2. 中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态重点实验室, 长沙 410125;
3. 湖南农业大学动物科技学院, 长沙 410125;
4. 中国科学院大学, 北京 100049
, DUAN Jielin3, YIN Jie2,4, LIU Jinyan3, LI Tiejun2
, FANG Jun1 fangjun1973@yahoo.com.cn
2. Key Laboratory of Animal Nutritional Physiology and Metabolic Process, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;
3. College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;
4. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
霉菌毒素是一类真菌和霉菌的二级代谢产物，广泛存在于霉变饲粮和饲料原料中[1]。到目前为止，超过300种霉菌毒素已经被鉴定出来。然而与食品工业相关联的只有一小部分霉菌毒素，分别为黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、伏马毒素和T-2毒素[2, 3]，这6类霉菌毒素一般被认为是最常见且对人畜最具危险的[4]。众所周知，畜禽摄入这些霉菌毒素会产生许多急性或慢性影响，如致畸型、致癌、假发情和免疫抑制等。而霉菌毒素进入动物体后的直接反映包括拒食、生产性能下降、脏器损伤、发病率升高等[4, 5, 6, 7]。因此，霉菌毒素污染对畜牧业的健康和稳定的发展具有潜在的危险[8, 9]。
尽管许多研究都报道了单个霉菌毒素对不同种属动物的影响，但是在自然条件下，畜禽不可能只暴露在一种霉菌毒素下。另外，在食品加工过程中，不同批次的不同原料经常混在一起也为不同种类霉菌毒素的混合提供了一个新的机会[1]。因此，畜禽通常暴露在许多种霉菌毒素的协同作用中。而目前关于多种霉菌毒素对动物协同毒害作用方面的研究基本上处于空白，因此这方面仍需进一步投入研究[3]。
随着国内外学者在功能性氨基酸方面的深入研究，近几年我们发现精氨酸和谷氨酸不仅是动物体内的必需氨基酸，而且在动物体内具有多种生理功能。最近研究表明，饲粮中添加精氨酸和谷氨酸能够刺激蛋白质合成[10]、增强免疫力、提高生产性能[11]以及调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路[12]等。基于这些研究，我们推测在饲粮中添加精氨酸或谷氨酸对霉变饲粮产生的应激损伤会有一定的缓解作用。因此，本试验采用自然霉变饲粮刺激育肥猪，探讨在育肥猪饲粮中添加精氨酸或谷氨酸对霉变饲粮诱导产生的应激损伤的缓解作用，为寻求理想的营养支持提供试验依据。
霉变饲粮的准备参照Liu等[13]的方法，首先将正常基础饲粮洒水至20%的相对湿度，然后将其放置自然条件(温度23～28 ℃，相对湿度68%～85%)下发酵至饲粮表层出现明显的霉菌菌落。待长出明显菌落之后，将霉变饲粮自然风干，混匀，分别取3份样品送至北京泰乐琪生物公司，采用质谱仪检测霉菌毒素含量，结果见表1。
 | 表1 霉变饲粮和基础饲粮中霉菌毒素的含量
Table 1 Mycotoxin contents of contaminated and basal diets mg/kg
|
试验选用平均初始体重为(55.0±1.5) kg的“长×大”二元杂交育肥猪20头，随机分为4组，分别饲喂正常基础饲粮(对照组)、基础饲粮经过霉变处理后的霉变饲粮(霉变组)、添加1%精氨酸的霉变饲粮(精氨酸组)、添加2%谷氨酸的霉变饲粮(谷氨酸组)，每组5个重复，每个重复1头猪。基础饲粮配制参照NRC(1998)猪的营养需要，其组成及营养水平见表2。所有试验育肥猪单栏饲养，饲喂60 d后屠宰。
试验开始前和结束后，对每头育肥猪空腹称重并记录；每日定期观察，记录料槽内饲粮消耗情况；试验结束后，计算平均日增重、平均日采食量和料重比。
所有育肥猪屠宰后立即打开腹腔，分离心脏、肝脏、脾脏和肾脏，称重记录数据。脏器指数计算公式如下：
