植物精油(essential oil, EO)是由草本植物的花、叶、根、树皮等通过蒸馏、压榨等方法提取[1-2]，根据其活性成分主要分为4个种类，分别为萜类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物和氮硫化合物[3]，具有抗真菌[4]、抗炎[5-6]、保护肠道屏障[7]等功能。刘娇等[8]研究表明，在大肠杆菌攻毒肉鸭的饲粮中添加200 mg/kg主要成分为香芹酚、χ-萜品醇、伞花烃和百里香酚的精油产品，可不同程度地增加肉鸭体重和平均日增重，降低料重比。吴昊等[9]研究发现，饲粮中添加有效成分为百里香酚、香芹酚、肉桂醛的复合EO可以改善麻黄肉鸡的血清抗氧化能力，并会对其胸肌肉品质产生影响。Su等[10]以爱拔益加(AA)肉鸡为研究对象，评估了有效成分为百里酚、香芹酚和肉桂醛的EO添加量的作用效果，发现EO的添加量对肉鸡生长性能无显著影响；但随EO添加量的增加，饲粮干物质、总能和粗脂肪的消化率显著增加，且空肠绒隐比增加。但Xue等[11]研究发现，饲粮添加100 mg/kg有效成分为桉树油、香芹酚、肉桂醛、辣椒素的EO混合物对肉鸡生长性能、胴体性状、肠道形态均无显著影响。以上研究结果提示，EO的作用效果受EO有效成分、添加量、稳定性、加工工艺及动物种类、年龄等的影响[12-13]。
因传统EO在体外和体内均不稳定，如柠檬草精油、牛至精油等，常温下多处于液体状态，暴露空气中具有易挥发、气味大、适口性差等[14-17]特性，使其在饲料加工制粒、膨化及储存中极其不稳定，影响其在动物体内的效价，且EO中的活性物质易受到空气、光线、水分、温度等[18]外界因素的影响，对环境非常敏感，这使得EO在实际生产中存在很多局限性。为了避免EO的挥发，使其免受高温、氧化和紫外线等外界环境因素的影响[18-19]，有必要对EO进行制剂技术处理。晶体工程技术可以将药物活性成分(active pharmaceutical ingredient, API)与其他配体以氢键、π-π堆积作用、范德华力和其他非共价键相连可控地构筑在同一晶格中[20]，在不改变API结构及生物活性的同时，改善其理化性质，包括提高溶解度和溶出速率，改善化学稳定性、机械性能和生物利用度等[21]。因此，本研究拟以樱桃谷肉鸭为试验动物，通过考察肉鸭生长性能及肠道形态、消化酶活性及抗氧化能力来评估植物精油共晶的作用效果，并通过线性和二次回归分析确定其在肉鸭饲粮中的适宜添加量，为肉鸭饲粮中抗生素替代品的筛选提供理论和技术支撑。
1 材料与方法 1.1 试验材料植物精油共晶为百里香酚和香芹酚1 ∶ 1的结晶，产品有效含量为50%，由上海某药物所提供。
1.2 试验设计采用单因素试验设计，选择480只1日龄樱桃谷肉鸭，随机分为5组，植物精油共晶添加量分别为0(对照)、15、30、60和120 mg/kg，每组6个重复，每个重复16只。试验期35 d，分为前期(1~14日龄)和后期(15~35日龄)2个阶段。试验期间自由采食和饮水。
1.3 试验饲粮及饲养管理基础饲粮参照《肉鸭饲养标准》(NY/T 2122—2012)配制。基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮，其组成及营养水平见表 1。饲粮采用颗粒料，前期颗粒大小为2 mm，后期为3.5 mm。按正常免疫程序进行免疫接种，在相同温度环境中进行笼养。1~3日龄30~32 ℃，4~7日龄28~30 ℃，以后每周降低2 ℃，直到24 ℃，并维持在24 ℃，其他管理按照常规进行。1~14日龄饲养阶段相对湿度维持在60%~70%，以后逐渐下降，15日龄以后维持在55%左右。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
在14和35日龄时，称重后以重复为单位随机选取接近均重的肉鸭1只(n=6)。计重后通过颈部放血屠宰，分离肠段，取空肠中点(约2 cm长)，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，并将其放入10%甲醇中固定，后用于测量空肠组织形态；屠宰分离肠段后即刻挤出剩余空肠中的全部内容物，迅速均匀搅拌后收集的样品即时置于-20 ℃冰箱中冻存，用于后续分析；分离回肠，剖开肠段，用生理盐水将内容物清洗干净，平铺于滤纸上，用载玻片快速刮取其黏膜，并装入2 mL冻存管中，于液氮速冻，-80 ℃保存备用，用于检测抗氧化能力；分离盲肠，收集盲肠食糜，-80 ℃保存备用，用于检测盲肠微生物含量。
