2. 麻阳苗族自治县职业中学, 怀化 419400;
3. 湖南今汉药业有限公司, 长沙 410014;
4. 湖南文凤农牧科技有限公司, 娄底 417700
2. Mayang Miao Autonomous County Vocational Middle School, Huaihua 419400, China;
3. Hunan Jinhan Pharmaceutical Co., Ltd., Changsha 410014, China;
4. Hunan Wenfeng Agriculture and Animal Husbandry Technology Co., Ltd., Loudi 417700, China
迷迭香(Rosmarinus officinalis)又名海洋之露、艾菊，为唇形科迭香属多年生常绿草本植物[1]。我国最早对迷迭香的记载始于《草本拾遗》，表明迷迭香曾经在曹魏时期引种；20世纪70年代末至80年代初，我国从加拿大和美国引进迷迭香并成功栽培，现主要分布于南方地区的云南、贵州和广西等地，其中贵州独立山县成为迷迭香生产的主要基地[2]。迷迭香的茎、叶和花经过加工提取可以制成迷迭香提取物，其含有黄酮类、萜类与精油类以及酚酸类等生物活性成分，具有丰富的生物活性成分及药理作用。其中，鼠尾草酸、迷迭香酸和鼠尾草酚具有收敛、紧致肌肤、改善循环功能、刺激毛发再生、改善脱发、镇静安神、提神醒脑以及消除胃胀气等作用，另外还具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、降血脂和护肝等生物学功能[3-7]。迷迭香提取物作为多功效、天然和绿色的中草药饲料添加剂，满足了人们对健康食物的需求理念，成为饲料添加剂的研究热潮。目前，针对迷迭香提取物对肉鸡影响的研究较多，对蛋鸡鲜有报道，而特色品牌鸡蛋生产需要需求一种能够有效提高蛋品质，并实现抗氧化应激的天然饲料添加剂。因此，本试验在黑羽绿壳蛋鸡饲粮中添加不同水平的迷迭香提取物，探讨其对黑羽绿壳蛋鸡生长性能、蛋品质、抗氧化功能以及血清生化指标的影响，旨在探讨迷迭香提取物在蛋鸡饲粮中的作用效果及合理的添加水平，以期为迷迭香提取物在家禽生产中的应用提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物和材料试验选用690羽体重接近、健康的22周龄苏禽绿壳蛋鸡与五黑鸡的杂交F1代黑羽绿壳蛋鸡。试验所用的迷迭香提取物由湖南某公司提供，主要成分为迷迭香酸(≥5%)、熊果酸(≥3%)、叶绿素(≥4%)和黄酮(≥16%)，其他成分为二氧化硅和玉米淀粉以1 ∶ 4比例组成的载体。
1.2 试验设计和饲粮试验选取22周龄、体重相近、采食正常、健康的黑羽绿壳蛋鸡690羽(试验采用的种鸡)，随机分为5个组，每组6个重复，每个重复母鸡20羽、公鸡3羽。对照组饲喂基础饲粮，4个试验组饲喂在基础饲粮中分别添加50、100、200和400 mg/kg迷迭香提取物的饲粮。试验预试期1周，正试期14周。基础饲粮参照《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)营养需要标准配制，为玉米-豆粕型粉状饲粮，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验于2020年7月1日至2020年10月13日在湖南双峰县文凤农牧科技有限公司种鸡场进行。试验采用2层全阶梯式鸡笼饲养，每个重复1笼，各组均匀分布在1~2层。鸡只自由采食(计量不限量)，饮水通过乳头式饮水器全天供应。每天饲喂2次(07:00和15:30)，每天12:00、17:00准时收集当天全部鸡蛋。鸡舍自然通风和机械通风相结合，保证16 h光照时间，每天记录鸡舍的温度湿度，保持舍内卫生，每周清理2次剩料和鸡粪，免疫按照鸡场防疫规定进行。
