全球每年消耗抗生素总量的90%用在了食源动物身上，致使细菌耐药性和药物残留等问题日益突出，2020年我国饲料端全面禁止添加抗生素，因此要求我们业界要进一步提高动物营养与保健，调整饲料营养设计，选用新型绿色添加剂产品，维护动物食品安全和公共卫生安全。酶制剂是通过生物技术方法产生的一类高效、专一、绿色、无残留的活性成分，具有抑菌、抗氧化、中止炎症、降低腹泻率等作用^[1]。研究表明，由于酶制剂的替抗功能具有条件性、辅助性和累积性的特点，通过组合酶和配合酶制剂的筛选和高效配制才能达到较好的替抗效果^[2]。目前，酶制剂作为一种饲料添加剂已广泛应用于肉鸡、蛋鸡和仔猪的生产过程，而应用于反刍动物和生长兔方面的研究相对较少^[3]。柠檬酸作为有机酸化剂是一种生产中应用较多的酸化剂，对畜禽具有促进营养物质消化吸收、降低胃和肠道pH等作用。饲粮中添加柠檬酸可以显著提高生长肉兔的平均日增重，降低腹泻率、死亡率^[4]。本试验在前期开展的单酶、单酸化剂试验基础上以“葡萄糖氧化酶+过氧化氢酶+柠檬酸”组合添加剂替代抗生素进行试验，旨在探索其替代抗生素添加剂或抗生素类动物保健品应用于商品肉兔饲粮中的效果，为其在商品肉兔绿色养殖中的广泛应用提供理论支持。

1 材料与方法 1.1 试验材料

葡萄糖氧化酶(10 000 U/g)、过氧化氢酶(200 000 U/g)为山东某酶制剂公司产品，柠檬酸为潍坊英某有限公司生产的食品级一水柠檬酸。

1.2 试验饲粮

对饲料原料的营养价值进行测定后，参考任克良^[5]推荐的肉兔配合饲料生产技术，以玉米、麦麸、豆粕、花生秧、豆秸杆粉等饲料原料配制基础饲粮，其组成及营养水平见表 1。在基础饲粮配方的基础上，分别添加低、中、高3种剂量的组合添加剂，制成3种试验饲粮。组合添加剂按照设定的剂量添加于预混料中，混合均匀。此外，再在基础饲粮配方的基础上添加抗生素，配制1种含抗生素饲粮。各饲粮均加工成直径为5 mm的颗粒饲料后备用。

1.3 试验设计

试验选取健康的35日龄断奶伊拉商品肉兔300只(公母各占1/2)，按照体重和性别随机分为5组，每组60个重复，每个重复1只兔。空白对照组饲喂基础饲粮，抗生素对照组饲喂在基础饲粮基础上添加抗生素(恩拉霉素20 g/t+金霉素52.5 g/t)的含抗生素饲粮，试验1组、试验2组、试验3组饲喂在基础饲粮基础上分别添加低剂量(葡萄糖氧化酶200 g/t+过氧化氢酶114 g/t+柠檬酸1.0%)、中剂量(葡萄糖氧化酶400 g/t+过氧化氢酶228 g/t+柠檬酸1.0%)、高剂量(葡萄糖氧化酶800 g/t+过氧化氢酶456 g/t+柠檬酸1.0%)组合添加剂的试验饲粮。预试期5 d，正试期30 d。饲养试验在肉兔养殖企业进行，半开放式兔舍，通风良好。试验兔每天饲喂1次，自由采食和饮水。

1.4 指标测定 1.4.1 生产性能(生长性能、腹泻率和死亡率)

