罐中不同丝兰植物粉末添加量分为5组，各组分别添加0(对照)、2.5、5.0、7.5、10.0 g/kg(干物质基础)的丝兰植物粉末，每组6个重复。
1.3 试验方法准确称取约0.5 g处理好的饲粮样品于150 mL厌氧发酵瓶中，按照试验不同处理，添加相应剂量的丝兰植物粉末。接种前将发酵瓶放于39 ℃恒温箱预热，并向每个瓶中持续通入二氧化碳5 s后，迅速向每个瓶中加入预热的液体培养基45 mL和经4层纱布过滤的新鲜瘤胃液25 mL，向瓶中持续通入二氧化碳5 s后，立即加上瓶塞，将每个发酵瓶与AGRS-1型体外发酵产气自动记录装置的气路相连接，于39 ℃恒温箱下培养48 h后终止发酵。
1.4 检测指标 1.4.1 发酵液pH发酵结束后立即用pH计(Sartorius，PB-10)测定发酵液的pH。
1.4.2 发酵液氨氮含量发酵结束后，将每个发酵瓶中的发酵液经尼龙袋分别过滤，取6 mL滤液于10 mL离心管中，加0.1 mL 6 mol/L盐酸固氮，随即应用苯酚-次氯酸钠比色法测定发酵液氨氮含量[17]。
1.4.3 发酵液VFA含量发酵后每个发酵瓶中采集5 mL发酵液，10 000×g离心10 min后，移取1.5 mL上清液测定VFA含量[18]。
1.4.4 营养物质体外降解率发酵结束后，将发酵液经过50 μm，5 cm×10 cm的尼龙袋[19]进行过滤，尼龙袋内的固相发酵物用于测定干物质降解率。测定干物质降解率后，每组的样品进行混合，测定粗蛋白质、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量。
1.4.5 发酵产气及甲烷产量应用64通道微生物发酵微量产气系统及配套软件实时记录产气量。参考Moss[20]计算甲烷产量的方法进行计算。公式如下：
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使用Excel 2019对数据进行初步整理后，采用SAS 9.4软件中的PROC ANOVA进行单因素方差分析，Duncan氏法进行多重比较，采用GLM模型进行线性和二次统计分析，显著水平为P≤0.05。
2 结果 2.1 丝兰植物粉末对发酵液pH、氨氮及VFA含量的影响由表 2所示，体外发酵添加不同剂量的丝兰植物粉末对瘤胃pH无显著影响(P=0.12)。随着丝兰植物粉末添加量的升高，发酵液总VFA、乙酸、丙酸和丁酸含量呈线性显著增加(P＜0.05)。异戊酸含量随丝兰植物粉末添加量的增加呈先降低后升高的二次曲线显著变化(P=0.02)。
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表 2 丝兰植物粉末对瘤胃体外发酵指标的影响(48 h) Table 2 Effects of Yucca plant powder on rumen fermentation parameters in vitro (48 h) |
由表 3可知，丝兰植物粉末对于干物质降解率影响没有显著差异(P=0.18)。添加5.0 g/kg丝兰植物粉末组干物质降解率较对照组有较低的趋势(P=0.09)，添加2.5 g/kg丝兰植物粉末组粗蛋白质、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维降解率在数值上最低。
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表 3 丝兰植物粉末对瘤胃体外发酵的饲粮营养物质降解率的影响(48 h) Table 3 Effects of Yucca plant powder on nutrient degradation rate of in vitro rumen fermentation (48 h) |
由表 4可知，添加不同剂量丝兰植物粉对48 h产气量的影响不显著(P=0.94)，添加不同剂量丝兰植物粉也末对48 h甲烷产量产生显著影响(P= 0.20)。添加5.0 g/kg丝兰植物粉末48 h体外发酵产气量在数值上最低，为108.99 mL/g。添加2.5 g/kg丝兰植物粉末48 h体外发酵甲烷产量在数值上较低。
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表 4 丝兰植物粉末对瘤胃体外发酵产气的影响(48 h) Table 4 Effects of Yucca plant powder on gas production of in vitro rumen fermentation (48 h) |
如图 1可知，在体外发酵的全过程中，随着发酵时间的延长，发酵总产气量显著上升(P＜0.01)。添加丝兰植物粉对发酵总产气量没有显著影响(P=0.186 2)，但添加5.0 g/kg丝兰植物粉末组发酵总产气量在各个时间点在数值上均低于对照组(P=0.186 2)。