1.4 检测指标及方法 1.4.1 生产性能以重复为单位，每天记录各重复鸡的采食量、产蛋总数和蛋重，每周记录死淘亡鸡数(公母)、畸形蛋数(脏蛋数、破壳蛋数和软壳蛋数)，计算蛋鸡平均日采食量(ADFI，以重复为单位，包括公鸡、母鸡)、平均蛋重、平均每只入舍蛋鸡的产蛋枚数(统计期内的总产蛋数/入舍母鸡数)、平均每只入舍蛋鸡的产蛋重量(统计期内的产蛋重量/入舍母鸡数)、料蛋比、入舍鸡产蛋率(100×统计期内产蛋总数/入舍鸡总数)、畸形蛋率和全期死淘率(死淘鸡全为母鸡)。
1.4.2 蛋品质正试期结束前3 d各重复每天随机收集鸡蛋10枚，即每个重复30枚鸡蛋，共900个鸡蛋(以重复为单位编号)带回实验室待测蛋品质。
1.4.2.1 常规蛋品质指标每个重复随机选取20枚鸡蛋，每组120枚，共600枚，测定常规蛋品质指标。蛋形指数：用游标卡尺测蛋的长径和短径；蛋形指数=长径/短径。蛋壳强度：将完整的鸡蛋尖端朝上、钝端朝下至于蛋壳强度测定仪测定。蛋壳厚度：用蛋壳厚度测定仪测带膜蛋壳的钝、中、锐端，取三者平均值。蛋壳相对重量(%)=100×蛋壳重/蛋重。哈氏单位和蛋黄颜色：用SONOVA蛋白质自动分析仪测定。蛋黄相对重量(%)=100×蛋黄重/蛋重。蛋黄指数：用高度游标卡尺测量蛋黄的高度，用游标卡尺测量蛋黄的直径，精确到0.02 mm，蛋黄指数(%)=100×高度/直径。
1.4.2.2 全蛋粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量正试期最后3 d每个重复每天随机取1枚鸡蛋，每组18枚，共90枚。将完整的鲜鸡蛋打入带盖的锡纸盒中，用玻璃棒(恒重)搅拌均匀，盖好锡纸盒盖并留出空隙以便排出鸡蛋受热产生的气体，65 ℃恒温箱烘8~12 h，每隔30 min中搅拌1次，烘至恒重；用磨粉机磨成粉末，再用105 ℃恒温箱烘2~3 h至恒重，密封保存。用凯氏定氮法(GB 5009.5—2010)测定全蛋中CP含量，用索氏浸提法(GB/T 14772—2008)测定全蛋中EE含量。
每组随机取18枚鸡蛋，将蛋液混匀分装至1.5 mL离心管中，于-20 ℃保存备用。测定时，按照1 ∶ 4(质量体积比)加入无水乙醇，在冰水浴条件下进行组织匀浆，设置低温离心机参数为4 ℃、3 500 r/min，离心10 min，离心后取上清液待测。采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定全蛋中TG和TC含量，测定方法严格按照试剂盒说明书操作。
1.4.3 血清抗氧化指标试验结束时，禁食12 h，在每个重复中随机挑选2只母鸡，进行翅静脉采血5 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)真空采血管中，于室温倾斜静置1 h后，在3 500 r/min的条件下离心15 min，收集血清分装于1.5 mL离心管中，-20 ℃保存。采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定血清总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活性以及丙二醛(MDA)含量，测定方法严格按照试剂盒说明书操作。
1.4.4 血清生化指标试验结束时，禁食12 h，在每个重复中随机挑选2只母鸡，进行翅静脉采血5 mL于普通真空采血管中，于室温倾斜静置1 h后，在3 500 r/min的条件下离心15 min，收集血清分装于1.5 mL离心管中，-20 ℃保存。采用迈瑞BS-200全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)和试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测血清总蛋白(TP)、葡萄糖(Glu)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、TG、TC、肌酐(CREA)、尿素氮(UN)含量以及碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性，测定方法严格按照试剂盒说明书操作。
