在饲料原料消化能或代谢能的计算中，饲粮及粪样的总能(GE)是必需的数据，因此，样品GE的测定精准度直接关系到饲料原料消化能或代谢能的精准度。目前，饲料原料及粪样、尿样的GE均采用氧弹热量计测定，其原理是在氧气充足的条件下，样品充分燃烧释放出的热量使水温升高，从而计算燃烧所产生的热量[1]。然而，不同厂家生产的氧弹热量计在测定过程中往往有各种因素影响燃烧的程度，从而导致测定值存在偏差。蔡阿敏等[2]采用河南产微机全自动氧弹热量计(型号：ZDHW-8000)测定全混合日粮的GE随样品粉碎粒径的减少而增加。这可能是由于样品粒径越小表面积越大[3]，因而与氧气接触越充分，燃烧更彻底。赖建辉等[4]研究结果表明，粪便中不易燃烧的物质含量较高，测定时往往出现不完全燃烧、甚至点火失败的情况。对于不易燃烧的样品，通常添加一定比例的助燃剂，如苯甲酸[1]。然而，Shen等[5]采用上海产等热式氧弹热量计(型号：HR-15)测定稻壳的GE随加入苯甲酸助燃剂的比例不同而有差异。Sibbald等[6]比较了Parr 1241绝热式氧弹热量计在2种模式下测定GE的变异度，发现不同模式之间存在较大差异。从上述影响测定GE的因素看，由于不同的研究者采用的氧弹热量计型号不同，测定的GE可能存在差异。考虑到目前饲料行业使用的氧弹热量计种类较多，仪器在构造、计算原理上均有一定差异，不同型号氧弹热量计测定同一样品GE的差异鲜见相关报道。因此，本研究通过比较我国饲料行业主流使用的2种氧弹热量计在测定饲粮、饲料原料、粪样GE的变异程度及其对饲粮能量消化率计算值的影响，为饲料行业在测定GE或能量消化率差异的比较上提供参考。
1 材料与方法 1.1 饲粮、饲料原料及粪样饲粮1、2及对应的粪样1、2来自于本实验室Gao等[7]的猪消化试验样品，饲粮3、4及对应的粪样3、4来自于党方坤[8]的猪消化试验样品。每个粪样由6头猪的粪样按重量等比例混合而成。玉米、菜籽粕和棉籽粕来源于饲料企业。所有样品用多功能粉碎机(生产厂家：永康市某机电厂；型号：XT-A400)粉碎后过40目方形筛孔，密封后于实验室-20 ℃保存备用。
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表 1 饲粮、饲料原料及粪样的概略养分含量(风干基础) Table 1 Proximate nutrient contents in diets, feed ingredients and feces (air-dry basis) |
采用两样本比较试验设计，考察2种氧弹热量计测定样品GE的日内、日间及总变异系数的差异，以及测定样品及残渣的GE后计算的仿生消化法体外能量消化率的差异。在GE日内与日间变异的测定中，在09:00—21:00，每3 h测定1次样品的GE，共测定4次，累计测定4 d。在仿生消化法饲粮及饲料原料能量消化率的测定中，每个样品的仿生消化设10个重复，未消化残渣绝干后随机分成2组。2种氧弹热量计对饲粮或饲料原料样品GE分别重复测定2次，对每个未消化残渣重复样品的GE测定1次。
1.3 测定指标与方法按GB/T 6435—2014测定样品的水分含量并计算其干物质(dry matter，DM)含量，并根据ISO 9831 : 1998的方法测定饲粮、饲料原料、粪样及经仿生消化系统消化后未水解残渣的GE；以苯甲酸作为标准物标定氧弹热量计的热容量并定标。仿生消化法测定饲粮及饲料原料的酶水解物能值(EHGE)的操作规程参考赵峰等[9]仿生消化法测定猪饲粮EHGE测定技术规程进行。
1.4 数据处理与统计分析采用SAS 9.0的MEANS模块对基本统计量进行分析。根据两样本比较试验设计的原理，用TTEST模块对2种氧弹热量计实测的GE进行差异显著性分析。通过GLM模块首先计算出总平方和、日内(组内)平方和、日间(误差)平方和统计量，再参照蒋红卫等[10]的公式计算GE测定值的日内、日间及总变异系数。对于GE测定值与平均值相差1 000 kcal/g(1 cal≈4.185 9 J)以上视为燃烧不充分，不计入平均值统计。采用FREQ模块的Chisq选项对2种氧弹热量计在点火失败、燃烧不充分及燃烧充分的频次上是否一致进行卡方检验。P < 0.05定义为统计显著性差异。
2 结果与分析 2.1 2种氧弹热量计测定饲粮、饲料原料及粪样GE的差异由表 2可知，在4个饲粮的GE测定中，氧弹热量计型号1比型号2平均值高79~153 cal/g DM(P < 0.05)；在3个饲料原料的GE测定中，氧弹热量计型号1比型号2平均值高64~84 cal/g DM (P < 0.05)。而在4个粪样的GE测定中，氧弹热量计型号1和2在平均值上相差-230~51 cal/g DM，无显著差异(P>0.05)。在点火失败、燃烧不充分及烧热充分次数的分布上，氧弹热量计型号1与型号2有显著差异(P < 0.05)。
