“健康”的氧化还原状态对于维持细胞稳态至关重要。氧化应激(oxidative stress，OxS)是指机体产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)的量超过抗氧化剂解毒能力的一种特殊情况[1]，通俗地讲，就是指体内抗氧化系统失衡后，倾向于氧化的一种病理状态。肝脏是许多物质进行氧化代谢的中心，因此肝脏是OxS诱导机体损伤的主要靶标[2]。诱导肝脏发生OxS的因素有很多，例如酒精、环境污染物、药物、辐射和温度等[3]，这些不利因素使机体的抗氧化系统失衡，引发OxS，加剧肝脏氧化性损伤，从而导致肝脏疾病的发生，如典型的非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)。
NAFLD是一种在临床上极为常见的病理性疾病，是其他慢性肝病的主要诱因[4]。其特征是在没有过量饮酒(一般指女性 < 20 g/d，男性 < 30 g/d)、病毒感染或可诱导脂质变性药物存在的情况下，肝细胞中出现大量的脂质堆积——主要为甘油三酯(TG)。通常在超过5%的肝细胞内检测到脂质液滴，就定义为NAFLD[5-6]。NAFLD涵盖的范围较广，从最初的脂肪变性、非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatosis hepatitis，NASH)发展到肝纤维化，最后发展成肝硬化和肝细胞癌[1]。
在过去的40年里，NAFLD已经发展成为全球最为常见的慢性肝病，发病率高达25.2%[7]；在全球的2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)患者中，NASH的患病率就高达37.3%[8]，俨然已成为全球面临的一个公共卫生问题。NAFLD患者往往会伴随肥胖、T2DM、高脂血症以及胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)等代谢综合征的出现[9-10]。在肝细胞中脂质的过度积累会使机体自由基过饱和，导致脂质代谢发生紊乱，进而引发肝细胞氧化损伤[11]、线粒体功能障碍并诱导内质网应激的发生，进一步加重肝脏炎症和肝细胞纤维化[12]。本文重点综述了OxS诱导NAFLD发病的作用机制、脂质代谢紊乱与OxS之间的联系以及一些治疗NAFLD的新兴药物，并提出了防治NAFLD潜在的分子靶点，旨在为今后防控围产期奶牛能量负平衡等特殊生理状态引起的代谢疾病，以及为畜牧养殖及科学研究工作提供参考依据。
1 诱导肝脏发生OxS的因素 1.1 自由基OxS发生在机体抗氧化系统失衡时，它的发生伴随着ROS在机体中的大量蓄积。在正常条件下，ROS具有调节生长发育、传导氧化还原信号等多种正面生理功能[13]。ROS的种类很多，包括过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2-·)和羟基自由基(·OH)，其中羟基自由基的反应性最强，可以入侵几乎所有的生物分子，诱导脂质过氧化并使DNA双链发生断裂，是ROS中最具破坏性的一类[14]。自由基是共价键均裂后形成的具有不成对电子的原子或基团[15]。自由基的来源主要有2种，分为外源性和内源性。其内源性来源主要是线粒体呼吸链酶、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)、黄嘌呤氧化酶(XO)和一氧化氮合成酶(NOS)等。此外，具有氧化还原活性的金属如铁、铜等，也可以通过催化H2O2分解来产生自由基(Fenton反应)[16]。随着对自由基研究的逐步深入，科学家们逐渐意识到了自由基对机体具有的一些重要功能。清除机体多余的自由基可以预防和治疗某些疾病，如衰老和代谢综合征[16]。OxS是自由基代谢出现异常时在体内产生的一种负面效应，会对人体健康造成一定的损害。
