2. 江西农业大学林学院, 国家林草局木本香料(华东)工程技术研究中心, 南昌 330045;
3. 国家肉牛牦牛产业技术体系高安实验站, 高安 330800;
4. 国家肉牛牦牛产业技术体系随州实验站, 湖北省随州市随县畜牧技术推广站, 随州 441300
2. Woody Spice(East China) Engineering Technology Research Center of National Forestry and Grass Administration, Forestry College, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China;
3. National Beef Cattle and Yak Industrial Technology System Gaoan Experimental Station, Gaoan 330800, China;
4. Animal Husbandry Technology Extension Station of Suixian, Suizhou City, Hubei Province, National Beef and Yak Industrial Technology System Suizhou Experimental Station, Suizhou 441300, China
芳樟(Cinnamomum camphora var. linaloolifera Fujita.)为樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)常绿阔叶乔木，原产于我国东南以及西南各地，是我国重要的天然香料树种，其枝、叶、根中都富含精油，其中以叶中精油含量最高[1]。为了获取较高的芳樟枝叶生物量，便于人工采收作业，获取更大的经济效益，近些年我国已经大面积推广应用了矮化密植技术培育芳樟油用原料林——矮化芳樟人工林[2]。目前我国主要采用高温水蒸气蒸馏法提取芳樟枝叶中的精油[3]，而提取精油后获得的副产物去油芳樟枝叶的用途主要是经晒干后用于水蒸气蒸馏环节的燃料，或者还田充当肥料等，这不仅造成资源的大量浪费，还会给环境带来严重污染。因此，寻找其他方式处理去油芳樟枝叶，并改善其利用率具有重要的现实意义。
相比于传统芳樟树，矮化芳樟树生长期短，树体高度在1 m以下，枝叶更细嫩，木质化程度更低[4]。张峰[5]测定了矮化芳樟枝叶的主要成分，发现矮化芳樟枝叶的粗脂肪(EE)含量为5.6%，粗蛋白质(CP)含量为19.3%，粗纤维(CF)含量为5.5%，粗灰分(Ash)含量为5.7%，总磷(TP)含量为0.3%，钙(Ca)含量为0.7%，总多酚含量为2.2%，总多糖含量为6.1%，各指标均在优良牧草的标准范围内。因此，去油芳樟枝叶具有成为优质木本饲料的潜力，可扩大南方地区的粗饲料资源。但是去油芳樟枝叶具有特殊气味，且其含水量较大，不利于长时间保存，直接作为饲料饲喂反刍动物效果较差，而经过青贮处理可有效改善青贮原料的特殊气味[6]。但由于去油芳樟枝叶中水溶性碳水化合物含量较低，直接青贮较难调制出高品质青贮饲料，因此需要使用青贮添加剂进行处理。然而，目前尚未见到有关去油芳樟枝叶青贮发酵的研究报道。大量研究表明，在青贮原料中添加葡萄糖[7-9]、有机酸[10-12]和纤维素酶[13-15]可以有效提高青贮饲料的品质。因此，本试验以去油芳樟枝叶作为原料，探讨添加葡萄糖、混合有机酸和纤维素酶对去油芳樟枝叶青贮饲料营养成分、青贮发酵品质和瘤胃体外发酵特性的影响，筛选适合去油芳樟枝叶青贮发酵的青贮添加剂，旨在为去油芳樟枝叶的饲料化应用提供科学依据，为去油芳樟枝叶优质青贮的制作提供理论支撑。
1 材料与方法 1.1 试验材料去油芳樟枝叶取自江西省抚州市金溪县江西天香香料有限公司芳樟基地种植的矮化芳樟树。葡萄糖、甲酸、乙酸、丙酸及纤维素酶均为分析纯。青贮所用的塑料桶于市场购买，容积为1 L。
1.2 青贮饲料调制将去油芳樟枝叶用铡刀切碎至2 cm左右，混合均匀后备用，去油芳樟枝叶青贮前营养成分见表 1。试验采用单因素试验设计，共设置4个组：对照组(CON组，不添加任何青贮添加剂)、葡萄糖组(GLU组，添加20 g/kg葡萄糖)、混合有机酸组(MOA组，按照7 ∶ 1 ∶ 2的体积比例将甲酸、乙酸和丙酸混合，添加量为6 mL/kg)和纤维素酶组(CE组，添加2 g/kg纤维素酶)，各青贮添加剂的添加剂量均以青贮原料鲜重为基础。各组中的青贮添加剂均充分溶解在10 mL蒸馏水中，随后用微型喷雾剂喷洒在切碎混匀的去油芳樟枝叶上，CON组只喷洒10 mL蒸馏水，再次混匀，取500 g装入1 L的青贮桶中密封，每组设置4个重复，青贮45 d后开封，取样分析。
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表 1 去油芳樟枝叶青贮前营养成分 Table 1 Nutrient composition of deoiling linalyl branches and leaves before silage |