1.5 数据统计分析试验数据采用Excel 2013进行初步整理，采用SPSS 20.0统计软件进行一般线性模型(单变量)分析，采用Duncan氏法进行多重比较，0.05 < P < 0.10表示有差异显著趋势，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著，结果以“平均值(mean)±标准差(SD)”表示。
2 结果与分析 2.1 迷迭香提取物对黑羽绿壳蛋鸡生产性能的影响由表 2可知，与对照组相比，在试验后期(30~36周龄)，饲粮添加50 mg/kg迷迭香提取物有提高黑羽绿壳蛋鸡平均蛋重的趋势(0.05 < P < 0.10)；在试验前期(23~29周龄)，饲粮添加50、200和400 mg/kg迷迭香提取物显著降低蛋鸡ADFI(P < 0.05)。饲粮添加不同水平迷迭香提取物对入舍鸡产蛋率、平均每只入舍蛋鸡的产蛋枚数、平均每只入舍蛋鸡的产蛋重量、平均蛋重、料蛋比、畸形蛋率和死淘率(死淘鸡全为母鸡)均无显著影响(P>0.05)。
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表 2 迷迭香提取物对黑羽绿壳蛋鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of Rosmarinus officinalis extract on performance of black feather green shell laying hens |
由表 3可知，与对照组相比，饲粮添加100、200和400 mg/kg迷迭香提取物极显著提高黑羽绿壳蛋鸡蛋黄颜色(P < 0.01)，饲粮添加不同水平迷迭香提取物对平均蛋重、蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋形指数、哈氏单位、蛋黄相对重量和蛋壳相对重量均无显著影响(P>0.05)。
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表 3 迷迭香提取物对黑羽绿壳蛋鸡常规蛋品质指标的影响 Table 3 Effects of Rosmarinus officinalis extract on conventional egg quality indices of black feather green shell laying hens (n=120) |
由表 4可知，与对照组相比，饲粮添加400 mg/kg迷迭香提取物显著提高黑羽绿壳蛋鸡全蛋中CP含量(P < 0.05)，饲粮添加不同水平迷迭香提取物对全蛋中TC、TG和EE含量均无显著影响(P>0.05)。
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表 4 迷迭香提取物对黑羽绿壳蛋鸡全蛋中TC、TG、CP和EE含量的影响 Table 4 Effects of Rosmarinus officinalis extract on contents of TC, TG, CP and EE in whole eggs of black feather green shell laying hens (n=18) |
由表 5可知，与对照组比，饲粮添加100和200 mg/kg迷迭香提取物显著提高黑羽绿壳蛋鸡血清T-AOC(P < 0.05)，饲粮添加100、200和400 mg/kg迷迭香提取物极显著提高血清GSH-Px活性(P < 0.01)，饲粮添加不同水平迷迭香提取物有降低血清MDA含量的趋势(0.05 < P < 0.10)，饲粮添加不同水平迷迭香提取物对血清SOD和CAT活性无显著影响(P>0.05)。
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表 5 迷迭香提取物对黑羽绿壳蛋鸡血清抗氧化指标的影响 Table 5 Effects of Rosmarinus officinalis extract on serum antioxidant indices of black feather green shell laying hens (n=12) |