脏器指数(g/kg)=脏器绝对重量/体重。取3 cm长的肝脏，采用甲醛固定液固定，使用苏木精-伊红(HE)染色，制作肝脏切片。
| 表2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % |
屠宰前1天，清晨对空腹育肥猪用无菌注射器前腔静脉采血10 mL/头。将血液静置15 min，离心(3 000 r/min，20 min)分离血清，分装于Eppendorf管中，4 ℃保存，然后送至亚热带农业生态研究所分子营养实验室待测。用Beckman公司CX4型全自动血液生化分析仪进行血清白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、葡萄糖(GLU)含量及乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(ALT)、γ-谷氨酰胺转氨酶(γ-GT)活性的测定。
用血液分析仪(南昌百特HL-2400)进行白细胞数量、淋巴细胞百分比、中间值细胞百分比、中性粒细胞百分比、淋巴细胞绝对值、中间值细胞绝对值、中性粒细胞绝对值、红细胞数量、血红蛋白含量、红细胞比积、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白浓度、红细胞体积分布宽度、平均血小板体积和血小板压积的测定。
血清超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性采用试剂盒检测，试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
pH45 min和pH24 h：分别在屠宰后45 min和24 h时进行，采用pH计，将探头插入倒数第3～4肋间处眼肌内，记录pH；肉色：于屠宰后1～2 h内进行，取胸腰椎结合处背最长肌鲜样，平置于白色瓷盘中，在室内正常光照条件下(不得在强光直射下或阴暗处)，对照5分制肉色比色板(肉色标准图)进行目测评分；嫩度：猪屠宰后迅速取胸腰结合处眼肌段10 cm，用C-LM-3型嫩度计进行测定；大理石纹评分：取最末胸椎与第1腰椎接合处背最长肌的横断面，置于4 ℃冷却24 h，使用美制NPPC标准比色板进行大理石纹评分，用目测法进行测定；系水力：取背最长肌，采用35 kg重力挤压法测定；熟肉率：取背最长肌，先用电子天平将肉样称重(W0)，再将肉样放入陶瓷碗容器内，待蒸锅水沸腾后将肉样放入，蒸煮45 min，取出肉样吊挂于室内无风阴凉处，30 min后再次对肉样称重(W1)，计算公式如下：
熟肉率(%)=100×(W0-W1)/W0。试验数据采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析和Duncan氏法多重比较，以P<0.05为差异显著性标准。试验数据以平均值±标准误表示。
由表3可知，与对照组相比，霉变组育肥猪末重、平均日增重和平均日采食量显著降低(P<0.05)，精氨酸组和谷氨酸组与霉变组相比无显著性差异(P>0.05)，表明在饲粮中添加精氨酸或谷氨酸未能提高育肥猪末重、平均日增重和平均日采食量。各组间料重比差异不显著(P>0.05)。
| 表3 精氨酸和谷氨酸对饲喂霉变饲粮的育肥猪生长性能的影响 Table 3 Effects of Arg and Glu on growth performance of finishing pigs fed a contaminated diet |
由表4可知，与对照组相比，除了心脏、肾脏指数不受霉变饲粮影响外，霉变组的肝脏指数显著升高，脾脏指数显著下降(P<0.05)。谷氨酸组的肝脏指数、脾脏指数和肾脏指数较霉变组均得到显著缓解(P<0.05)；但是，添加精氨酸对霉变饲粮造成的脏器损伤没有显著影响(P>0.05)。
| 表4 精氨酸和谷氨酸对饲喂霉变饲粮的育肥猪脏器指数的影响 Table 4 Effects of Arg and Glu on visceral indexes of finishing pigs fed a contaminated diet g/kg |
霉变饲粮能够明显造成肝脏损伤(图1)。与对照组相比，霉变组肝细胞排列无规则，肝细胞间淋巴细胞大量坏死。谷氨酸组肝细胞排列虽无正常组规则，但是较霉变组细胞间淋巴细胞坏死明显减少。精氨酸组缓解作用不明显。