分别称取200 g青贮前和青贮后去油芳樟枝叶样品，置于烘箱中65 ℃烘干48 h，取出烘干样，经实验室粉碎机粉碎后过40目筛待测。干物质(DM)、CP、EE和Ash含量参照AOAC(2005)[16]的方法进行测定。酸性洗涤纤维(ADF)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤木质素(ADL)含量参照Van Soest等[17]洗涤纤维法，采用纤维分析仪(ANKOMA200i Fiber Analyzer，美国ANKOM公司)进行测定。水溶性碳水化合物(WSC)含量采用蒽酮-硫酸比色法[18]进行测定。淀粉含量采用高氯酸水解-蒽酮比色法[19]进行测定。
1.3.2 碳水化合物组分碳水化合物组分指标分析参照NRC(2016)[20]的方法，计算以下指标：总碳水化合物(CHO)、非中性洗涤纤维性碳水化合物(non-NDF)、有机酸(OA)、淀粉(CB1)、可溶性糖(CA)、不可利用中性洗涤纤维(CC)、中性洗涤可溶性纤维(CB2)、可利用中性洗涤纤维(CB3)，各组分的单位均为%DM。
1.3.3 预测能值总可消化养分(TDN)根据Weiss等[21]的方法计算，以下指标中各组分的单位均为%DM。计算公式如下：
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式中：NDFn表示无氮中性洗涤纤维[NDFn=NDF-中性不溶蛋白(NDICP)]。
代谢能(ME)、消化能(DE)、增重净能(NEg)和维持净能(NEm)参照NRC(2016)[20]，在TDN基础上进行计算，公式如下：
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取去油芳樟枝叶青贮饲料样品20 g，加入180 mL蒸馏水，充分搅拌均匀，用榨汁机搅碎1 min，先后用4层纱布和定性滤纸过滤，收集过滤后的浸出液，再用pH计[DELTA320 pH计，梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司]测定去油芳樟枝叶青贮饲料浸出液的pH；0.45 μm的滤膜过滤后，用高效液相色谱仪(Waters-Baseline520型，美国Waters公司)测定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量，分析条件为波长214 nm，C18柱温维持在30 ℃，流动相为0.02 mol/L KH2PO4/H3PO4，pH 2.37，流速1 mL/min，进样量10 μL[22]；氨态氮(NH3-N)含量采用苯酚-次氯酸钠比色法测定[23]。
1.3.5 瘤胃体外发酵特性试验选用的瘤胃液供体动物为4只安装有永久性瘤胃瘘管的锦江黄牛，体重为(365±27) kg，单圈饲养。参考我国《肉牛饲养标准》(NY/T 815—2004)，以350 kg肉牛日增重500 g所需综合净能配制基础饲粮，每日定时饲喂2次(08:00和18:00)，自由饮水。基础饲粮组成及营养水平见表 2。
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表 2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验前，根据Menke等[24]的配方配制瘤胃缓冲液，并与从瘤胃液供体牛上采集的瘤胃液按2 ∶ 1的比例混合，准确量取60 mL混合溶液于培养瓶中培养，培养底物为500 mg去油芳樟枝叶青贮饲料，培养瓶通过1根带针头的橡胶管与带有刻度的注射器连接，便于记录产气量(GP)，培养装置中体外批次培养装置参照卢德勋[25]和程茂基[26]所述的方法进行。装置主体为振荡速率和水浴温度均可自由调节的恒温水浴摇床，准备就绪后，接通体外培养装置，培养48 h。培养结束后，立即用pH计测定培养液pH，将瓶中滤渣转移至已事先烘干称重的尼龙袋(孔径200目)中并用蒸馏水多次冲洗培养瓶，使滤渣完全转入尼龙袋中，采用恒重干燥法测定体外干物质消化率(IVDMD)，采集滤液样品，于-20 ℃冷冻保存，用于瘤胃发酵参数[NH3-N、挥发性脂肪酸(VFA)和微生物蛋白质(MCP)含量]的测定。NH3-N和VFA(乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸)含量的测定方法同青贮发酵品质分析，MCP含量采用比色法[27]进行测定。