由表 6可知，与对照组相比，饲粮添加200和400 mg/kg迷迭香提取物显著降低黑羽绿壳蛋鸡血清Glu含量(P < 0.05)，饲粮添加100和200 mg/kg迷迭香提取物极显著提高血清ALP活性(P < 0.01)，饲粮添加100、200和400 mg/kg迷迭香提取物极显著降低血清CREA含量(P < 0.01)，饲粮添加不同水平迷迭香提取物对血清TP、HDL、LDL、TG、TC和UREA含量以及ALT、AST活性均无显著影响(P>0.05)。
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表 6 迷迭香提取物对黑羽绿壳蛋鸡血清生化指标的影响 Table 6 Effects of Rosmarinus officinalis extract on serum biochemical indices of black feather green shell laying hens (n=12) |
迷迭香作为药食同源植物，含有萜类、黄酮类和酚酸类等活性成分，具有抗氧化、抗菌、护肝以及降血糖、血脂等作用。杨建生等[8]研究发现，饲粮添加0.3%迷迭香草粉可以显著提高40周龄京粉1号蛋鸡的产蛋率，对平均蛋重和料蛋比无显著影响。Radwan等[9]研究发现，饲粮添加0.5%和1.0%的止痢草、百里香、迷迭香及姜黄提高了饲料转化率、总蛋重、产蛋率及孵化性能。本试验结果表明，与对照组相比，饲粮添加不同水平迷迭香提取物对黑羽绿壳蛋鸡前期、后期和全期的入舍鸡产蛋率、平均每只入舍蛋鸡的产蛋枚数、平均每只入舍鸡蛋的产蛋重量、料蛋比、畸形蛋率和全期死淘率均无显著影响，但在试验后期饲粮添加50 mg/kg迷迭香提取物有提高平均蛋重的趋势；同时，本试验结果表明，饲粮添加50、200和400 mg/kg迷迭香提取物可显著降低试验前期的ADFI，但没有呈现一定的剂量关系，对试验后期和全期的ADFI没有显著影响，这可能与蛋鸡试验饲养前期没有适应迷迭香提取物的特殊气味有关。
3.2 迷迭香提取物对黑羽绿壳蛋鸡蛋品质的影响关于饲粮中添加迷迭香提取物对蛋鸡蛋品质的报道较少。家禽不能自身合成蛋黄色素，而由亲脂性的含氧羟基、酮基类胡萝卜素以及天然的叶黄素沉积在蛋黄中，且主要受饲粮中叶黄素沉积的影响[10]。目前，消费者更倾向于购买蛋黄颜色较深的鸡蛋。安婷婷等[11]研究发现，饲粮添加迷迭香草粉可以显著提高存放1和15 d鸡蛋的哈氏单位，显著提高蛋黄颜色。杨建生等[8]研究发现，饲粮添加0.3%迷迭香草粉可以显著提高蛋黄颜色，对哈氏单位、蛋黄重等无显著影响。本试验结果表明，饲粮添加100、200和400 mg/kg迷迭香提取物可极显著提高蛋黄颜色，与以上研究结果相似。这可能由于迷迭香提取物中的绿原酸及黄酮类物质较高，而其在蛋黄中逐渐沉积使蛋黄色泽更高。同时，杨建生等[8]研究发现，饲粮添加0.3%迷迭香草粉可显著提高蛋鸡的产蛋率，添加0.9%迷迭香草粉可显著降低蛋壳强度，对平均蛋重、蛋壳重量、蛋壳厚度、蛋白高度、蛋形指数和哈氏单位等没有显著影响。本试验结果表明，在蛋壳厚度和蛋形指数上与杨建生等[8]的研究结果一致，但在蛋壳强度上存在差异，这可能由于迷迭香添加的形式及数量以及蛋鸡品种、周龄不同而有差异。
鸡蛋中蛋白质和脂肪容易被人体吸收，且其中含有丰富的氨基酸、脂肪酸、维生素及矿物质。本试验结果表明，饲粮添加400 mg/kg迷迭香提取物可以显著提高全蛋中CP含量，添加200 mg/kg迷迭香提取物有提高全蛋中CP含量的趋势；饲粮添加迷迭香提取物对全蛋中EE含量没有显著影响。胆固醇和TG与机体脂质代谢的密切相关，胆固醇是机体不可或缺的物质，若胆固醇太高则会影响机体健康，容易诱导动脉粥样硬化、心血管栓塞的发生[12]。因此，降低鸡蛋中的胆固醇和TG含量具有重要意义[13]。本试验结果表明，饲粮添加迷迭香提取物对全蛋中TC和TG含量没有显著影响，这说明迷迭香提取物可以提高鸡蛋营养水平，改善蛋品质，符合目前消费者对高蛋白质食品的需求。