生物体内的重要物质均处于动态平衡之中，自由基也不例外。自由基本身是机体正常的代谢产物，并且是维持多种重要生理功能的物质基础。在生理情况下，机体正常运作的关键就在于其强大的自由基动态稳衡机制。该机制的主要任务是清除体内过量的自由基，但不会消除其对机体的有益作用[15]。具体而言就是在需氧生物体内，自由基的水平既要满足自由基履行其基本生理功能的需要，又要能够被抗氧化系统所清除，而未清除掉的自由基对重要生物分子的损伤又可以被修复，即使在细胞出现严重损伤的情况下，还可以通过凋亡途径被清除，不会给机体造成较大的危害[16]。此外，由一系列酶和非酶物质组成的抗氧化防御系统也在维持肝脏稳态上发挥了极为重要的作用，其酶系统主要包括过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)；非酶系统则包括α生育酚(维生素E)、抗坏血酸(维生素C)、谷胱甘肽(GSH)、类胡萝卜素、类黄酮和其他类型的抗氧化剂，如血红素加氧酶-1(HO-1)和氧化还原蛋白等。
1.2 NAFLD的ROS来源 1.2.1 内质网内质网是一个精细的小管网络，在细胞中执行多种生物功能[17]。在内质网中，催化内质网氧化还原酶1(Ero1)和NOX的过程会产生大量ROS[18]。有研究表明，患有高同型半胱氨酸血症(HHcy)的小鼠，其脂肪组织中内质网氧化还原酶1α(Ero1α)的表达被上调，并加速H2O2的积累，诱导内质网过氧化和内质网应激，从而导致NAFLD的发生[19]。NOX是机体产生ROS的主要酶，并且在内质网应激期间，NOX产生的ROS含量会显著增加[20]。其中NOX4已被证明是NAFLD中ROS的最主要来源[21]。
1.2.2 线粒体线粒体是哺乳动物细胞中ROS的重要来源[22]。在线粒体电子传递链的氧化磷酸化过程中会产生大量的ROS[23]。细胞在出现缺氧或有毒素侵害时，会诱导应激的发生，此时大量的ROS会被迅速释放到细胞质中，导致细胞出现氧化损伤[24]。此外，钙离子(Ca2+)超负荷也会导致线粒体ROS的产生。众所周知，Ca2+是细胞内重要的第2信使，细胞的多项生理功能都受到的Ca2+的调控。线粒体中的Ca2+还参与诱导生物体最直接的能量来源——ATP的生成，并且还能诱导细胞发生凋亡。但在Ca2+超载时会影响到线粒体功能的正常行使，使线粒体ROS含量上升[18]，从而促使NAFLD的发生。
1.2.3 过氧化物酶体过氧化物酶体是一种细胞器，存在于一切真核细胞中，并含有丰富的酶类，在肝细胞中的数量较多[25]。过氧化物酶体可以参与脂肪酸的α氧化、超长链脂肪酸的β氧化、胆汁酸和TG的生物合成以及嘌呤的分解代谢[25]，与肝脂质稳态的调节密切相关。过氧化物酶体通过脂肪酸β氧化产生乙酰辅酶A，其在脂质信号的传导过程发挥作用来促进脂质的自噬反应[26]。据估计，过氧化物酶体贡献了细胞中约35%的ROS[27]，产生的过量ROS有助于NAFLD的发展。
2 NAFLD中的抗氧化平衡机制NAFLD能从简单的脂肪变性发展到脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌等多种疾病，对人类的身体健康造成巨大威胁[28]。Day等[29]提出的“二次打击”理论为NAFLD的发病机制提供了可靠的参考依据。Tilg等[30]指出，IR是引发NAFLD的首要因素，这是由于IR会引发肝脏的能量代谢障碍，尤其是影响脂肪酸的β氧化以及脂质从头合成和极低密度脂蛋白(VLDL)的合成，它们与过量的游离脂肪酸(FFA)一起运送到肝脏，致使肝脏出现大量的脂肪堆积和脂质的过氧化[31](FFA输送到肝脏的量几乎占其脂质积累的2/3)，从而导致脂肪变性[32]，这通常作为NAFLD发病的“第一击”。而OxS通常作为NAFLD发病的“第二击”[29]。OxS通常伴随大量的ROS，ROS能够使线粒体呼吸链酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)失活，抑制膜上的Ca2+通道，诱导肝细胞发生损伤；此外，ROS还能诱导细胞因子和Fas及其配体的产生，加重脂质过氧化，从而加重肝脏炎症和肝细胞纤维化[33]。近些年，人们在这些传统理论的基础上，针对NAFLD的发病机理进行了补充，提出了一种新的“多次平行命中”假说，该假说指出，除了IR和OxS之外，在NAFLD发展过程中还存在其他的一些致病因素，包括轻度的慢性炎症、遗传和表观遗传造成的突变以及可能来自肠道菌群等的影响因素，这些因素可能与NAFLD中代谢综合征的出现有密切的关联[30]。