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表 2 2种型号氧弹热量计测定样品GE的差异 Table 2 Difference in GE of samples determined with two types of oxygen bomb calorimeter |
由表 3可知，在饲粮1~3的GE测定中，氧弹热量计型号1的日内、日间及总变异系数分别在0.23%~0.38%、0.36%~0.68%和0.41%~0.72%；氧弹热量计型号2的日内、日间及总变异系数分别在0.15%~0.29%、0.25%~0.37%和0.29%~0.44%。在饲粮4的GE测定中，氧弹热量计型号1的日内、日间及总变异系数分别为0.79%、0.59%和0.90%，而氧弹热量计型号2的日内、日间及总变异系数分别为3.50%、2.87%和4.18%。在3个饲料原料的GE测定中，氧弹热量计型号1的日内、日间及总变异系数分别在0.22%~0.76%、0.19%~0.44%和0.29%~0.75%；氧弹热量计型号2的日内、日间及总变异系数分别在0.19%~0.71%、0.15%~0.40%和0.22%~0.71%；2种氧弹热量计在日内、日间及总变异系数的平均值上较接近。在粪样1~4的GE测定中，氧弹热量计型号1的日内、日间及总变异系数分别在1.46%~12.98%、0.74%~4.43%和1.44%~11.67%；氧弹热量计型号2的日内、日间及总变异系数分别在0.35%~1.02%、0.04%~0.36%和0.23%~0.95%；氧弹热量计型号1在日内、日间及总变异系数的平均值上均高于氧弹热量计2。
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表 3 2种型号氧弹热量计测定样品GE的变异系数 Table 3 CV of gross energy in samples determined with two types of oxygen bomb calorimeter |
由表 4可知，在4个饲粮和3个饲料原料未消化残渣GE测定中，氧弹热量计型号1测定的GE均高于氧弹热量计型号2。除2种氧弹热量计测定饲粮1或4未消化残渣GE在统计上差异不显著(P>0.05)外，其他5个样品均有显著差异(P < 0.05)。通过2种氧弹热量计测定样品的GE及未消化残渣GE计算的EHGE，由氧弹热量计型号1测定GE后计算的饲粮3或棉籽粕的EHGE显著低于由氧弹热量计型号2测定GE后计算的EHGE(P < 0.05)，其他5个样品2种氧弹热量计测定GE后计算的EHGE差异不显著(P>0.05)。由氧弹热量计型号1测定饲粮3或3个饲料原料的能量消化率显著低于由氧弹热量计型号2测定GE后计算的能量消化率(P < 0.05)，2种氧弹热量计测定饲粮1、2、4的GE后计算的能量消化率差异不显著(P>0.05)。
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表 4 2种氧弹热量计测定GE的差异而引起饲粮及饲料原料EHGE和能量消化率的差异 Table 4 Differences in EHGE and digestibility of energy in diets and feed ingredients calculated on GE determined with two types of oxygen bomb calorimeter |
不同厂家生产的氧弹热量计在仪器构造、计算方法等方面可能存在差异，然而，在测定过程中样品的粉碎粒径、上样量以及防止燃烧时飞溅的处理方式(如纸包裹、压片、矿物油封闭)可能会影响到GE的测定结果。ISO 9831—1990[1]、德国IKA及美国PARR在氧弹热量计的测定规程中并未对样品的粉碎粒度作要求。Sibbald等[6]在测定玉米、燕麦、鱼粉、肉粉的GE时，粉碎过20目筛。李仲玉等[11]指出PARR 6300氧弹热量计测定样品GE时，样品粉碎过60目筛或稍小并压成片状时燃烧最充分，粒径过大时易出现燃烧不充分。蔡阿敏等[2]的试验结果表明，饲粮样品粉碎过60~100目后测定GE的重复性更好。然而，张丽英[12]在饲料GE的测定中规定样品的粉碎粒径为40目筛。当前，众多鸡代谢试验中饲粮、粪样均粉碎均过0.5 mm筛(30~40目)后测定GE[13-14]，猪代谢试验中饲粮、粪样均粉碎均过1 mm筛(16目)[15-17]，同时也发现，目前一些代谢试验中饲粮、粪样粉碎粒度未明确指出[18-19]。由此可见，不同研究在测定GE时样品粉碎的粒径具有较大的差异。这一差异是否与氧弹热量计的型号有关尚待进一步研究。本试验的粉碎粒径采用目前绝大多数文献报道动物代谢试验对饲粮和粪样普遍粉碎过40目筛的“共识”。