3.3 迷迭香提取物对黑羽绿壳蛋鸡抗氧化功能的影响脂质过氧化反应是机体在新陈代谢过程中产生的氧自由基(ROS)攻击细胞膜不饱和脂肪酸引起。当机体内ROS产生与清除调节失衡时，机体容易发生氧化损伤。T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px和MDA是目前评价机体抗氧化能力强弱的主要指标。刘亚楠等[14]研究发现，饲粮添加迷迭香提取物可以提高京海黄鸡血清T-AOC，降低血清MDA含量，且以200 mg/kg添加组抗氧化能力最强。刘大林等[15]研究发现，饲粮添加150 mg/kg迷迭香精油能显著提高肉鸡血清SOD和GSH-Px活性，显著降低血清MDA含量。沈根明等[16]研究发现，饲粮添加0.3%迷迭香可显著提高高温蛋鸡血清SOD和CAT活性，显著降低血清MDA含量。张泽生等[17]研究发现，中、高剂量迷迭香组分别显著和极显著提高Ⅱ型糖尿病模型小鼠血清SOD活性，降低MDA含量。梁正敏等[18]研究发现，迷迭香酸可以提高肺喘小鼠组织的SOD和GSH-Px活性，改善肺组织损伤。Torki等[19]研究发现，添加单一或组合的迷迭香、莳萝和菊苣能够显著提高抗热应激蛋鸡血浆GSH-Px活性。本试验结果表明，饲粮添加迷迭香提取物能显著提高黑羽绿壳蛋鸡血清T-AOC和GSH-Px活性，对血清CAT和SOD活性无显著影响，有降低血清MDA含量的趋势。本试验结果与前人研究结果具有相似性，说明迷迭香提取物的主要成分可提高蛋鸡的抗氧化能力，这可能与迷迭香提取物含有的迷迭香酸、黄酮类和绿原酸等具有清除1, 1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基、2, 2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基和羟基自由基等多种自由基的功能有关[20-23]。
3.4 迷迭香提取物对黑羽绿壳蛋鸡血清生化指标的影响血液生化指标是反映机体健康状况的敏感指标，与动物生长、机体代谢、营养状况和疾病密切相关。ALP是一组同工酶，主要在骨骼(40%~75%)、肝脏、胎盘和小肠(20%)等部位分布[24]。血清ALP活性反映动物成骨细胞活性，随着年龄的增大，血清ALP活性降低[25]。同时，研究发现，野葛叶总黄酮提取物可显著提高大鼠血清ALP活性，促进成骨细胞功能活动，进而促进骨的形成[26]；饲料添加绿原酸可以显著提高草鱼血清ALP活性，对预防外界微生物具有积极作用[27]。本试验结果表明，饲粮添加100和200 mg/kg迷迭香提取物可极显著提高黑羽绿壳蛋鸡血清ALP活性，可能原因是迷迭香提取物有利于提高成骨细胞功能活性或预防外界微生物，其作用机制需进一步研究。
Glu是机体供能的主要物质，由胰岛素和胰高血糖素共同调控，血清Glu含量的高低反映机体糖代谢情况。据报道，迷迭香提取物具有降血糖作用[28-30]。Bakirel等[28]研究发现，迷迭香提取物可以降低高脂饲粮诱导的新西兰兔血液Glu含量升高并改善其耐糖性能。本试验结果表明，饲粮添加200和400 mg/kg迷迭香提取物可显著降低黑羽绿壳蛋鸡血清Glu含量，与以上研究结果一致，说明迷迭香提取物具有降血糖作用，这可能与迷迭香提取物中的活性成分迷迭香酸(5%)具有降血糖的作用有关。CREA是动物肌肉分解的主要产物，是检测肾功能的常用指标，反映肾小球的滤过功能。CREA含量降低表明肾小球的滤过功能提高[31]。本试验结果表明，饲粮添加100、200和400 mg/kg迷迭香提取物可极显著降低黑羽绿壳蛋鸡血清CREA含量，说明迷迭香提取物具有保护肾脏作用，这可能与迷迭香提取物中的活性成分具有抗脂质氧化和清除自由基作用有关。
4 结论综上所述，在本试验条件下，饲粮添加200~400 mg/kg迷迭香提取物可改善黑羽绿壳蛋鸡蛋品质，降低血清Glu和CREA含量，并能提高其抗氧化能力，表明迷迭香提取物具有作为蛋鸡饲料添加剂的开发潜力。
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