1.4.2 指标测定生长性能：记录肉鸭1日龄的体重。在肉鸭14和35日龄时，以重复为单位记录肉鸭体重。肉鸭在称重前，断料8 h，结算余料。计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)。每天观察并记录死亡鸭的只数和体重，计算死亡率，并用死亡率校正F/G。计算公式如下：
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空肠组织形态：将4%多聚甲醛固定的空肠肠段中部进行石蜡包埋切片后，苏木素-伊红(HE)染色封片，使用生物光学显微镜并结合Image-Pro Plus(IPP)图像分析软件进行观察、测量和取图。每个肠道选取6张切片测量绒毛高度(VH)和隐窝深度(CD)，并计算绒隐比(V/C)。
空肠消化酶活性：准确称取空肠食糜重量，按重量(g) ∶体积(mL)=1 ∶ 10比例加入预冷生理盐水，高速研磨仪处理，2 500 r/min离心10 min，取上清再用生理盐水稀释分装，根据试剂盒说明书方法检测脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶活性，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
回肠黏膜抗氧化能力：回肠黏膜中总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)活性和还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量按试剂盒说明书方法检测，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
盲肠菌群：使用粪便基因组DNA提取试剂盒提取冻存于-80 ℃盲肠食糜微生物的总DNA，-20 ℃保存备用。用Nano Drop ND-2000分光光度计检测DNA的完整性、浓度和纯度。根据细菌的16S rRNA基因序列设计沙门氏菌和大肠杆菌的特异性引物及探针，如表 2所示。参照本实验室前期研究[22]，使用Bio-Rad公司CFX96实时定量PCR仪，测定鸭盲肠食糜中大肠杆菌、沙门氏菌和总菌的含量，并用连续标准模板建立标准曲线，以每克内容物为检测单位，通过Ct值与标准曲线计算得出每份样品所含拷贝数。试剂盒购自北京天根生物技术研究所。
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表 2 引物及探针序列 Table 2 Sequences of primes and probes |
试验数据利用SAS 9.2统计软件的one-way ANOVA程序进行方差分析，差异显著时使用Duncan氏法进行多重比较，试验结果以平均值和均值标准误表示，以P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 植物精油共晶添加量对肉鸭生长性能的影响如表 3所示，与对照组相比，饲粮中添加植物精油共晶对肉鸭体重、ADG、ADFI、F/G均无显著影响(P>0.05)，但植物精油共晶线性降低了肉鸭1~14日龄和1~35日龄的死亡率(P < 0.05)。
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表 3 植物精油共晶对肉鸭生长性能的影响 Table 3 Effects of plant essential oil eutectic on growth performance of meat ducks |
