近年来，随着我国奶牛养殖业的快速发展，国内蛋白质饲料短缺，大豆等蛋白质原料主要依赖于进口，如何通过营养调控技术提高蛋白质的利用率一直是动物营养学研究的热点。同时，集约化、规模化的奶牛饲养模式导致大量未被利用的氮排放到环境中，其造成的环境污染和饲养成本上升问题已成为制约我国奶牛养殖业可持续发展的重要因素。在不影响奶牛生产性能的前提下，通过营养调控技术，提高奶牛蛋白质利用率，减少氮排泄，对于我国奶牛养殖业的发展具有积极的意义。肉桂醛(cinnamic aldehyde，CA)又名桂醛、桂皮醛、3-苯基-2-丙烯醛等，为黄色液体，可以从肉桂等植物中提取，也可以通过人工合成来获得^[1]。张勇等^[2]研究表明，在奶牛饲粮中添加大蒜油和肉桂醛复合物(GAR-CIN)可以显著提高产奶量，显著降低乳体细胞数，还能提高奶牛对营养物质的消化率。研究证明，在肉鸡饲粮中添加丝兰和肉桂植物提取物可以提高饲料氮的利用率，减少尿素氮、氨态氮(NH₃-N)及总氮的排泄量，减少了对环境造成的污染^[3]。目前，肉桂醛在反刍动物生产中的研究主要集中在其对瘤胃微生物发酵及甲烷生成的影响上，而饲粮中添加肉桂醛对尿中嘌呤衍生物(PD)排出量、产奶性能和氮排泄的影响却鲜见报道。因此，本试验拟在饲粮中添加不同水平的肉桂醛，探讨肉桂醛对奶牛尿中嘌呤衍生物排出量、产奶性能和氮排泄的影响，确定肉桂醛在奶牛饲粮中的适宜添加水平，以期提高奶牛对蛋白质饲料的利用率，提高奶牛产奶性能，降低奶牛饲养成本和氮排泄，为我国奶牛养殖业的可持续发展提供技术支持。

1 材料与方法 1.1 试验设计

本试验采用单因素随机区组设计，选用青岛奥特奶牛良种场年龄、体重、胎次、产奶量、乳成分及泌乳期[(90±15) d]相近的荷斯坦奶牛40头，随机分为4组，每组10头。对照组和试验1、2、3组分别在饲粮中添加0、12、18和24 g/(d·头)肉桂醛。每头奶牛每天预留0.5 kg精料将其作为载体与肉桂醛混合，剩余的精料与粗饲料混匀后制成全混合日粮(TMR)，TMR组成及其营养水平见表 1。肉桂醛与精料混匀后随TMR饲喂，整个试验期为75 d，其中预试期15 d，正试期60 d。试验所用肉桂醛为肉桂醛复合物，由青岛润博特生物科技有限公司提供，为白色粉末状物质，其组成为肉桂醛、二氧化硅和淀粉等，其中肉桂醛≥5%，水分≤12%。

1.2 饲养管理

试验牛分栏饲喂，单独记录每头牛的采食量。预试期内每隔2 d称1次TMR剩料量，并记录投料量，每次在饲喂之前先收集上次的剩料并称重，根据每次的投料量和剩料量计算每头牛的采食量，共记录6次。预试期结束后，根据6次采食量计算出预试期内平均采食量。正试期内每隔10 d记录1次采食量，共记录6次，每次连续记录3 d，根据3 d的采食量计算平均采食量，按照每次平均采食量调整下一阶段的TMR投料量。正试期结束后，根据6次采食量计算出正试期内平均采食量。试验牛每日采用利拉伐挤奶器挤奶2次(04:00、16:00)，每日饲喂TMR 2次(04:30、16:30)，并且确保奶牛每日有20 h以上时间能够接触到TMR。试验牛采食后能够在运动场自由饮水和运动，按照常规对其进行驱虫、光照和管理。