2.1 核因子E2相关因子2(Nrf2)在NAFLD中的作用 2.1.1 Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)-Nrf2-抗氧化反应元件(ARE)抗氧化通路概述当肝脏暴露于高含量的ROS或亲电试剂时，极易发生氧化损伤，此时机体不仅会启动一系列抗氧化防御机制来清除杂物，还会诱导一系列抗氧化转录因子的激活[34]，其中，Nrf2在响应细胞OxS时发挥了最关键的作用[35]。Nrf2含有高度保守的碱性亮氨酸拉链结构[36]，通常与其负调控因子Keap1结合来发挥抗氧化功能[37]。Keap1是一种同源二聚体蛋白，存在于细胞质中，富含高度保守的半胱氨酸序列，与哺乳动物的序列同源性高达92%[38]。同时Keap1还是E3泛素连接酶的底物衔接蛋白，在稳态条件下，Keap1和E3泛素连接酶形成Keap1-E3复合物，Nrf2被该复合物锚定在细胞质中，随后该复合物靶向攻击Nrf2 N端的多个赖氨酸残基，接着E3泛素连接酶使Nrf2发生泛素化，被泛素化的Nrf2被26S蛋白酶体降解，使胞质中的Nrf2始终处于一个较低的水平[39-41]。当细胞内ROS含量上升或有亲电试剂进攻时，Keap1的半胱氨酸残基会被氧化修饰，导致Keap1失活，Nrf2与Keap1发生解离，从而阻断Nrf2的泛素化降解途径，并使其易位至细胞核中[42-43]。在细胞核中Nrf2与小Maf(sMaf)蛋白家族的成员发生异源二聚化，形成的Nrf2-sMaf二聚体以序列特异性的方式，与Nrf2下游靶基因启动区域的ARE结合，启动一系列抗氧化和解毒酶基因的转录[44-45]。Nrf2在细胞核中发挥其作用后，会被酪氨酸激酶磷酸化，促进Nrf2的核输出和在胞质中的降解[46]。
肝脏是负责机体解毒和异种生物代谢的重要器官，具有全面系统的抗氧化防御机制。Keap1-Nrf2-ARE通路是肝脏发生OxS时维持细胞稳态的主要途径，其功能是保护细胞免受由OxS引起的内源性和外源性损伤。当Nrf2在细胞核中大量积累时，会导致大量的抗氧化和Ⅱ期解毒酶基因的上调。先前的研究鉴定出了在人类细胞中的200多个受Nrf2调控的下游靶基因[47]，例如NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1)、HO-1、GST、GSH-Px、CAT、SOD及谷胱甘肽还原酶(GR)等[48]。Nrf2能够通过控制谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基(GCLM)的表达来维持细胞内适当的GSH与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的比值，这2种蛋白共同催化GSH合成途径中的限速步骤[49]。除调节GSH的水平外，Nrf2还正向调控了一些肝脏解毒过程中相关酶基因的表达，包括硫氧还蛋白1(Txn1)、硫氧还蛋白还原酶1(Txnrd1)、磺胺毒素1(Srxn1)[50]、谷胱甘肽过氧化物酶2(Gpx2)和GST[51]，这些解毒酶可以消除细胞质、内质网、线粒体中的H2O2、氧化硫醇和过氧自由基[52]。在许多抗氧化系统中NADPH被用作辅助因子，它的产生也受到Nrf2的调控。磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)是细胞中NADPH的主要来源[53]，多种PPP关键酶的转录都受到Nrf2的直接调控，包括氧化性的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)和磷酸葡萄糖酸脱氢酶(PGD)，以及非氧化性的转醛缩酶1(TALDO1)和转酮醇酶(TKT)[54]。另外，Nrf2与核中sMaf形成的二聚体复合物还在调节机体炎症反应、细胞自噬以及蛋白酶体活性等方面发挥了重要作用[55]。