如表 4所示，不同添加量的植物精油共晶对肉鸭14日龄的空肠肠道形态(绒毛高度、隐窝深度、绒隐比)均有显著影响(P < 0.05)，与对照组相比，添加60、120 mg/kg的植物精油共晶显著提高了14日龄肉鸭空肠绒毛高度(P < 0.05)，不同添加量植物精油共晶显著提高了14日龄肉鸭空肠隐窝深度(P < 0.05)，同时还显著降低了空肠绒隐比(P < 0.05)，并且随着植物精油添加量的提高，14日龄肉鸭的肠道形态有显著线性和二次曲线变化(P < 0.05)；35日龄时，与对照组相比，饲粮中添加15、60、120 mg/kg的植物精油共晶显著降低了肉鸭空肠绒毛高度(P < 0.05)，不同添加量的植物精油共晶均显著降低了肉鸭空肠隐窝深度(P < 0.05)，且随着植物精油添加量的提高，绒毛高度和隐窝深度有显著线性和二次曲线变化(P < 0.05)，饲粮添加30、60 mg/kg的植物精油共晶显著提高了肉鸭空肠的绒隐比(P < 0.05)。
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表 4 植物精油共晶对肉鸭肠道形态的影响 Table 4 Effects of plant essential oil eutectic on intestinal morphology of meat ducks |
如表 5所示，与对照组相比，饲粮中添加120 mg/kg的植物精油共晶显著提高了肉鸭空肠食糜淀粉酶活性(P < 0.05)，且空肠食糜消化酶(胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶)活性均随植物精油共晶添加量的增加呈线性增加(P < 0.05)，其中空肠食糜脂肪酶和淀粉酶活性有显著二次曲线变化(P < 0.05)。
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表 5 植物精油共晶对35日龄肉鸭空肠食糜消化酶活性的影响 Table 5 Effects of plant essential oil eutectic on digestive enzymes activity of jejunal chyme of meat ducks at 35 days of age |
如表 6所示，与对照组相比，在饲粮中添加60和120 mg/kg的植物精油共晶显著增加了回肠黏膜中MDA含量(P < 0.05)，并随着植物精油共晶添加量的增加呈线性和二次曲线变化(P < 0.05)。与对照组相比，添加30和120 mg/kg植物精油共晶组回肠黏膜MPO含量显著升高(P < 0.05)，随着植物精油添加量的提高，回肠黏膜MPO活性有显著线性和二次曲线变化(P < 0.05)。同时，随植物精油共晶添加量的增加回肠黏膜SOD活性呈线性和二次曲线变化(P < 0.05)。
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表 6 植物精油共晶对35日龄肉鸭回肠黏膜抗氧化能力的影响 Table 6 Effects of plant essential oil eutectic on antioxidant capacity in ileal mucosa of meat ducks at 35 days of age |
如表 7所示，与对照组相比，不同添加量的植物精油共晶对35日龄肉鸭的盲肠食糜微生物总菌、沙门氏菌和大肠杆菌的含量有显著影响(P>0.05)。
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表 7 植物精油共晶对肉鸭盲肠食糜中微生物含量的影响 Table 7 Effects of plant essential oil eutectic on microbial contents in cecal chyme of meat ducks |