1.3 样品采集与测定 1.3.1 尿样

预试期第1~3天、正试期第28~30天、正试期第58~60天时收集3次尿样，参考朱雯^[6]点收尿法采样，每次采样时使用人工接尿结合膀胱取尿的方式进行采样，每天收集2次尿样，每隔12 h采集1次，连续采集3 d，每天采集尿样的时间在前1天的基础上延后4 h，收集的尿液按一定比例加98%的浓硫酸，调整pH(pH < 3)，-20 ℃保存。采用凯氏定氮法分析尿氮含量^[5]，采用脲酶法测定尿素氮含量^[7]，采用苦味酸比色法测定尿肌酐含量^[8]，测定所需试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。参考Valadares等^[8]的试验方法，用尿肌酐(每头牛每天1 kg体重约排出29 mg尿肌酐)标记来测定试验牛的排尿量。

1.3.2 饲料样和粪样

按四分法收集TMR样品，并在65 ℃烘箱中烘干制成风干样，粉碎后备用。预试期第1~3天、正试期第28~30天、正试期第58~60天使用全收粪法采集3次粪样，连续3 d进行24 h全收粪，每组收集10头试验牛的粪样。收粪前先将牛床冲洗干净，并及时将粪样收集起来，每天将收集的粪样混匀并称重，并采用四分法收集当天的粪样，按每100 g粪样添加25 mL 10%的硫酸对其进行固氮处理后放入-20 ℃冰箱中冷冻保存，采样期最后1天将3 d内所留的粪样按照重量比例均匀混合，然后将其放入65 ℃烘箱中烘至恒重保存。参照张丽英^[5]主编的《饲料分析及饲料质量检测技术》中的检测方法，测定饲粮和粪中粗蛋白质(CP)的含量。

1.3.3 产奶量和乳成分

每天使用利拉伐鱼骨式挤奶机挤奶2次(04:00、16:00)，自动显示产奶量。预试期、正试期每隔5 d记录1次试验牛产奶量，每次连续记录3 d，取平均值。

分别在预试期第1天和正试期每隔15 d收集乳样，按照早、晚产奶量的比例进行收集，共收集65 mL，其中50 mL需添加重铬酸钾防腐剂(0.6 mg/mL)，将其混合均匀后放入4 ℃冰箱中冷藏用于测定乳成分，剩余15 mL乳样经离心处理去除乳脂和乳蛋白后，取1.5 mL处理后的乳样将其置于-20 ℃冰箱中冷冻，用于测定乳尿素氮的排泄量。使用山东省农业科学院奶牛研究中心生产性能测定实验室的乳成分和体细胞自动分析仪(丹麦Foss公司生产，型号CombiFoss FT+)测定乳脂率、乳蛋白率、乳糖率以及乳体细胞数，使用加权平均法计算正试期各乳成分的含量。

1.3.4 尿中嘌呤衍生物排出量

尿中含有的嘌呤衍生物主要来自瘤胃微生物嘌呤，因此瘤胃微生物蛋白(MCP)产量可以通过嘌呤衍生物进行估测。分别采用尿酸测定试剂盒和酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定尿中尿酸和尿囊素的含量，其中尿酸含量测定中，无蛋白滤液中的尿酸在碱性状态下还原磷钨酸生成钨蓝、尿囊素和二氧化碳，蓝色深浅与尿酸含量呈正比，使用UV-1800PC分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)进行比色，计算出尿酸的含量。尿囊素含量的测定，往预先包被尿囊素抗体的包被微孔中，依次加入样本、标准品、辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤后加底物3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺(TMB)显色，TMB在过氧化氢酶的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下最终转化为黄色，颜色的深浅与尿囊素的含量呈正相关，使用MK3型酶标仪[赛默飞世尔(上海)仪器有限公司]测定其吸光度，通过标准曲线计算出尿囊素的含量^[9]。尿中嘌呤衍生物的含量为尿酸与尿囊素之和^[10]，其计算公式如下：