2.1.2 Nrf2是治疗NAFLD的潜在靶点NAFLD主要表现为肝脏中TG的过量积累。Nrf2可以通过参与脂质代谢来减轻肝脏的氧化损伤[52]。Nrf2介导的脂质代谢与细胞所处的环境以及类型有关[56]。先前的一项微阵列研究的结果显示，无论是从遗传学还是药理学途径激活Nrf2，均会导致抗氧化和药物代谢以外的途径被激活，其中包括了脂质代谢的途径[56]。Shin等[57]研究发现，在喂食了高脂饮食(HFD)12周的小鼠中，肝脏Nrf2的表达显著升高；与野生型的HFD小鼠相比，Nrf2敲除小鼠的肝脏TG含量显著上升。Tanaka等[58]研究发现，在喂食HFD的小鼠中，参与肝脏脂质分解途径的脂肪酸β氧化相关基因的表达显著下调。Yates等[59]在肝脏特异性Keap1敲除的小鼠中发现肝脏的FFA和TG含量显著降低。此外，有研究发现，Nrf2的激活会抑制参与脂肪酸合成的关键酶的表达，从而缓解肝脏脂肪变性[60]。这些结果都表明了Nrf2诱导的基因转录与脂肪合成之间呈现显著的负相关，Nrf2的激活可能会减少FFA的合成和脂质积累。Nrf2还可以激活细胞中的脂质转运受体蛋白——分化簇36(CD36)来调节脂质代谢[61]。
Nrf2的激活可以改善缺乏蛋氨酸和胆碱(MCD)饮食所诱导的脂肪肝，抑制小鼠肝脏中成纤维细胞生长因子21(FGF21)和过氧化物酶体增殖物活化受体α(PPARα)的表达[62]，而Nrf2敲除后显著上调了PPARα的表达[63]，这表明小鼠肝脏中Nrf2的过表达可以防止由于长期暴露于MCD而引发的OxS。Nrf2还在预防NASH中发挥了重要作用，已有研究表明激活肝脏Nrf2会降低NASH的发生率。NASH患者的数据显示，其肝脏中Nrf2的核蛋白丰度增加，并伴随着HO-1、Gpx2和Txn1等抗氧化基因的表达上调[64]。Tang等[65]报道，Nrf2敲除的小鼠在喂食了HFD或MCD饮食后，患NASH的概率增加。综上所述，Nrf2在抵御肝脏的氧化性损伤中发挥了至关重要的作用，可作为治疗NAFLD的潜在靶点。目前，一些科学研究集中在激活Nrf2的新型化合物的开发上，这对于预防和治疗NAFLD具有重大意义。
2.2 核因子-κB(NF-κB)在NAFLD中的作用 2.2.1 NF-κB炎症反应通路概述NF-κB是一类蛋白质家族，由一系列转录因子组成，可以调节大量与免疫和炎症相关基因的表达[66]。大量研究表明，NF-κB可以在几乎所有的细胞类型和组织中表达，以帮助细胞适应外部环境的变化。在机体面临不同的外部刺激，如细胞因子、病毒、重金属、辐射和活性氧刺激时，NF-κB会被正向激活，它调控的基因在免疫和应激反应中发挥了重要的作用，并且还对细胞发育、分化、增殖和凋亡的过程产生一定的影响[67]。
NF-κB蛋白家族由5个成员组成，它们相互关联形成了具有不同转录活性的同源或异源二聚体复合物[68]。NF-κB抑制蛋白(IκB)是NF-κB的特异性抑制剂，在无外界刺激的情况下，IκB与NF-κB结合成二聚体，以无活性的形式存在于细胞质基质中，从而阻断了NF-κB的核易位[69]。当细胞中出现大量自由基和炎症因子后，会激活IκB激酶(IKK)复合物，随后IκB被IKK磷酸化，进而被26S蛋白酶体降解，导致IκB对NF-κB的抑制作用解除，从而使NF-κB发生核易位并开启下游靶基因的转录，最终导致大量炎症因子如白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(INF-γ)的产生和释放[70]。