本试验结果表明，饲粮中添加植物精油共晶对肉鸭生长性能没有显著影响。Park等[23]在肉鸭上发现，在肉鸭饲粮中添加不同剂量的牛至干粉，生长性能均没有表现出显著差异；Abouelezz等[24]以樱桃谷肉鸭为研究对象，在饲粮中分别添加50、100 mg/kg有效成分为百里酚和香芹酚的牛至精油和150、300 mg/kg有效成分为肉桂醛和百里酚的精油，肉鸭生长性能未发现显著差异，本试验结果与前人研究结果相似。但也有研究表明，在饲粮中添加精油可以一定程度上改善家禽生长性能，如Ruan等[25]研究发现，在饲粮中添加150、300 mg/kg牛至精油，能显著提高黄羽肉鸡30日龄的体重、ADFI和ADG；Youssef等[26]研究发现，在肉鸡生长阶段，即22~42日龄，在饲粮中添加25.0 mg/kg的八角、迷迭香、百里香牛至精油混合物，可显著提高体增重；张晓燕等[27]研究结果表明，混合型EO显著提高了广西灵山土鸡67日龄的体重、37~67日龄的ADG和ADFI。以上研究结果存在较大差异的原因可能是因为精油种类繁多、成分复杂、添加剂量不同以及试验动物的品种、年龄等存在较大差异所致。此外，本试验发现，肉鸭前期和全期死亡率随植物精油共晶添加量的增加而线性降低，但关于精油添加对家禽死亡率的研究报道较少，可能与植物精油共晶能提高肉鸭机体抗氧化或免疫功能有关，但其机理值得进一步研究解析。
3.2 植物精油共晶对肉鸭空肠肠道组织形态的影响在适当范围内，肠绒毛越高，表明肠道对各类养分的消化吸收能力越强，而隐窝深度越浅，表明肠上皮组织分泌消化液的能力越强，但也表示隐窝组织更新能力减慢；绒隐比与肠道的消化吸收功能呈正比例关系[28-29]。本试验中，添加60 mg/kg植物精油共晶组14日龄肉鸭绒毛更长，隐窝更深，隐窝组织更新速度更快，表明植物精油共晶能促进肉鸭生长前期肠道的发育；而35日龄时，肉鸭肠道发育基本稳定，这时植物精油共晶的添加降低了隐窝深度，且添加30 mg/kg植物精油共晶组35日龄肉鸭绒毛高度较其他植物精油共晶添加量组高，隐窝深度较对照组浅，绒隐比最高；添加120 mg/kg植物精油共晶组35日龄肉鸭空肠隐窝深度最低，表明添加一定剂量的植物精油共晶对肠道的消化吸收有益。徐静等[30]发现，在蛋鸡饮水中添加0.06 mL/L的大蒜精油能够明显改善蛋鸡十二指肠、空肠和回肠的组织形态，从而提高饲粮中营养物质的吸收利用效率；江小帆等[28]研究发现，在芦花鸡饲粮中添加有效成分为1.13%牛至油的精油可显著改善回肠和空肠隐窝深度，以及十二指肠绒毛高度；与对照组相比，50、100 mg/kg牛至精油组回肠隐窝深度和空肠隐窝深度分别降低；150 mg/kg牛至精油组十二指肠绒毛高度增加14%，空肠隐窝深度和十二指肠绒毛高度与牛至精油的添加量存在线性和二次曲线关系。以上研究结果提示，精油的添加可以改善家禽肠道形态，提高肠道对饲粮养分的消化吸收能力，从而提高生长性能。虽然本研究中的肠道形态有所改善，但未发挥促生长作用，这可能与植物精油共晶影响了肉鸭肠道消化酶活性和机体抗氧化能力有关。
3.3 植物精油共晶对肉鸭空肠消化酶活性的影响消化酶是具有特殊功能的蛋白质，对底物具有专一性，消化酶的作用主要是取决于酶的活性[31]，胃肠道消化吸收能力依赖消化酶，消化酶活性增强有助于提高胃肠道消化吸收能力。闻爱友等[32]在肉鸡饲粮中分别添加100、200、300 mg/kg柑橘、洋葱、大蒜、薄荷、藏茴香等多种植物中提取的精油复合物发现，21日龄时，100、200、300 mg/kg组肉鸡胰蛋白酶和淀粉酶活性均随添加剂量的增加呈逐渐增加的趋势，且均显著高于对照组；42日龄时，200、300 mg/kg组胰蛋白酶、淀粉酶活性均显著提高；100 mg/kg组淀粉酶活性高于对照组。李红英等[33]以山麻鸭为研究对象，评估了有效成分为百里香酚和肉桂醛的EO添加剂量(50、150、200 mg/kg)的作用效果，发现饲粮中添加精油，显著提高了山麻鸭胰腺胰蛋白酶活性，且脂肪酶活性有提高趋势，饲粮中添加150和200 mg/kg EO显著提高山麻鸭空肠糜蛋白酶活性。Alagawany等[34]在日本鹌鹑上的研究发现，柠檬草精油添加组肠道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性显著提高；但随着柠檬草精油添加量的增加，消化酶活性呈二次曲线变化。在本研究中，植物精油共晶线性增加了肉鸭35日龄空肠食糜脂肪酶和淀粉酶的活性，表明添加植物精油共晶对肉鸭肠道的消化功能有促进作用。
