2. 四川大恒家禽育种有限公司, 成都 610066
2. Sichuan Daheng Poultry Breeding Company, Chengdu 610066, China
抗生素滥用导致的药物残留和抗药性问题受到越来越多的重视，欧盟自2006年开始严禁在饲料中添加抗生素，此后许多国家相继出台了相应政策控制抗生素的使用。我国宣布药物饲料添加剂在2020年全部退出。饲料端“禁抗”，养殖端“减抗、限抗”大势已定，寻找安全、高效的替代新产品成为当前畜牧产业的一项重要课题。
近年来益生菌用于家畜、家禽养殖的研究增多，结果表明相当多的益生菌制剂能有效调节动物胃肠道的微生态平衡，增强机体的免疫和抗病力，促进动物的生长性能[1-5]。再加上安全、无耐药性、无残留等优点，益生菌有望成为一种理想的抗生素替代品。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是乳酸菌的一种，属乳杆菌科乳杆菌属，是典型的兼性厌氧菌，发酵糖类的能力很强，且只发酵产生乳酸，广泛分布于发酵的蔬菜、果汁和乳制品中[6]，较耐盐，与其他乳酸菌的区别在于此菌的活菌数比较高，能大量的产酸，并与其他乳酸菌有协同作用。植物乳杆菌主要广泛应用于乳制品生产，包括功能性酸乳、发酵豆乳、干酪、功能性乳酸菌饮料中。随着畜牧产业的发展，植物乳杆菌开始作为饲料添加剂在畜禽生产领域应用。现有的一些研究结果表明，植物乳杆菌能促进动物肠道有益菌增殖，降低病原菌的数量，丰富肠道菌群的多样性，具有促生长、防腹泻、增强机体免疫和抗病力的效果[7-10]。本文以植物乳杆菌为研究对象，研究饲粮中添加不同水平的植物乳杆菌对地方优质品种肉鸡——大恒肉鸡生长性能、屠宰性能以及血清免疫和抗氧化功能的影响，为优质肉鸡无抗健康养殖提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 植物乳杆菌试验用植物乳杆菌菌种由中国科学院成都生物研究所提供，经复活、传代培养，活菌数在1×109~1×1010 CFU/mL。每周做1次菌液培养，计数、稀释成试验中需要的菌液浓度，按20~40 mL/kg直接添加到饲粮中，采用逐级混合法混合均匀，为保证植物乳杆菌活性，饲粮未经高温制粒、未添加抗生素。
1.2 试验设计和基础饲粮大恒肉鸡是四川大恒家禽育种有限公司联合四川省畜牧科学研究院，利用我国地方鸡种遗传资源，采用现代家禽遗传育种技术育成的青脚、麻羽、白皮肉鸡。挑选健康的1日龄大恒商品代肉雏鸡2 400只，公母各占1/2，分开饲养，公鸡和母鸡各随机分为5个组，每个组6个重复，每个重复40只鸡。对照组(Ⅰ组)饲喂基础饲粮，基础饲粮中不含抗生素；试验组在基础饲粮中分别添加1×105(Ⅱ组)、1×106(Ⅲ组)、1×107(Ⅳ组)和1×108(Ⅴ组) CFU/kg的植物乳杆菌。基础饲粮参照《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)中肉用仔鸡营养需要配制，采用玉米-豆粕型饲粮，料型为粉料。整个试验期分3个饲养阶段，1~21日龄饲喂肉小鸡料，22~42日龄饲喂肉中鸡料，43~70日龄饲喂肉大鸡料，各阶段基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
试验于2019年8—10月在四川大恒家禽育种有限公司进行，全程采用阶梯式笼养，自由采食和饮水，光照、免疫等日常管理均按公司管理手册进行。试验期共70 d。
1.4 指标测定 1.4.1 生长性能试验开始日、21日龄、42日龄和试验结束日对每只鸡进行空腹称重，计算各阶段的平均日增重(ADG)；记录各个组每个重复的饲粮消耗量，计算平均日采食量(ADFI)，根据平均日增重和平均日采食量计算料重比(F/G)。
1.4.2 屠宰性能试验结束日从每个重复中选取4只接近平均体重的健康试验鸡进行屠宰，颈部放血处死，去毛，沥干水分后进行屠宰性能测定，包括屠宰率、全净膛率、半净膛率、腿肌率和腹脂率，测定方法参考《家禽生产性能名词术语和度量统计方法》[11]。
1.4.3 血清免疫功能试验第70天从各组随机抽出8只试验鸡，空腹翅静脉采血5 mL于离心管中，37 ℃静置30 min后，室温3 000 r/min离心10 min，取上清分装于1.5 mL离心管中，-20 ℃保存待测。血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(INF-γ)含量采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒进行测定。往预先包被鸡免疫球蛋白抗体或细胞因子抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，37 ℃温育60 min并彻底洗涤。用底物3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺(TMB)显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的鸡免疫球蛋白呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD)值，计算样品浓度。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，测定方法严格按照试剂盒说明书进行。