2.2.2 NF-κB是治疗NAFLD的潜在靶点NF-κB可以调控OxS和炎症反应中一些关键因子的表达，故可作为慢性肝病的潜在治疗靶点。NF-κB可以抑制肝脏ROS的产生和促进细胞自噬来发挥抗氧化功能[71]。NF-κB是一种对OxS敏感的转录因子。在NAFLD中，ROS通过提高促炎细胞因子TNF-α的表达来促进NF-κB激活，而N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)(GSH的合成前体)等抗氧化剂的存在则会抑制NF-κB的活性[72]。此外，激活NF-κB还可以上调一系列抗氧化剂的表达，如锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、铁蛋白重链(FHC)、CAT、NQO1、GST、Txn1和硫氧还蛋白2(Txn2)，其中MnSOD受NF-κB的调控作用最为明显[73]。故NF-κB可为NAFLD的治疗提供一定的参考靶点。
NF-κB与Nrf2通路之间还存在相互影响和制约。一般情况下，NF-κB会与Nrf2竞争细胞核中环状单磷酸腺苷反应元件(CREB)结合蛋白(CBP)-p300复合物的结合位点，转录因子与该复合物的结合取决于易位到核中的NF-κB与Nrf2的相对含量[74]。若NF-κB与该复合物结合，则会抑制Nrf2途径的激活[74]。Jin等[75]研究发现，与野生型的Nrf2小鼠相比，Nrf2敲除的小鼠显示出更高的NF-κB活性。此外，Zhang等[76]和Song等[77]通过添加不同的抗氧化剂，以体内和体外的途径激活Nrf2后，抑制了NF-κB信号通路的激活，以此缓解了由OxS引发的炎症反应。还有研究发现，在喂食了HFD的大鼠中，添加抗氧化剂知母皂甙有助于激活Nrf2，抑制NF-κB通路，以此降低肝脏丙二醛(MDA)含量并提高GSH-Px活性，改善大鼠的OxS，从而缓解大鼠的肝损伤[78]。这些结果说明，在肝细胞发生氧化损伤时，NF-κB和Nrf2之间的相互串扰可以发挥缓解OxS的作用，因此可以作为治疗NAFLD的潜在分子靶点。
2.3 NAFLD中OxS和脂质代谢的相互作用机制在正常的生理条件下，肝脏维持脂质稳态是通过摄取膳食来源的脂肪酸和合成TG来实现的。FFA不仅为肝脏提供能量，还可以酯化生成TG，用于脂质储备或合成VLDL并转运至血液中。脂肪酸氧化主要发生在线粒体中，少部分发生在过氧化物酶体和内质网[79]。脂肪酸氧化过程由线粒体上不同的膜蛋白(肉碱酰基转移酶、肉碱棕榈酰转移酶和肉碱酰基肉碱转移酶)和左旋肉碱介导。有学者发现，在NAFLD患者中左旋肉碱的水平有所降低，进而阻碍了脂肪酸氧化和三羧酸循环(TCA)，导致线粒体功能受损并伴随大量ROS的产生[80]。有证据表明，给T2DM引起的NAFLD患者补充左旋肉碱后，可改善肝脏的脂肪变性，并通过促进脂肪酸氧化恢复了肝脏线粒体的功能[81]。
当机体产生ROS的量超出人体正常需求时，就会引发OxS，从而加速NAFLD的发生。单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)调节多种细胞代谢途径，可以抑制脂质代谢相关酶如乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和转录因子如甾醇调节元件结合蛋白(SREBP)、PPARα和过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)的活性，有利于减轻肝脂质积累并促进脂肪酸氧化[82]。过表达SREBP-1c也会提高肝细胞中的ROS含量，并激活NF-κB炎症途径，从而增加肝脏脂质合成[83]。
ROS在机体肝脏大量积累时，会导致肝脏脂质毒性的产生。ROS的毒性体现在其可以与肝细胞的脂质相互作用形成大量的醛，尤其是MDA和4-羟基壬烯醛(HNE)。MDA和HNE与ROS相比，具有更长的半衰期，并且能够破坏较远端的细胞结构和组织[84]。更确切地说，MDA和HNE可以靶向攻击线粒体膜上的多不饱和脂肪酸(PUFA)[85-86]，而PUFA主要用于线粒体呼吸链上复合物的正确组装。最终，大量醛的产生会导致线粒体功能紊乱，损害到细胞呼吸。此外，MDA和HNE还能够促进载脂蛋白B(ApoB)的水解，减少VLDL的分泌，从而加重已经存在的肝脏脂肪变性[86]。因此，线粒体功能的维持对于减少NAFLD患者的肝脏脂肪变性是至关重要的。