试验期间，每周一清晨饲喂前对试验兔进行空腹称重，记录饲喂量，并计算平均日采食量、平均日增重及料重比。

记录每日腹泻、死亡的试验兔，对死亡兔进行剖检，分析死亡原因，计算腹泻率和死亡率。

1.4.2 养分表观消化率

在试验结束前试验兔达到65日龄时，每组各选取体重基本相同的试验兔8只(公母各占1/2)置于消化代谢笼内采用全收粪法进行消化试验，用于测定养分表观消化率。消化试验期间将试验兔放置于消化代谢笼内单笼饲养，自由饮水。每天定期收集粪便记录粪便的重量，在收集粪样过程中将饲粮、毛发等去除干净，粪样置于4 ℃冰箱保存。记录每只试验兔每天的投料量和剩料量，计算耗料量；待4 d的收粪期结束后，将粪样混匀，置于65~70 ℃鼓风干燥箱中烘至恒重，于空气中放置24 h与空气中水分平衡后，粉碎制样，过40目标准筛，检测常规养分含量。参照《饲料分析及饲料质量检测技术》^[7]的方法对饲粮和粪样中各养分含量进行测定。

养分表观消化率计算公式如下：

1.4.3 免疫指标(免疫器官指数、血清免疫指标)

试验结束时，每组选择8只接近平均体重的试验兔屠宰后，取胸腺、脾脏及圆小囊，去除包围物后分别称重，计算胸腺指数、脾脏指数及圆小囊指数，计算公式如下：

试验结束前3天，每组各选8只(4公4母)试验兔进行耳静脉采血，采集的血液静置30 min，待血液凝固后，3 000 r/min离心10 min，收集血清装入EP管中于-20 ℃保存，用于测定血清免疫指标。血清免疫指标均采用上海酶联生物科技有限公司生产的试剂盒进行测定，其标准品线性回归与预期浓度相关系数(R²)≥0.99。

1.5 数据统计分析

试验数据采用Excel 2010进行初步处理后，采用SPSS 19.0统计软件的one-way ANOVA程序进行单因素方差分析，并采用Duncan氏法进行多重比较。腹泻率、死亡率采用卡方检验。除腹泻率、死亡率外，试验结果均以平均值±标准差表示。P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析 2.1 组合添加剂对商品肉兔生产性能的影响

由表 2可知，饲粮中添加不同剂量的组合添加剂对肉兔的末重、平均日增重、平均日采食量及料重比均没有显著影响(P＞0.05)。

由表 3可知，经卡方检验分析，各组肉兔的腹泻率、死亡率差异不显著(P＞0.05)，3个试验组中以试验3组的腹泻率和死亡率最低。

2.2 组合添加剂对商品肉兔养分表观消化率的影响

由表 4可知，试验2组的粗蛋白质表观消化率最低，与抗生素对照组差异显著(P＜0.05)，空白对照组、试验1组、试验3组与抗生素对照组差异不显著(P＞0.05)；抗生素对照组的粗灰分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维表观消化率显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)高于空白对照组及各试验组，空白对照组与各试验组差异不显著(P＞0.05)；干物质、淀粉和粗脂肪表观消化率各组之间差异不显著(P＞0.05)。

2.3 组合添加剂对商品肉兔免疫指标的影响

由表 5可知，试验3组的圆小囊指数最大，与抗生素对照组、试验2组差异极显著(P＜0.01)；试验2组的圆小囊指数最小，与空白对照组、试验3组差异极显著(P＜0.01)。

由表 6可知，试验2组的血清免疫球蛋白A(IgA)含量最高，与空白对照组、抗生素对照组差异极显著(P＜0.01)，与试验1组差异显著(P＜0.05)，同时试验3组也显著高于空白对照组和抗生素对照组(P＜0.05)；试验2组、试验3组的血清分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量较高，与空白对照组差异极显著(P＜0.01)；试验1组、试验2组的血清免疫球蛋白M(IgM)含量较高，与空白对照组和抗生素对照组差异显著(P＜0.05)；血清白细胞介素-10(IL-10)含量以试验2组最高，与空白对照组差异极显著(P＜0.01)，同时试验3组也显著高于空白对照组(P＜0.05)。与空白对照组和抗生素对照组相比，饲粮中添加不同剂量的组合添加剂提高了肉兔血清中的免疫球蛋白和细胞因子的含量，说明该组合添加剂提高了肉兔机体的免疫反应且替抗效果较好。