1.4.4 血清抗氧化功能采集70日龄试验鸡血清进行抗氧化指标测定，检测血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性以及丙二醛(MDA)含量。GSH-Px可以促进过氧化氢(H2O2)与还原型谷胱甘肽(GSH)反应生成水和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，GSH-Px的活性可用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中GSH的消耗，则可求出酶的活性。GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离子呈现较稳定的黄色，在412 nm处测其OD值即可算出GSH含量。由于H2O2和GSH在没有酶的条件上，也能进行氧化还原反应(称非酶促反应)，所以必须扣除非酶促反应引起的GSH减少的部分。测定主要步骤包括酶促反应和显色反应，分别在酶管和非酶管中进行。T-SOD活性采用羟胺法测定，黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成硝酸盐，在显色剂作用下呈紫红色，于波长550 nm处有最大吸收峰。当被测样品含T-SOD时，其对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的OD值低于对照管的OD值，通过公式可求出样品中的T-SOD的活性。MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定，过氧化脂质降解产物中的MDA可与TBA缩合，形成红色产物，用酶标仪在532 nm波长测定OD值。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，测定方法严格按照试剂盒说明书进行。
1.5 统计与分析数据通过SPSS 17.0统计软件进行分析，采用one-way ANOVA进行单因素方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P < 0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 饲粮添加植物乳杆菌对大恒肉鸡生长性能的影响由表 2可知，与对照组(Ⅰ组)相比，饲粮添加1×107 CFU/kg植物乳酸杆菌显著提高了母鸡70日龄体重(P < 0.05)；公鸡、母鸡各阶段平均日采食量、平均日增重和料重比各组差异均不显著(P>0.05)，但随着植物乳杆菌添加水平的提高，料重比呈下降趋势。
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表 2 饲粮添加植物乳杆菌对大恒肉鸡生长性能的影响 Table 2 Effects of dietary Lactobacillus plantarum on growth performance of Dahen broilers |
由表 3可知，与对照组相比，饲粮添加不同水平植物乳杆菌对大恒肉鸡屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率、腿肌率和腹脂率无显著影响(P>0.05)，各组肉鸡屠宰性能无显著差异(P>0.05)。
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表 3 饲粮添加植物乳杆菌对大恒肉鸡屠宰性能的影响 Table 3 Effects of dietary Lactobacillus plantarum on slaughter performance of Dahen broilers |
由表 4可知，Ⅴ组公鸡血清IgA和INF-γ含量显著高于Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组(P < 0.05)，Ⅴ组公鸡血清IgG含量显著高于对照组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组(P < 0.05)，Ⅴ组公鸡血清IgM和IL-2含量显著高于Ⅱ组和Ⅲ组(P < 0.05)；Ⅴ组母鸡血清IgA和IgG含量显著高于对照组和Ⅱ组(P < 0.05)。总体而言，饲粮添加高水平植物乳杆菌组大恒肉鸡的血清免疫功能得到了提高。
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表 4 饲粮添加植物乳杆菌对大恒肉鸡血清免疫功能的影响 Table 4 Effects of dietary Lactobacillus plantarum on serum immune function of Dahen broilers |