1.4 数据处理与分析

使用Excel 2016软件对试验数据进行初步处理。使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，Duncan氏法多重比较检验组间差异显著性，以P < 0.05和P < 0.01分别表示差异显著和极显著，结果以平均值±标准误表示。

2 结果 2.1 肉桂醛对奶牛尿中嘌呤衍生物排出量的影响

由表 2可知，在尿酸含量方面，试验1和2组均极显著高于对照组(P < 0.01)，试验3组显著高于对照组(P < 0.05)，而各试验组之间无显著差异(P>0.05)。在尿囊素含量方面，各试验组均极显著高于对照组(P < 0.01)，其中试验2组极显著高于试验3组(P < 0.01)，试验2组与试验1组之间无显著差异(P>0.05)，试验3组和试验1组之间无显著差异(P>0.05)。在嘌呤衍生物排出量方面，各试验组均极显著高于对照组(P < 0.01)，其中试验2组极显著高于试验3组(P < 0.01)，试验2组与试验1组之间无显著差异(P>0.05)，试验3组与试验1组之间无显著差异(P>0.05)，试验1、2、3组的嘌呤衍生物排出量与对照组相比，分别提高了14.22%、17.62%、10.49%。

2.2 肉桂醛对奶牛干物质采食量和产奶性能的影响

由表 3可知，肉桂醛对奶牛干物质采食量影响较小，各试验组与对照组相比差异不显著(P>0.05)。在产奶量方面，试验1和2组均极显著高于对照组(P < 0.01)，而试验2组与试验1组之间无显著差异(P>0.05)，试验3组显著高于对照组(P < 0.05)，试验3组与试验1组之间无显著差异(P>0.05)，试验1、2、3组的产奶量分别比对照组提高了10.80%、12.15%、6.48%。在乳脂率方面，试验1和2组均极显著高于对照组(P < 0.01)；其中试验2组显著高于试验1组(P < 0.05)，极显著高于试验3组(P < 0.01)；试验3组与对照组之间无显著差异(P>0.05)。在乳蛋白率方面，各试验组均极显著高于对照组(P < 0.01)，其中试验2组极显著高于试验1和3组(P < 0.01)，而试验1组与试验3组之间无显著差异(P>0.05)。在乳体细胞数方面，各试验组均极显著低于对照组(P < 0.01)，其中试验2组极显著低于试验3组(P < 0.01)，试验2组与试验1组之间无显著差异(P>0.05)，试验3组与试验1组之间无显著差异(P>0.05)。

2.3 肉桂醛对奶牛氮排泄的影响

由表 4可知，在粪氮排泄量方面，试验1和2组均极显著低于对照组(P < 0.01)；其中试验2组显著低于试验3组(P < 0.05)，与试验1组之间无显著差异(P>0.05)；试验3组显著低于对照组(P < 0.05)，与试验1组之间无显著差异(P>0.05)。在尿氮排泄量方面，各试验组均极显著低于对照组(P < 0.01)；其中试验2组极显著低于试验3组(P < 0.01)，与试验1组之间无显著差异(P>0.05)；试验3组与试验1组之间无显著差异(P>0.05)。在乳尿素氮含量方面，试验2组极显著低于对照组(P < 0.01)，显著低于试验3组(P < 0.05)，与试验1组之间无显著差异(P>0.05)；试验1组显著低于对照组(P < 0.05)，试验3组与对照组之间无显著差异(P>0.05)。在氮总排泄量方面，各试验组均极显著低于对照组(P < 0.01)，试验1、2、3组分别比对照组减少了9.76%、14.13%、7.39%；其中试验2组显著低于试验1组(P < 0.05)，极显著低于试验3组(P < 0.01)；试验1组和试验3组之间无显著差异(P>0.05)。在可消化氮含量方面，试验2组极显著高于对照组(P < 0.01)，显著高于试验3组(P < 0.05)，与试验1组之间无显著差异(P>0.05)；试验1和3组显著高于对照组(P < 0.05)，而2组间无显著差异(P>0.05)。在氮表观消化率方面，试验1和2组均极显著高于对照组(P < 0.01)；其中试验2组显著高于试验3组(P < 0.05)，与试验1组之间无显著差异(P>0.05)；试验3组显著高于对照组(P < 0.05)，与试验1组之间无显著差异(P>0.05)。