1.4 数据处理及统计分析试验测定各项数据使用Excel 2019进行初步整理后，采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法进行多重比较，结果用平均值和均值标准误(SEM)表示，P＜0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 不同青贮添加剂对去油芳樟枝叶青贮饲料营养成分的影响由表 3可知，不同青贮添加剂对去油芳樟枝叶青贮饲料的DM、NDF、ADF和ADL含量无显著影响(P>0.05)。混合有机酸组的CP和EE含量显著高于其他各组(P<0.05)；葡萄糖组的CP含量显著高于对照组和纤维素酶组(P<0.05)，Ash含量显著低于其他各组(P<0.05)。
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表 3 不同青贮添加剂对去油芳樟枝叶青贮饲料营养成分的影响(干物质基础) Table 3 Effects of different silage additives on nutrient composition of deoiling linalyl branches and leaves silage (DM basis) |
由表 4可知，不同青贮添加剂对去油芳樟枝叶青贮饲料的非中性洗涤纤维碳水化合物、淀粉、不可利用纤维和可利用中性洗涤纤维含量无显著影响(P>0.05)。纤维素酶组的有机酸含量最高，显著高于对照组(P<0.05)；混合有机酸组的总碳水化合物含量显著低于其他各组(P<0.05)；纤维素酶组的中性洗涤可溶纤维含量最低，显著低于对照组(P<0.05)；葡萄糖组的可溶性糖含量最高，显著高于其他各组(P<0.05)。
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表 4 不同青贮添加剂对去油芳樟枝叶青贮饲料碳水化合物组分的影响 Table 4 Effects of different silage additives on carbohydrate components of deoiling linalyl branches and leaves silage |
由表 5可知，不同青贮添加剂对去油芳樟枝叶青贮饲料的TDN、DE、ME、NEm和NEg均无显著影响(P>0.05)。
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表 5 不同青贮添加剂对去油芳樟枝叶青贮饲料预测能值的影响 Table 5 Effects of different silage additives on predicted energy of deoiling linalyl branches and leaves silage |
由表 6可知，各组去油芳樟枝叶青贮饲料中均未检测到丁酸，不同青贮添加剂对去油芳樟枝叶青贮饲料的NH3-N含量无显著影响(P>0.05)。纤维素酶组的pH最低，显著低于其他各组(P<0.05)；纤维素酶组的乳酸、乙酸和总挥发性脂肪酸(TVFA)含量均为最高，其中，纤维素酶组的乳酸含量显著高于混合有机酸组和葡萄糖组(P<0.05)，TVFA和乙酸含量显著高于其他各组(P<0.05)；混合有机酸组和葡萄糖组的丙酸含量显著高于对照组和纤维素酶组(P<0.05)；混合有机酸组的TVFA含量显著高于对照组(P<0.05)。
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表 6 不同青贮添加剂对去油芳樟枝叶青贮发酵品质的影响 Table 6 Effect of different silage additives on silagefermentation quality of deoiling linalyl branches and leaves silage |
由表 7可知，不同青贮添加剂对去油芳樟枝叶青贮饲料瘤胃体外发酵培养液的GP及AA、PA、BA、IBA、VA、IVA和NH3-N含量均无显著影响(P>0.05)。葡萄糖组的pH最低，显著低于其他各组(P<0.05)；葡萄糖组的IVDMD、MCP和TVFA含量均最高，其中，葡萄糖组的IVDMD显著高于混合有机酸组(P<0.05)，MCP含量显著高于对照组和混合有机酸组(P<0.05)，TVFA含量显著高于对照组和混合有机酸组(P<0.05)；纤维素酶组的TVFA含量显著高于混合有机酸组(P<0.05)。
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表 7 不同青贮添加剂对去油芳樟枝叶青贮饲料瘤胃体外发酵特性的影响 Table 7 Effects of different silage additives on rumen fermentation characteristics in vitro of deoiling linalyl branches and leaves silage |