3.4 植物精油共晶对肉鸭回肠抗氧化能力的影响EO含有抗氧化活性成分，具有直接或间接的抗氧化活性[35]。EO发挥抗氧化活性主要是依靠其含量丰富的酚类成分，作用途径主要包括清除自由基、与金属离子螯合、抑制细胞膜脂质过氧化和调节抗氧化酶等[36]。抗氧化酶活性的变化反映了动物机体抗氧化能力的改变。但本研究结果发现，随植物精油共晶添加量的增加，肉鸭回肠黏膜中SOD活性线性降低，而MDA含量和MPO活性线性增加。MDA含量和MPO活性反映了机体氧化损伤的程度[37-38]，MDA的产生能加剧膜的损伤，而MPO主要存在于中性粒细胞和单核细胞中，是白细胞分泌的一种酶，催化形成多种活性氧化剂[39]，说明本试验中肉鸭机体的氧化反应增强，抗氧化能力下降，这与之前研究结果不一致。Zhang等[40]在肉鸡饲粮中分别添加200 mg/kg天然牛至精油和人工合成牛至精油，两者有效百里酚和香芹酚含量及制备工艺相同，对21和42日龄的血清和肠道黏膜中的抗氧化酶活性都有一定的提高，会导致血清、十二指肠和空肠谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和SOD活性以及血清和十二指肠T-AOC和谷胱甘肽还原酶(GR)活性的增加，MDA含量减少。Ruan等[25]以黄羽肉鸡为研究对象，在其饲粮中分别添加150和300 mg/kg的牛至精油发现，150 mg/kg牛至精油显著提高了空肠和回肠中的T-AOC和空肠中的T-SOD活性及回肠GSH-Px活性；300 mg/kg牛至精油显著增加了空肠GSH-Px活性。马伟斌等[41]研究发现，在肉仔鸡饲粮中添加200和300 mg/kg的有效成分为肉桂醛、百里香酚和香芹酚的EO，均可显著提高血清中T-AOC和SOD活性，且精油的添加使血清中的MDA含量降低和GSH-Px活性升高。本试验结果与以上研究结果不一致的原因可能在于植物精油共晶具有较强的氧化还原活性，导致肉鸭回肠黏膜发生剧烈的氧化反应，但肉鸭死亡率有降低，生长性能也未受影响，其具体的原因有待进一步研究。
3.5 植物精油共晶对肉鸭盲肠菌群的影响肠道菌群可以反映肠道的健康状况，大肠杆菌对维持动物体肠道微环境及健康很重要，大幅增加会变成致病菌，沙门氏菌是肠道微生物区系的致病菌[42]。目前，在消杀有害菌的研究中，EO表现出了优良的抑制功能。王改琴等[43]通过体外试验研究发现，香芹酚、肉桂醛、百里香酚和丁香酚具有较好地抑制大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的效果。肠道菌群的类型和数量在体内是始终处于动态变化的，饮食是影响肠道菌群组成和活性最重要的因素之一，精油的选择性抗菌会调节肠道菌群的平衡，改变肠道菌群多样性和相对丰度[44]。张艳雯等[45]研究发现，在高营养和低营养这2个营养水平饲粮中分别添加0和0.2%的精油对肉鸡盲肠微生物总量、乳酸杆菌和大肠杆菌含量均无显著影响。Cetin等[46]研究表明，在饲粮中添加400 mg/kg的精油混合物(主要成分为牛至、迷迭香、茴香精油混合物)能够显著提高肉鸡肠道乳酸菌丰度，且降低了大肠杆菌丰度，100 mg/kg牛至精油和迷迭香精油组，大肠杆菌丰度显著降低。Castañeda-Correa等[47]研究表明，百里香酚能够调节瘤胃微生物的活动，增加有益菌数量，减少甲烷产量，提高饲料利用率。EO能通过促进肠道有益菌生长，抑制有害菌生长，改善肠道菌群平衡，从而保证其消化吸收能力的发挥。但本研究发现，在饲粮中添加植物精油共晶对肉鸭盲肠食糜中的总菌、大肠杆菌和沙门氏菌的含量均无显著影响，表明该植物精油共晶在抑菌能力方面并未表现出优势。
4 结论在本试验条件下，植物精油共晶作用效果具有剂量依赖性，且不同生物学标识对剂量反应的效果不一致，需以不同生物学标识推荐适宜添加量。以生长性能、空肠肠道形态和回肠黏膜抗氧化能力为标识，建议肉鸭生长前期(1~14日龄)饲粮添加60 mg/kg植物精油共晶，后期(15~35日龄)饲粮添加30 mg/kg植物精油共晶。以肉鸭死亡率和空肠消化酶活性为标识，推荐肉鸭饲粮添加120 mg/kg植物精油共晶。
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