3 讨论 3.1 组合添加剂对商品肉兔生产性能的影响

葡萄糖氧化酶作为一种绿色添加剂可以改善畜禽肠道消化环境、消除自由基、维持肠道菌群平衡^[8]。过氧化氢酶具有清除自由基和过氧化物的功能，具体表现为维持肠上皮细胞功能，促进畜禽生长发育^[9-10]。而柠檬酸不仅是三羧酸循环的代谢中间产物，同时还具有提高机体免疫力、促进畜禽生长发育的作用^[11]。范秋丽等^[12]研究发现，在基础饲粮中添加适量的葡萄糖氧化酶、溶菌酶和腐殖酸钠对黄羽肉鸡的平均日增重、料重比无显著影响。唐明红^[13]在饲粮中添加过氧化氢酶后发现，过氧化氢酶可以改善肉仔鸡的生长性能。在饲粮中添加过氧化氢酶还可以改善仔猪的抗氧化能力，缓解肝脏损伤，最终表现为仔猪生长性能的提高^[14]。郑晓君^[15]在基础饲粮中添加不同剂量的柠檬酸后发现，适量的柠檬酸可显著提高肉鸡的出栏体重和成活率。以上研究结果说明葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和柠檬酸的添加可以提高畜禽的生产性能。基于前人的研究，本试验将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、柠檬酸组合加入到肉兔基础饲粮中，结果发现不同剂量的组合添加剂均可以改善肉兔的末重和平均日增重，且料重比与空白对照组相比均有所降低；同时发现，不同剂量的组合添加剂对肉兔的末重和平均日增重无显著影响，而料重比在低剂量时最佳。本课题组前期试验发现二甲酸钾和磷酸复合酸化剂的添加剂量对商品肉兔的末重、平均日增重和料重比影响较小^[16]，单独添加柠檬酸可提高肉兔的生产指标，且添加剂量对生产指标无显著影响^[4]。上述结果说明，单一使用酸化剂或酶制剂可提高畜禽的生产性能，且添加剂量对畜禽的生产性能基本无影响，而2类或2类以上的组合添加剂不仅可以提高畜禽的各项生产性能指标，还往往存在低剂量即可达到降低料重比的效果。

腹泻是断奶幼兔生产过程中最严重的疾病，发病率和死亡率均居疾病之首。研究发现酶制剂具有减轻肠道炎症反应、抗腹泻等功效^[17]，而酸化剂能提高家畜和家禽的免疫能力^[18]。目前，酶制剂和酸化剂在降低断奶仔猪腹泻率和死亡率方面的报道较多。在断奶仔猪饲粮中添加酸化剂后试验组仔猪腹泻率和平均日增重均有所改善^[19]。李洁云等^[20]将益生菌、酸化剂、精油和酶制剂的复合添加剂加入到断奶仔猪饲粮中，结果发现2个试验组的腹泻率显著低于对照组。费洪标等^[21]发现，在断奶獭兔饲粮中添加0.10%或0.15%的酸化剂均可以明显降低腹泻率和死亡率。3种添加剂形成的复合添加剂在降低兔腹泻率方面的应用较少，与添加剂应用于仔猪腹泻方面的结果类似，本研究中添加高剂量组合添加剂的试验组肉兔腹泻率、死亡率最低，与抗生素对照组接近，随着组合添加剂添加剂量的提高，对肉兔腹泻的影响逐渐增强。

3.2 组合添加剂对商品肉兔养分表观消化率的影响

养分表观消化率反映了畜禽肠道的功能，酸化剂和酶制剂可降低畜禽肠道pH，提高肠道有益菌群的数量，改善肠道的营养状况^[22]。范京辉等^[23]在饲粮中添加葡萄糖氧化酶等酶制剂后发现酶制剂使黄羽肉鸡的总磷和粗蛋白质消化率显著高于对照组。郑建婷等^[24]发现柠檬酸的添加导致肉兔的粗灰分表观消化率显著高于对照组。柠檬酸和磷酸以4 ∶ 6混合成的复合酸化剂也可提高断奶幼兔的粗蛋白质表观消化率^[25]。本试验中，肉兔的粗灰分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维表观消化率各试验组之间无显著差异，但高剂量组合添加剂组肉兔养分表观消化率各项指标比低、中剂量组合添加剂组更接近抗生素对照组。本试验结果与已发表的研究结果不太一致，试验肉兔的生理状况、组合添加剂的选择及剂量、酶制剂与酸化剂是否具体协同作用等因素均会影响肉兔对营养物质的吸收，以上问题需要进一步进行研究。