3 讨论 3.1 肉桂醛对奶牛尿中嘌呤衍生物排出量的影响

金恩望^[11]体外发酵试验中指出，在奶牛瘤胃发酵液中分别添加500和1 500 mg/L的肉桂油，发酵72 h后能够显著提高发酵液中MCP的含量。尿中嘌呤衍生物排出量与MCP含量存在高度相关性，其排出量的多少反映了MCP的产量的多少。研究表明，尿嘌呤衍生物法不仅能准确估测MCP产量变化，还具有操作方便和非侵入性等优点^[12]。本试验结果表明，在饲粮中添加肉桂醛能显著提高尿中嘌呤衍生物排出量，与上述结论一致。瘤胃液中NH₃-N浓度作为衡量瘤胃氮代谢的一项重要指标，其浓度间接反映了瘤胃微生物利用NH₃-N合成MCP和瘤胃微生物分解饲粮蛋白质生成NH₃-N的平衡状况，如果NH₃-N的浓度上升，说明瘤胃微生物分解饲粮蛋白质生成NH₃-N的速度大于微生物利用NH₃-N合成MCP的速度，如果NH₃-N的浓度降低，则表明瘤胃微生物利用NH₃-N合成MCP的速度大于NH₃-N的生成速度^[13]。Fraser等^[14]在体外发酵试验中指出，在瘤胃液中添加500 mg/L的肉桂醛可以显著降低NH₃-N的浓度。Cardozo等^[15]的体外试验研究发现，肉桂醛可以通过抑制瘤胃微生物的脱氨作用来降低瘤胃液中NH₃-N的浓度。