NAFLD发病过程伴随着OxS和炎症反应的出现，在此过程中，肝细胞是响应OxS的主要实质细胞。此外，肝脏中的一些非实质细胞(NPC)，如肝星状细胞(HSCs)、枯否细胞(KCs)和肝窦内皮细胞(LSECs)也会响应OxS，并与之发生作用[87]。OxS会激活KCs介导的炎症通路，增加促炎细胞因子(如TNF-α)的释放；OxS和脂质过氧化可以激活HSCs，诱导肝纤维化的发生；此外，脂质毒性诱导的OxS还可以直接杀死LSECs。这些NPC相互作用，共同促进肝细胞损伤和肝纤维化的发生[88]。
3 奶牛脂肪肝的形成与OxS的关系在奶牛产业中，脂肪肝是一种常见的营养代谢性疾病，主要发生在高产奶牛的泌乳初期。在这期间，奶牛由于妊娠和泌乳的能量需求增加，但产后干物质采食量相对不足，极易出现能量负平衡[89]。在这种状态下，动员体脂是奶牛机体获取能量的重要方式，此过程会产生大量的非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acid，NEFA)进入肝脏，进行氧化代谢并供能。NEFA在肝脏中除了氧化成酮体外，还会生成大量的TG。TG积累过多不能及时被VLDL转运出肝脏时，会导致肝脏被脂肪浸润，严重时形成脂肪肝[90]。同时，动员体脂产生的NEFA经过线粒体氧化后，会产生大量的自由基，打破机体自由基的动态稳衡，使奶牛发生OxS。持续的OxS又会通过产生大量的ROS诱导脂质过氧化，继而引起线粒体损伤并诱发细胞凋亡。OxS还会对奶牛的免疫及其他细胞产生氧化性损伤，使其免疫功能降低，这也是围产期奶牛易感染多种疾病的主要原因[91]。奶牛脂肪肝是典型的NAFLD，都伴随着炎症、OxS、内质网应激和糖脂代谢紊乱等问题，导致奶牛体况、繁殖能力以及产奶量的下降，极大制约了我国奶牛的高效生产。
孙菲菲[91]在NEFA诱导的LO2脂肪肝细胞模型中，通过添加胆碱和蛋氨酸，发现这2种营养素可以上调Nrf2及其下游抗氧化酶的基因和蛋白表达量，减少TNF-α的含量及自由基的产生和积累，增强肝细胞的抗氧化和免疫能力并维持肝细胞的正常代谢。宋玉祥[92]也证明高浓度的NEFA可以造成奶牛肝脏的氧化性损伤，并通过线粒体诱导的ROS-c-Jun氨基末端激酶(JNK)/细胞外信号调节激酶(ERK)通路诱导肝细胞凋亡。马向明等[93]和朱勇[94]在奶牛饲粮中分别添加适量的维生素A和微生物源性的抗氧化剂，发现二者都能显著增强奶牛的抗氧化能力，并能提高奶牛的奶产量和乳品质。综上可知，在畜牧生产中可以通过靶向OxS潜在调控位点来治疗围产期奶牛的代谢性疾病。
4 抗氧化剂治疗NAFLD各种试验和临床的数据表明OxS与NAFLD密切相关，并且有证据表明抗氧化剂可以预防NAFLD或NASH的发生[95]。许多天然化合物都表现出或多或少的抗氧化功能，并且可以对一些慢性肝病起到防治的作用，包括NAFLD。
4.1 经典的抗氧化剂——维生素C和维生素E维生素C和维生素E是经典的抗氧化分子，通过清除体内过多的自由基来防止OxS的发生。近些年，维生素逐渐被建议作为NAFLD的潜在治疗药物，并且有研究发现，维生素C和维生素E的组合添加更有益于缓解NAFLD和NASH[95]。
维生素E是一种脂溶性维生素，在脂肪组织和肝脏中蓄积较多。Nan等[96]研究发现，维生素E通过缓解肝脏OxS和抑制肝细胞凋亡，达到预防NAFLD加重的效果。维生素E是生育酚类物质的总称，其中α生育酚的含量最高，生理活性也最高[97]。α生育酚可以直接清除机体多余的ROS，调节抗氧化反应并增强抗氧化酶的表达，如SOD、GSH-Px和CAT等[98]。Raso等[99]在HFD诱导的肥胖大鼠模型中补充维生素E，能够降低血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性，降低血清MDA含量，从而一定程度上缓解肝脏的脂质积累和过氧化。