3.3 组合添加剂对商品肉兔免疫指标的影响

研究表明胸腺指数、脾脏指数和圆小囊指数作为免疫器官指数与免疫功能呈正相关，在一定程度上能反映畜禽机体健康程度^[26]。饲粮中添加一定量的酸化剂和酶制剂可以增强畜禽机体的免疫力。研究显示，将葡萄糖氧化酶加入到肉兔饲粮中，随着葡萄糖氧化酶添加量的提高，胸腺重量、脾脏重量和脾脏指数均呈现逐渐升高的趋势^[27]。将柠檬酸和磷酸混合成的复合酸化剂加入幼兔饲粮中，随着复合酸化剂添加量的增加，幼兔胸腺重量和胸腺指数与抗生素对照组相比均呈现不同程度的降低，脾脏指数和圆小囊指数则没有显著变化^[25]。本试验中，试验3组肉兔的圆小囊指数高于空白对照组、抗生素对照组和试验1组、试验2组，且与抗生素对照组的差异极显著。饲粮中添加高、中和低剂量的组合添加剂时，肉兔的胸腺指数和脾脏指数小于空白对照组和抗生素对照组但差异不显著。综合以上文献得出，葡萄糖氧化酶的加入会导致肉兔胸腺重量、脾脏重量和脾脏指数均提高，柠檬酸等酸化剂的加入使得胸腺重量和胸腺指数降低，而脾脏指数和圆小囊指数无显著变化。由此推测，本研究中圆小囊指数增加可能主要是由复合酶制剂引起的，究其原因可能是由于过氧化氢酶去除肠道上皮细胞内的活性氧(ROS)达到对肠上皮细胞的保护作用导致。

免疫球蛋白是广泛存在于动物体中的动物蛋白，根据结构分为IgG、IgA和IgM三大类。IgM是免疫应答反应中最早产生的，具有杀菌、溶菌等作用，主要作用于机体的早期防御。IgG是初级免疫应答中最持久和主要的免疫球蛋白，含量最高且直接参与体液免疫反应。IgA分成血清型和分泌型，血清型IgA具有介导调理吞噬依赖抗体的细胞毒性(ADCC)作用，sIgA是机体黏膜防御系统的主要成分^[28]。因此，血清中免疫球蛋白含量可直接反映动物体内免疫能力的强弱。白细胞介素是白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子，在激活和调节动物体免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化等方面起重要作用。其中，IL-6与动物体多种疾病的发生有一定的关系，IL-10具有抑制巨噬细胞的活性等功效。穆淑琴等^[14]将葡萄糖氧化酶添加到仔猪饲粮中发现葡萄糖氧化酶显著提高了血清中IgG、IgA、IgM的含量。朱爱民等^[29]将不同的酸化剂添加到断奶仔猪饲粮中发现柠檬酸可以使仔猪血清中IgG的含量升高。本研究中，中剂量和高剂量组合添加剂可使肉兔血清中IgA、IgM和IL-10的含量显著增加。综上所述，由于酸化剂和酶制剂的添加提高了肉兔血清中免疫球蛋白和细胞因子的含量，从而导致机体的免疫应答增强。

4 结论

随着饲粮中“葡萄糖氧化酶+过氧化氢酶+柠檬酸”组合添加剂添加剂量的增加，商品肉兔的死亡率呈下降趋势，免疫力呈上升趋势。综合分析生产性能、养分表观消化率和免疫指标，本试验条件下以高剂量组合添加剂(葡萄糖氧化酶800 g/t+过氧化氢酶456 g/t+柠檬酸1.0%)的效果较好。