青贮饲料的蛋白质降解与青贮发酵早期pH密切相关。本试验的研究结果表明，添加混合有机酸显著提高了去油芳樟枝叶青贮饲料的CP含量，这与刘庭玉等[28]在青贮天然草地牧草中添加甲酸、张晴晴等[29]在燕麦的青贮发酵中添加混合有机酸的结果一致，原因可能是添加有机酸直接酸化了青贮原料，使得pH快速下降，抑制了腐败菌和梭菌等有害微生物的生长繁殖，同时降低了青贮发酵早期植物自身呼吸作用对CP的消耗，有效保留了营养物质[30]。此外，本试验还发现，添加混合有机酸显著提高了去油芳樟枝叶青贮饲料的EE含量，原因可能是本试验添加的甲酸、乙酸和丙酸本身就属于短链挥发性脂肪酸，增加了青贮饲料原料中EE含量。
本试验结果表明，添加葡萄糖显著提高了去油芳樟枝叶青贮饲料的可溶性糖含量，原因可能有2个方面：一方面，添加葡萄糖直接提高青贮原料中WSC含量，进而提高去油芳樟枝叶青贮饲料的WSC含量；另一方面，在青贮发酵时，WSC是乳酸菌发酵的底物，由于WSC的添加促进了青贮原料中乳酸菌在青贮早期的生长繁殖，使得青贮发酵更早进入稳定期，减少了其他杂菌对发酵底物的消耗以及蛋白质的水解[31]。因此，本试验葡萄糖组的去油芳樟枝叶青贮饲料CP含量也显著高于对照组和添加纤维素酶组，这与吴金彩等[32]和孙肖慧等[33]的研究结果一致。
纤维素酶是一种复合酶，青贮发酵时添加纤维素酶不仅可将植物细胞壁的结构性多糖降解转化为单糖，为乳酸菌快速繁殖提供底物，还可以降低青贮饲料中纤维的含量，提高青贮饲料的营养品质[15]。本试验结果表明，添加纤维素酶提高了去油芳樟枝叶青贮饲料碳水化合物组分中有机酸含量，降低了中性洗涤可溶纤维含量，表明纤维素酶有效促进去油芳樟枝叶细胞壁的分解。
3.2 不同青贮添加剂对去油芳樟枝叶青贮饲料青贮发酵品质的影响pH是评价青贮发酵品质好坏的重要指标，降低pH可促进乳酸菌发酵并改善青贮品质，各有机酸(乳酸、乙酸、丙酸和丁酸)及TVFA含量是反映发酵过程好坏的重要指标之一[34]。因植物细胞的细胞壁为结构性多糖，不能被微生物直接利用，而纤维素酶可以将细胞壁结构性多糖降解为能够被微生物所利用的单糖，从而为乳酸发酵提供更多的底物，起到改善青贮饲料品质的作用。任志花等[35]、朱妮等[36]和李茂等[37]研究结果均表明，添加纤维素酶可以显著降低青贮饲料的pH。本试验结果表明，添加纤维素酶降低了去油芳樟枝叶青贮饲料的pH，提高了TVFA含量和乳酸含量，与上述研究结果一致。此外，本试验结果表明，与对照组相比，添加混合有机酸显著提高了去油芳樟枝叶青贮饲料TVFA含量，原因可能是添加混合有机酸直接提高青贮原料中挥发性脂肪酸的含量，进而提高青贮饲料中TVFA含量。
本试验各组去油芳樟枝叶青贮饲料中均没有检出丁酸，这可能与樟树枝叶本身富多种具有抑菌作用的活性成分有关，已有文献报道过的樟树枝叶中抑菌成分有多酚类、黄酮类、萜烯类、挥发油等[5]。常璐璐等[38]研究发现，芳樟枝叶提取物对青霉、曲霉等真菌具有抑菌性，李艳等[39]通过气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪研究樟树枝叶素油的成分组成和抑菌活性，检测出40种成分，且樟树枝叶素油对大肠杆菌、真菌等具有优良的抑菌作用，可见芳樟枝叶中含有多种抑菌活性成分，是一种很好的天然防腐剂[2]，有利于制作青贮饲料。
3.3 不同青贮添加剂对去油芳樟枝叶青贮饲料瘤胃体外发酵特性的影响pH是衡量反刍动物瘤胃发酵的重要指标之一，适宜的pH为瘤胃内的微生物提供了合适的生存环境，由于反刍动物的采食、消化等正常生理活动使得瘤胃液pH处于一个动态变化的过程，其正常变化范围为5.5~7.5[22]。本试验各组体外发酵培养液pH为6.58~6.79，均在正常瘤胃液pH变化范围内，其中，葡萄糖组的pH最低，显著低于其他各组，说明添加葡萄糖可以促进去油芳樟枝叶青贮饲料在瘤胃内的发酵程度。饲料在瘤胃内瘤胃微生物的分解作用下分解程度的强弱，可以通过计算瘤胃干物质降解率来反映[40]，粗饲料经过瘤胃微生物发酵后的GP是评价粗饲料可发酵程度的重要指标，不仅可以体现饲料营养价值的高低，也可以反映瘤胃微生物利用底物的程度[41]。而MCP是反刍动物维持正常生理活动重要的氮源之一，可为机体正常活动提供40%~80%的氮需要量，用以合成各类蛋白质。TVFA含量反映了饲料在瘤胃内发酵的情况，是反刍动物生长发育的主要能量来源，反刍动物体内碳代谢碳流量的2/3是由瘤胃发酵产生的挥发性脂肪酸提供的，达到机体总能需要量的70%~80%[42]。本试验结果表明，葡萄糖组去油芳樟枝叶青贮饲料的IVDMD、GP以及MCP和TVFA含量均为最高，表明添加葡萄糖可以促进去油芳樟枝叶青贮饲料在瘤胃内降解，进而改善瘤胃发酵。
4 结论使用葡萄糖、混合有机酸和纤维素酶3种青贮添加剂对去油芳樟枝叶青贮饲料的营养成分、青贮发酵品质以及瘤胃体外发酵特性均有一定的改善作用，通过对不同指标进行综合分析，各组去油芳樟枝叶青贮饲料的综合营养价值由低到高的排序为：对照组＜混合有机酸组＜纤维素酶组＜葡萄糖组。
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