由表 5可知，Ⅴ组公鸡血清GSH-Px活性最高，显著高于Ⅱ组和Ⅲ组(P < 0.05)，血清T-SOD活性显著高于Ⅲ组(P < 0.05)；Ⅴ组母鸡血清GSH-Px活性最高，显著高于Ⅲ组和Ⅳ组(P < 0.05)。各组大恒肉鸡血清MDA含量差异不显著(P>0.05)。
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表 5 饲粮添加植物乳杆菌对大恒肉鸡血清抗氧化功能的影响 Table 5 Effects of dietary Lactobacillus plantarum on serum antioxidant function of Dahen broilers |
益生菌进入肠道后，会迅速繁殖，与有害菌群争夺营养，抑制有害微生物的生长。益生菌可直接调节肠道对营养物质的消化吸收，或通过调控消化酶活性，改善肠道对营养物质的消化吸收，进而促进动物的生长。陆银等[12]在饲粮中添加复合益生菌(蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌)，结果表明复合益生菌能显著提高21~35日龄爱拔益加(AA)肉鸡的生长性能。Shokryazdan等[13]研究表明，饲粮添加乳酸杆菌混合物可以显著提高肉鸡增重，改善饲料转化率。郭欣怡等[14]报道饲粮添加乳酸菌、丁酸菌和复合菌制剂，其中复合菌制剂能显著提高肉鸡平均日增重，降低料重比，乳酸菌、丁酸菌在饲养后期使得料重比显著降低。县怡涵等[15]研究发现，7日龄开始饲喂植物乳杆菌能显著提高断奶仔猪平均日采食量和平均日增重，降低料重比，促进断奶仔猪空肠和回肠绒毛发育，具有显著的促生长、抗腹泻效果。本试验结果表明，植物乳杆菌对大恒肉鸡生长性能无显著影响，但随着植物乳杆菌添加水平的提高，料重比呈下降趋势。此外，性别不同植物乳杆菌适宜的添加水平也不同，Ⅲ组公鸡体重最大，Ⅳ组母鸡体重最大。以上结果说明，植物乳杆菌的使用存在最佳添加水平，且可能受到动物品种、性别、生长阶段和益生菌制剂质量、实际饲养管理的条件等众多因素影响。
3.2 饲粮添加植物乳杆菌对大恒肉鸡屠宰性能的影响屠宰性能是畜禽肉用性能的重要评定指标，直观地反映动物机体组成及其产肉性能。蔡中梅[16]研究发现，饲粮添加不同水平的巨大芽孢杆菌，添加水平达到60 mg/kg时鹅全净膛率、半净膛率显著提高，各组胸肌率、腿肌率和腹脂率差异不显著。黄金华等[17]研究结果表明，复合益生菌显著提高了肉鸡的半净膛率和全净膛率。本试验结果表明，各组肉鸡屠宰性能差异不显著。这与以上试验中益生菌表现出的效果差异较大，说明不同的益生菌种类、益生菌组合对屠宰性能的影响可能存在差异，具体机理有待进一步研究。
3.3 饲粮添加植物乳酸菌对大恒肉鸡血清免疫功能的影响免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)具有抗菌、抗病毒等功效，是动物体液免疫系统的重要组成成分。IL-2、IFN-γ等细胞因子具有免疫调节和效应功能，是常用的细胞免疫检测指标。免疫球蛋白和免疫细胞因子水平可直接反映机体的免疫状况。贾志新[18]报道在饲粮中添加丁酸梭菌可以显著提高樱桃谷肉鸭血清IgG和IgM含量。徐基利[19]发现适量的乳酸菌制剂能提高肉仔鸡血清IgG和IgA含量，使机体的体液免疫功能增强。甄玉国等[20]研究表明，饲喂植物乳杆菌显著提高肉仔鸡血清IgG、IgA、IL-2和IFN-γ含量。Liu等[21]报道仔猪口服植物乳杆菌显著降低肠道梭菌属病原菌的数量，促进肠道健康发育。本试验结果与以上研究结果类似，饲粮添加高水平植物乳杆菌时，大恒肉鸡血清IgG含量和母鸡血清IgA含量显著提高，同时血清IgM、IL-2和IFN-γ含量也有所提高，该结果预示植物乳杆菌能够提高大恒肉鸡的血清免疫功能，而免疫功能与机体抗病力、生长性能直接相关。
3.4 饲粮添加植物乳酸菌对大恒肉鸡血清抗氧化功能的影响GSH-Px特异性催化GSH对H2O2的还原反应，是细胞内H2O2和脂质自由基的清除剂。T-SOD能清除自由基，保护细胞免受损伤。MDA是氧化应激的标志物，可反映机体内脂质过氧化的程度。田浪等[22]研究发现，在黄羽肉鸡饲粮中添加复合益生菌，显著提高了肉鸡血清总抗氧化能力(T-AOC)以及T-SOD和过氧化氢酶(CAT)活性。袁文华等[23]研究发现，饲粮添加丁酸梭菌和(或)乳酸菌显著提高青年鸽肝脏CAT、T-SOD和GSH-Px活性，2个菌种复合添加显著降低了肝脏MDA含量。廖秀冬[24]研究表明，饲粮添加丁酸梭菌可以显著提高肉鸡肝脏和血清抗氧化能力。吴凡等[25]研究发现，在低蛋白质水平饲粮中添加益生菌和有机酸复合制剂，青脚麻鸡血清GSH-Px活性提高，血清T-SOD活性降低，血清MDA含量差异不显著。本试验结果表明，与对照组相比，高添加水平植物乳杆菌组肉鸡血清GSH-Px和T-SOD活性较高，但差异不显著，同时各组间肉鸡血清MDA含量差异不显著。这与上述试验结果不完全一致，说明益生菌种类、添加水平、单菌或复合制剂等都可能影响抗氧化机能的改善作用，需要进一步探究。
4 结论在本试验条件下，饲粮添加高水平的植物乳杆菌能够显著提高大恒肉鸡血清免疫功能，一定程度上增强血清抗氧化功能，对生长性能和屠宰性能无显著影响。
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