3.2 肉桂醛对奶牛干物质采食量和产奶性能的影响

曹爱青^[16]研究发现，每天在肉牛饲粮中添加300、600、900 mg肉桂醛时，肉牛干物质采食量有所下降，但是饲料转化率呈明显的线性增加趋势；当每天添加1 200 mg肉桂醛时会极显著降低干物质采食量，其饲料转化率也呈明显的下降趋势。Yang等^[17-18]研究表明，在饲粮中添加不同水平的肉桂醛可以有助于提高肉牛干物质采食量，减少应激的作用，但是差异不显著。本试验结果表明，在饲粮中添加不同水平的肉桂醛，对奶牛干物质采食量影响较小。产奶量、乳脂率、乳蛋白率和乳体细胞数是衡量奶牛产奶性能的重要指标，张勇等^[2]研究发现，在奶牛饲粮中添加30 g/(d·头)大蒜油和肉桂醛复合物，试验组平均产奶量与对照组相比显著提高了22.4%，乳体细胞数显著降低了11.0%，对于乳脂率和乳蛋白率没有显著影响，但是有降低乳尿素氮含量的趋势。周明等^[19]研究表明，肉桂醛具有降糖调脂的作用，可促进葡萄糖转化为脂肪。本试验结果表明，在奶牛饲粮中添加肉桂醛后，能提高奶牛的产奶量、乳脂率和乳蛋白率，降低乳体细胞数。徐晓明等^[20]研究了饲粮中添加以大蒜和肉桂为基础的植物提取物NE300对泌乳初期奶牛生产性能的影响，结果表明NE300可以降低蛋白质在瘤胃中的降解率，显著提高泌乳初期奶牛的产奶量，极显著降低乳体细胞数。Kung等^[21]研究表明，降低瘤胃中蛋白质的分解速度，以增加到达小肠的氨基酸数量，是提高奶牛产奶量的常见做法。Taylor等^[22]发现，提高奶牛饲粮蛋白质的过瘤胃率，可以提高奶牛产奶量、乳脂率和乳糖率。Cardozo等^[15]研究表明，低剂量的肉桂油可以降低乳尿素氮和乳体细胞数，可能是由于肉桂油影响了瘤胃微生物氮代谢，提高了氨基酸含量，减少了氨的生成引起的。乳体细胞数是衡量奶牛乳房健康状况的重要指标，乳体细胞数越低，表明乳房的健康状况越好，隐形乳房炎的发病率就越低。Sung等^[23]研究肉桂醛对3周龄肉鸡的影响时发现，肉桂醛能够提高机体的免疫力，添加25~400 ng/mL的肉桂醛能极显著提高脾淋巴细胞的增殖能力，添加1.2~5.0 μg/mL的肉桂醛能极显著活化巨噬细胞的吞噬能力，添加14.4 mg/kg的肉桂醛能极显著提高淋巴细胞的2~47褶皱处白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-15以及β-干扰素的含量。张文平等^[24]在体外研究柠檬醛和肉桂醛对抗曲霉菌活性的影响时指出，肉桂醛还具有良好的抑菌杀菌作用，能够破坏细菌或真菌结构和功能的完整性，其结构中的醛基为亲水基，容易被真菌表面的亲水基吸附，从而破坏细胞壁的多糖结构穿透细胞壁。肉桂醛的抑菌杀菌作用和提高机体免疫力的功能，都有助于提高乳房的健康水平，从而降低乳体细胞数。

3.3 肉桂醛对奶牛氮排泄及氮表观消化率的影响

氨是饲粮蛋白质的降解产物之一，也是瘤胃微生物生长所需的主要氮源。瘤胃原虫具有较强的脱氨基能力，却不能利用NH₃-N进行生长繁殖，因此驱除原虫可以降低NH₃-N的浓度，提高瘤胃的氮存留率^[25]。Benchaar等^[26]在植物精油调控瘤胃发酵的研究中指出，植物精油降低NH₃-N浓度的重要原因在于抑制了瘤胃产氨菌。林波等^[27]研究肉桂油及其主要成分对体外瘤胃发酵和甲烷产生的影响时指出，添加200 mg/L肉桂油降低瘤胃NH₃-N浓度的原因可能是抑制了瘤胃原虫和产气菌。金恩望^[11]研究表明，添加300和1 500 mg/L肉桂醛可以显著降低瘤胃体外发酵过程中NH₃-N的浓度。瘤胃氮代谢也与MCP的产量密切相关，肉桂醛能够提高瘤胃微生物利用NH₃-N合成MCP的速度，增加了瘤胃MCP的产量，进而减少了NH₃-N的损失，降低了氮排放。肉桂醛是植物提取物的一种，它具有防止饲料霉变、促进动物生长和提高饲料利用率的功能，并且能够明显提高饲粮中氮素的贮留量，对于蛋白质的合成具有积极的意义。曹爱青^[16]研究发现，每天在肉牛饲粮中添加300、600、900 mg的肉桂醛时，肉牛饲料转化效率呈明显的线性增加趋势；当添加量为1 200 mg/d时，肉牛的饲料转化率呈明显的下降趋势。本试验中，饲粮添加肉桂醛后显著降低了粪、尿中氮的排泄量，显著提高了氮表观消化率。

4 结论

在奶牛饲粮中添加适宜水平的肉桂醛可以显著提高尿中嘌呤衍生物的排出量、减少氮排泄、提高奶牛产奶性能，综合考虑上述指标，在本试验条件下，奶牛饲粮中肉桂醛的适宜添加水平为18 g/(d·头)。