由表5可知，与对照组相比，霉变组血清中γ-GT、ALT、LDH活性和GLU含量增加，其中γ-GT活性显著升高(P<0.05)，而ALB和TP含量显著下降(P<0.05)。与霉变组相比，精氨酸组ALT和LDH活性显著降低(P<0.05)；添加谷氨酸对霉变饲粮造成血清生化指标异常的影响效果不显著(P>0.05)。
由表6可知，与对照组相比，霉变组血液白细胞数量、中间值细胞百分比、中性粒细胞百分比、平均红细胞体积、平均血小板体积、血红蛋白含量和红细胞数量均有所下降，其中平均红细胞体积下降达到显著水平(P<0.05)，另外，血小板压积显著升高(P<0.05)。与霉变组相比，精氨酸组中性粒细胞百分比和中间值细胞绝对值显著升高(P<0.05)；谷氨酸组中间值细胞百分比、平均红细胞体积、平均血小板体积显著升高，血小板压积显著下降(P<0.05)。
由表7可知，与对照组相比，霉变组血清SOD活性显著下降(P<0.05)。与霉变组相比，精氨酸组GSH-Px活性显著提高(P<0.05)，与此同时，谷氨酸组SOD和GSH-Px活性显著升高(P<0.05)。
 | 图1 精氨酸和谷氨酸对饲喂霉变饲粮的育肥猪肝脏形态学的影响
Fig.1 Effects of Arg and Glu on liver morphology of finishing pigs fed a contaminated diet |
| 表5 精氨酸和谷氨酸对饲喂霉变饲粮的育肥猪血清生化指标的影响 Table 5 Effects of Arg and Glu on serum biochemical indexes of finishing pigs fed a contaminated diet |
由表8可知，除系水力外，霉变饲粮组肌肉pH45 min、pH24 h、肉色、大理石纹评分、嫩度以及熟肉率均较对照组呈现下降趋势，其中嫩度显著下降20.22%(P<0.05)。精氨酸组嫩度较霉变组显著升高(P<0.05)，且高于对照组(P<0.05)。添加谷氨酸对肉品质的影响效果不显著(P>0.05)。
霉菌毒素对动物的影响首先表现在生长性能上[14]。从本试验结果来看，霉变饲粮显著降低了育肥猪末重、平均日增重和平均日采食量。尽管在饲粮中添加了精氨酸或谷氨酸，但也未能有效提高育肥猪生长性能。通常情况下，降低饲粮中的蛋白质水平能引起动物生长性能的下降，氨基酸的种类和添加水平也是影响动物生长性能的重要因素。在本试验中添加1%精氨酸或2%谷氨酸均未能使育肥猪生长性能提高的原因可能是经霉变后的饲粮适口性差，严重影响动物的采食量，大大降低了育肥猪的生长速度，也可能是霉菌毒素降低了育肥猪饲粮中蛋白质的转化效率，单一的通过添加精氨酸或谷氨酸不能解决霉菌毒素对育肥猪生长性能的负面影响。
| 表6 精氨酸和谷氨酸对饲喂霉变饲粮的育肥猪血常规的影响
Table 6 Effects of Arg and Glu on blood routine of finishing pigs fed a contaminated diet
|
| 表7 精氨酸和谷氨酸对饲喂霉变饲粮的育肥猪抗氧化指标的影响
Table 7 Effects of Arg and Glu on anti-oxidant indexes of finishing pigs fed a contaminated diet U/mL
|
脏器指数又称脏体比，是试验动物某脏器的重量与其体重之比值。正常情况下各脏器与体重的比值比较恒定。动物染毒后，受损脏器重量可以发生改变，脏器指数也随之而改变。因此，脏器指数是毒理试验中最为常用的一项指标。有研究报道，霉菌毒素进入体内能够影响肝脏、肾脏等器官指数[15]，造成脏器损伤。在本试验中，霉变饲粮造成肝脏和肾脏肥大增生，致使肝脏、肾脏指数升高；而脾脏产生萎缩等其他退行性改变，脾脏指数降低。大量研究已经证实，谷氨酸既能作为蛋白质合成的底物，又参与组织能量代谢[11, 16]，对机体病理代谢起着重要的作用。在本试验中添加2%谷氨酸能够对肝脏、脾脏和肾脏起到显著的保护效果。而添加1%精氨酸对脏器的保护作用不显著，这与周述旺等[17]报道的结果不一致。其原因可能是脏器病理机制不一，或是添加精氨酸含量不同造成的。