在这一粒径下测定的GE与文献数据更具可比性。在上样量对氧弹热量计测定样品GE的影响上，主要受氧弹热量计如水箱的体积、氧弹的热容量等因素的影响。上样量不足，导致测定过程中升温幅度偏低，影响GE的计算结果。上样量过多，容易造成剧烈爆炸而引起样品飞溅。根据操作手册，氧弹热量计在使用之前，均使用苯甲酸作为标准物进行校正，当测定的苯甲酸GE在(6 318±10) cal/g才进行后续测样。此外，IKA C6000氧弹热量计建议样品上样量最多不能超过5 g，热值最好低于约9 560 cal；Parr 6400氧弹热量计建议样品的上样量最好低于0.7 g，最多不能超过1.5 g，样品热值最好低于8 000 cal。本试验测定玉米的GE中，氧弹热量计型号1测定的GE随着上样量的增加(0.2~1.0 g)而下降，而氧弹热量计型号2测定的GE在上样量0.2~0.4 g时随上样量的增加而升高，在0.6~1.0 g时GE趋于稳定(未列出数据)。这一现象与使用型号PARR 6300测定玉米GE时，上样量低于0.5 g，GE略偏低，且多次测定的标准偏差相对较大；上样量为0.7 g，GE较为稳定的结果[20]一致。由此可见，不同型号的氧弹热量计测定的GE受上样量的影响呈现完全不一致的变化规律。这一影响是否受饲料原料不同而有差异，尚需要进一步研究。目前，鲜见文献报道饲料原料的碳水化合物水平是否会影响氧弹热量计对GE的测定值。然而，高纤维样品、高挥发性样品及含氮、硫等元素的样品[12]，会影响GE测定值的准确性。在防止燃烧时样品的飞溅中，美国采用ISO 9831—1990[1]的方法，将粉状样品装入聚乙烯袋中。本实验室通常采用WhatmanTM镜头纸(重量约0.07 g/张)包裹粉状样品。IKA C6000氧弹热量计配套有专门的压片机对粉状样品喷洒少量水后进行压片。然而，不同的防飞溅方式对氧弹热量计测定GE的影响尚鲜见文献报道。
3.2 不同型号氧弹热量计测定样品GE及变异的比较文献鲜见报道2种或2种以上氧弹热量计测定同一样品GE的差异。然而，娄瑞颍等[21]使用IKA C200氧弹热量计测定55个中国玉米的GE平均值为4 579 cal/g DM，变异系数为1.04%。李全丰[22]使用PARR 6400氧弹热量计测定100个中国玉米的GE平均值为4 447 cal/g DM，变异系数为1.01%。上述研究中玉米GE的差异因氧弹热量计型号的不同而贡献了多少尚不清楚，但从本研究的结果看，2种氧弹热量计导致玉米GE的差异达到了84 cal/g DM。在饲粮和其他饲料原料上2种氧弹热量计测定的GE也存在显著差异。而在测定粪样2和4的GE上，虽然2种氧弹热量计测定值差异较大，但统计检验差异不显著。这主要是由于氧弹热量计型号1测定粪样GE的变异系数远高于饲粮及饲料原料测定GE的变异系数，从而导致统计的集合标准误较大，而t值变小。这一现象与D’alfonso等[23]的试验结果类似，其数据表明氧弹热量计重复5次测小麦GE的变异系数为1.40%，而4个鸡排泄物各4次重复测定GE的变异系数在1.21%~12.18%变化。
Sibbald等[6]比较了同一型号氧弹热量计在快速模式和标准模式下测定饲粮、粪样GE比较接近(差值< 12 cal/g)，然而，不同样品在测定日间GE的差异不一致。这表明氧弹热量计在不同测定日间的测定值存在变化。ISO 9831—1990[1]在剔除部分实验室异常测定值数据后，得出测定7类样品GE的重复性变异系数在0.09%~2.10%变化。本试验中，2种氧弹热量计在测定饲粮和饲料原料GE的变异系数(日内、日间及总变异系数)相对接近，而氧弹热量计型号1在测定粪样GE的变异系数远高于氧弹热量计型号2。这主要是由于粪便中粗灰分含量相对于饲粮较高，通常出现燃烧不完全现象[4]。这一结论从氧弹热量计型号1在点火失败、不完全燃烧频率高于氧弹热量计型号2得到佐证。在2种氧弹热量计测定饲粮和未消化残渣GE后计算的EHGE中，由于氧弹热量计型号1测定的所有7个样品的GE和5个样品的未消化残渣GE高于氧弹热量计型号2，因此，由GE测定的差异导致7个样品中3个样品的EHGE计算值和4个样品的能量消化率计算值存在显著差异。这是因为在消化试验中未消化残渣的GE相对于消化前样品的GE占比较小，因此，同一个样品的能量消化率主要受样品GE测定值高低的影响。这一现象与小麦氮校正真代谢能的计算中小麦和排泄物GE测定的方差对真代谢能(TME)的变异分别贡献了48.1%和3.8%的结果[13]相一致。
4 结论2种氧弹热量计在测定饲粮及饲料原料的GE上存在差异，在测定粪便GE的重复性上存在较大的差异。2种氧弹热量计间测定饲粮样品GE的差异引起了部分样品EHGE及能量消化率的差异，但这一差异程度远低于GE测定的差异程度。
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