在不同的试验模型中发现，维生素E的抗氧化作用与Nrf2的活性调节有关[100]，但这一作用在NAFLD模型中尚未得到充分验证。Fang等[101]研究发现，金属镉诱导小鼠发生氧化性肝损伤后，添加维生素E可减轻损伤症状，这种保护作用与OxS的抑制和Nrf2的激活有关。此外，添加维生素E还可以激活Nrf2/CRISPR相关蛋白1(Cas1)途径，减少高糖饮食诱导的NAFLD小鼠的脂肪变性[102]。在未来的研究中，还需要进一步探索维生素E对Nrf2的激活作用以及维生素E在NAFLD中的治疗潜力。
维生素C又称抗坏血酸，是一种水溶性维生素。人体不能合成维生素C，必须从饮食中才能获取，膳食中摄入不足则会导致维生素C的缺乏[95]。目前，维生素C治疗NAFLD的机制尚不完全明确。当维生素C缺乏时，会导致各种抗氧化酶的活性和表达量降低，同时OxS的标志物含量升高[95]。Valdecantos等[103]的试验证明，维生素C可以减少离体的大鼠肝脏中线粒体ROS的产生，并增强线粒体中GSH-Px和MnSOD的活性。在HFD饮食诱导的NAFLD模型中，补充抗坏血酸可以提高PPARα和调控脂肪酸β氧化相关酶的基因表达，减轻肝脏脂质过氧化、炎症和细胞凋亡等[95]。Rezazadeh等[104]通过给大鼠喂食MCD饮食10周后，再添加维生素C，发现肝细胞的肿胀情况和炎症反应以及OxS的标志物有显著减少，肝脏SOD和CAT等抗氧化酶活性提高，但对于肝脏脂肪变性却没有显著的改善。并且在某些情况下，维生素C在NASH中不一定能发挥其疗效[105]。故维生素C减缓NAFLD或NASH的具体机制，以及维生素C在NAFLD或NASH的治疗潜力还有待进一步的探索和阐明。
4.2 二甲双胍二甲双胍(N，N-二甲基双胍)属于双胍类抗糖尿病药物。在临床上，二甲双胍一直用于治疗T2DM。患有T2DM的人往往也伴随着NAFLD的发生。近年来有研究发现，二甲双胍可能有助于缓解NAFLD[106]。Zhou等[107]用二甲双胍(50或100 mg/kg)治疗肥胖小鼠4周后，下调了肝脏中载脂蛋白A5(ApoA5)的表达量，此类蛋白对调节肝脏脂滴的形成和TG代谢至关重要。此外，Zhang等[108]的试验证明了二甲双胍可以通过上调HO-1的表达和抑制JNK途径，来保护大鼠肝细胞免受OxS诱导的细胞凋亡。Brandt等[109]的研究结果表明，二甲双胍治疗可以激活AMPK途径来促进细胞自噬，并抑制SREBP-1c表达来调节肝脏脂质代谢，缓解肝脏脂肪变性。而且AMPK活化后，可以将Nrf2的抑制剂——糖原合酶激酶(GSK)磷酸化，以此来间接激活Nrf2[110]。用HFD喂养的小鼠用二甲双胍治疗后，可以降低肝脏低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)含量以及血清AST和ALT活性，缓解肝细胞的氧化损伤[111]。因此，二甲双胍可能有助于预防和/或治疗NAFLD，但对其具体的调节机制和分子靶点还需要进行进一步的研究。
4.3 姜黄素姜黄素(二次异丙酰甲烷)是一种酚类化合物，来源于植物姜黄的根茎，是姜黄的主要活性成分。在食品和纺织工业中，姜黄素被广泛用作着色剂和膳食香料。作为一种天然多酚，姜黄素具有很强的抗炎、抗氧化和抗癌特性[112]。姜黄素结构中含有多种和抗氧化相关的功能基团，包括碳-碳双键、β-二酮基团和苯基环，能够清除细胞膜中的脂质自由基，是很强的脂溶性抗氧化剂[113]。姜黄素对各种疾病和癌症的预防和治疗特性已在许多研究中得到证实。据报道，这种化合物还在NAFLD的治疗和肝脏脂质代谢中发挥了重要作用[114]。在用HFD喂养的肥胖小鼠中，加入膳食姜黄素，可以改善线粒体的生物合成，下调SREBP-1和羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶基因的表达，从而降低肝脏TG含量[103]。