| 表8 精氨酸和谷氨酸对饲喂霉变饲粮的育肥猪肉品质的影响 Table 8 Effects of Arg and Glu on meat quality of finishing pigs fed a contaminated diet |
血清生理生化指标与代谢、营养及健康状况有着密切的联系，是反映动物机体生理机能的重要指标，也是临床医疗和科学研究的重要依据[18]。血清GLU含量和LDH活性能够反映机体受到应激的程度，在霉变饲粮刺激下，霉变组血清GLU含量和LDH活性有所上升，而添加1%的精氨酸能够显著降低LDH的活性，缓解育肥猪对霉变饲粮的应激。γ-GT和ALT活性是反映肝脏病变的2个重要指标，TP和ALB含量能够一定程度上反映肝脏的合成功能。大量研究表明，霉菌毒素能够影响血清生化指标，如ALB、TP含量及ALT活性等[19, 20]。在本试验中，霉变组血清γ-GT和ALT活性显著上升，TP和ALB含量显著下降。由此可见，霉变饲粮能够造成动物处于应激状态，且损坏肝脏功能，其原因可能是由于霉变饲粮中黄曲霉毒素B1对肝脏的损坏作用[21]，或是黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素以及伏马毒素B1中几种毒素的联合作用。在本试验中，添加1%精氨酸能够显著缓解由霉变饲粮造成的ALT和LDH活性的升高，而谷氨酸的缓解效果不显著。
血常规分析包括对血液中红细胞、白细胞和血小板这3个血细胞系统进行检测和分析，而这3个血细胞系统与血浆共同组成了血液，血液经过人体血液循环系统，来参与和完成机体代谢的每项功能活动。因此，血液对保证机体正常的功能调节、新陈代谢及体内外环境平衡起重要作用[22]。一些研究表明，玉米赤霉烯酮和呕吐毒素等霉菌毒素污染的饲粮能够显著影响机体血常规[23, 24]，如白细胞、红细胞、血小板数量以及血小板体积等。本试验结果表明，霉变饲粮对红细胞体积和血小板压积具有显著影响，而添加精氨酸或谷氨酸对部分血常规具有一定的缓解效果，这与徐成等[25]报道的结果相一致。其作用机理可能是由于精氨酸和谷氨酸能够促进蛋白质的合成以及血液细胞的增殖和分化[26]。
正常情况下，动物机体抗氧化系统趋于平衡，当受到应激刺激后，超氧自由基产生增多以至超过了机体抗氧化物(SOD和GSH-Px等)所能承受的范围，则抗氧化平衡被打破。当机体细胞长时间处于高浓度的超氧自由基的环境下，细胞会产生严重的氧化应激反应，从而造成细胞以及器官氧化损伤和炎症疾病[27, 28]。本试验发现，饲喂霉变饲粮能够显著降低SOD和GSH-Px活性，从而影响育肥猪血清抗氧化能力，造成氧化损伤。据报道，精氨酸能够增强机体的抗氧化能力，减少过氧化物的释放，改善脂质过氧化物反应[29]，而马现永等[30]报道，谷氨酸盐对动物机体抗氧化系统无影响。在本试验中，添加1%精氨酸能改善霉变饲粮对抗氧化系统造成的影响，而添加2%谷氨酸也对抗氧化系统具有显著作用，这与马现永等[30]报道的结果不一致。其作用机制可能是由于精氨酸和谷氨酸在体内分别能合成一氧化氮(NO)[31]和谷胱甘肽[32, 33]，而NO和谷胱甘肽在维持机体氧化平衡中具有重要的作用。
随着生活水平的提高，人们对畜禽产品品质尤其是肉品质的要求也越来越高。而有关霉变饲粮对猪肉品质的影响鲜有报道。陈代文[34]报道，氨基酸、能量和蛋白质能影响猪肉品质，且三者的比例能影响胴体构成。在本试验中，霉变饲粮对育肥猪肌肉pH45 min、pH24 h、肉色、大理石纹评分、嫩度以及熟肉率均有一定程度的影响，其中嫩度下降20.22%，而添加2%精氨酸能够显著缓解霉变饲粮对育肥猪嫩度的影响。肉的嫩度反映了肉中肌原纤维、结缔组织以及肌肉脂肪的含水量、分布和化学结构。嫩度的下降势必会影响到猪肉口感。由此可见，霉变饲粮能够影响猪肉品质，降低适口性，从而间接对食品工业造成负面影响。添加1%精氨酸能够显著提高猪肉的嫩度，但是谷氨酸对猪肉品质没有显著影响。
综上所述，霉变饲粮对育肥猪生长性能、脏器指数、血常规、血清生化、抗氧化指标以及肉品质都造成一定影响。而添加1%精氨酸或2%谷氨酸能够对霉变饲粮造成的肝脏病变、氧化应激、血清生化指标及肉品质的变化起到一定的缓解作用。
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