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图 1 丝兰植物粉末对瘤胃体外发酵总产气量的影响(48 h) Fig. 1 Effects of Yucca plant powder on total gas production of in vitro rumen fermentation (48 h) |
泌乳奶牛瘤胃内正常pH对维持瘤胃微生物的正常生长代谢发挥着重要作用，瘤胃pH主要受到唾液分泌、瘤胃发酵产物利用和吸收效率的影响[21]。如体外发酵过程缺失唾液的中和作用，则主要通过添加缓冲液达到稳定体外发酵环境pH的作用。在本试验中，所有组pH均在适宜范围内，说明缓冲液配制合理，达到了稳定发酵环境的作用。
发酵液氨氮含量的高低反映了饲粮中粗蛋白质在瘤胃中降解的程度和被微生物利用的效率[22]。Zeid等[5]通过试验表明，丝兰植物粉末有降低瘤胃氨氮含量的作用。Singer等[23]在体外试验中添加0、5、10、15 g/kg的丝兰植物粉末，发现有降低发酵液氨氮含量的趋势。本试验中添加5.00 g/kg丝兰植物粉末组氨氮含量较低，相对对照组有降低氨氮含量的趋势。丝兰植物粉末降低氨氮含量主要是通过降低瘤胃蛋白质和非蛋白氮的降解，其次丝兰植物粉末中的多糖与瘤胃中的氨进行结合，从而降低氨氮含量[2]。
VFA是反刍动物能量利用的中间代谢产物，是微生物主要的碳源。本试验中，随着丝兰植物粉末添加量的升高，总VFA含量在丝兰植物粉末添加量为2.5、5.0 g/kg时，数值上较低，添加10.0 g/kg丝兰植物粉末组较添加5.0 g/kg丝兰植物粉末组总VFA含量在数值上有所升高，与前人研究结果[11]一致，有可能是因为较高添加量的丝兰植物粉末除了有效成分，还引入了可发酵底物。这表明添加丝兰植物粉末在较低添加量时有抑制VFA生成的作用，在较高添加量时可以促进瘤胃发酵。
3.2 丝兰植物粉末对瘤胃体外发酵饲粮营养物质降解率的影响瘤胃营养物质降解率反映了饲料原料被消化利用的难易程度，可以体现饲用价值的高低以及被微生物和机体组织所利用的程度，但对于淀粉或蛋白质类等容易被降解的饲料，通过抑制其在瘤胃的降解，提高过瘤胃率，使其在小肠被消化吸收，可提高其总体利用效率[24-25]。本试验中添加2.5、5.0 g/kg丝兰植物粉末对干物质降解率在数值上有降低的趋势，结合在相同添加量下氨氮产生受到抑制的实际情况，可能是由于一定剂量的丝兰植物粉末抑制了蛋白质等在瘤胃的降解，从而引起干物质降解率降低，这可能是因为丝兰植物粉末含有的皂苷具有抑制瘤胃脲酶活性的作用，抑制了蛋白质的降解[7]。
3.3 丝兰植物粉末对体外发酵产气量和甲烷产量的影响体外发酵产气主要与饲粮营养含量相关，可发酵营养物质越多，微生物的活性越强，则产气量越大[26]。本试验条件下，不同添加量丝兰植物粉末没有影响48 h单位底物产气量。但从数值上，添加5.0 g/kg丝兰植物粉末组从发酵起始至结束，产气量始终最低，可能是5.0 g/kg的丝兰植物粉末对瘤胃原虫和细菌的生长具有一定抑制作用，从而降低了发酵产气量[27]。与添加5.0 g/kg丝兰植物粉末相比，添加7.5、10.0 g/kg丝兰植物粉末48 h总产气量在数值上逐渐增高，可能是由于丝兰植物粉末引入了少量能量和蛋白质类物质，增加了总可发酵底物的量，引起产气量的升高，这与牛俊丽等[11]研究结果一致。
甲烷是一种温室气体，降低瘤胃产甲烷有助于甲烷减排，也有助于提高饲粮利用效率，瘤胃内甲烷主要来源于甲烷菌。Canul等[28]在绵羊体外瘤胃发酵过程中添加6.0 g/kg的丝兰植物粉末，发现没有影响甲烷产量。Xu等[29]通过体外发酵发现，添加110 g/kg的丝兰植物粉末降低了24 h甲烷产量。本试验添加2.5 g/kg丝兰植物粉末时，甲烷产量最低，可能是丝兰植物粉末抑制了甲烷菌的生长，但较对照组没有显著差异。本试验结果与前人结果不同，造成不同影响的原因一方面是设置剂量差异，有效成分的含量不同[14]，另一方面是饲粮配方的不同，Lila等[30]研究表明，饲粮不同淀粉源(马铃薯淀粉、玉米淀粉)影响丝兰植物粉末对甲烷产量的调控；李国祥[31]发现饲粮碳水化合物结构也影响丝兰植物粉末对瘤胃甲烷产生的调控作用。然而在体外发酵试验时，较大剂量的丝兰植物粉末除了引入有效成分外，还引入了营养物质，也是造成本试验部分结果差异不显著的原因之一。
4 结论添加5.0 g/kg的丝兰植物粉末可降低体外发酵甲烷产量和氨氮含量, 对饲粮瘤胃降解有抑制作用。
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