Ramirez-Tortosa等[115]研究发现，给用HFD饲喂的家兔补充膳食姜黄素后，减少了肝脏的炎症、纤维化和脂肪变性，这归因于姜黄素使线粒体产生的ROS下降并改善了线粒体的功能。这些结果说明了在大多数情况下，姜黄素治疗NAFLD可能是通过恢复线粒体功能来实现的。Xiong等[116]指出，姜黄素能够通过激活Nrf2和ERK/p38-MAPK等抗氧化信号通路，上调解毒酶(如NQO1、HO-1和GCLC)基因的表达，以此来缓解肝脏的OxS。此外姜黄素还可以抑制NF-κB的核易位，从而防止NASH和肝损伤的发生[117]。尽管有证据表明，姜黄素有巨大的潜力缓解肝氧化损伤，但这方面的研究仍然不够全面和系统。因此，还需要进一步研究姜黄素在肝保护过程中的分子、细胞和生理机制，来确定其对NAFLD的治疗潜力。
4.4 类黄酮类黄酮是一组天然的膳食抗氧化剂，普遍存在于蔬菜、水果和一些植物中[118]。类黄酮结构中的酚醛羟基是负责其抗氧化活性的主要功能基团。类黄酮家族通过多种机制发挥其抗氧化作用，可以帮助机体清除过多的ROS，例如超氧化物、H2O2、羟基自由基和过氧亚硝酸盐等[119]。已经鉴定出自然界中存在1 000多种天然的类黄酮，其中一些对人类健康能够发挥有益作用。
槲皮素是一种典型的类黄酮。研究表明，槲皮素可以通过抑制脂肪合成基因如脂肪酸合酶(FAS)和SREBP-1c的表达水平来改善肝脂质积累和内质网应激[120]。Jung等[121]的试验结果显示，在用HFD喂养的肥胖小鼠中，用槲皮素治疗后许多与脂质代谢相关基因的表达发生了改变。在T2DM诱导的NAFLD模型中，槲皮素治疗降低了血清中AST、ALT等转氨酶的活性，提高了肝脏中CAT、SOD活性以及GSH含量；此外，在用FFA和高水平D-葡萄糖联合培养的人肝癌细胞HepG2模型中，槲皮素治疗可以减少脂质液滴并下调肝细胞中TG和总胆固醇水平，其机制主要涉及Nrf2下游抗氧化酶表达水平的上调、NF-κB的抑制和血清白细胞介素-18(IL-18)含量的降低[122]。此外，白藜芦醇也是一种典型的类黄酮，研究已经证明白藜芦醇可以上调抗氧化酶的活性和减少OxS来预防肝脏脂肪变性，是良好的抗氧化剂[123]。白藜芦醇可以上调肝线粒体内膜上的阴离子转运蛋白——解偶联蛋白2(UCP-2)表达，而UCP-2能降低线粒体膜上的电化学梯度并增加线粒体数量，从而缓解HFD诱发的线粒体功能障碍[124]。口服白藜芦醇能够通过调节Nrf2和抗氧化剂(包括GSH、SOD、CAT和维生素C)来减少脂质过氧化，从而缓解肝脏的OxS[125]。总之，类黄酮等一系列多酚物质可以作为肝脏代谢相关疾病的潜在治疗药物，应在未来的科学研究和临床治疗上多加开发和利用。
5 小结NAFLD的发病过程涉及到几种破坏肝脂质稳态的机制，其中OxS在这种疾病的发病机制中起着核心作用。调节机体的氧化还原平衡对于维持肝脏脂质稳态是极为重要的。氧化还原平衡的改变会影响到一些与代谢相关的细胞器的功能，导致细胞脂质毒性、脂质过氧化、线粒体功能紊乱和内质网应激。
近年来，越来越多的研究结果证明了抗氧化剂对NAFLD有潜在的治疗效果，其机制主要涉及到Nrf2抗氧化通路的激活和NF-κB炎症通路的抑制。此外，可能还存在一些未知的肝保护信号通路有待人们去发现和挖掘。天然的膳食化合物，如咖啡因和橙皮素等具有抗氧化性能，且不会对机体产生毒害作用，是治疗NAFLD的潜力药物。然而，相关的研究仅限于评估肝损伤水平和血液中的OxS、免疫等指标和检查肝脏的组织病理学或免疫组化结果，不够系统和完善。这些天然化合物的具体调节机制和确切的分子靶标仍有待进一步阐明，需要对其治疗潜力进行更深层次的探究。在充分了解这些天然化合物的调节作用和机制的基础上，进行模型动物添加或临床试验，将会更有助于探究其对预防和治疗NAFLD的效果，进而为畜牧生产中防控围产期奶牛能量负平衡等特殊生理状态引起的代谢疾病提供相应的防治措施和手段。
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