近年来，我国奶牛养殖业的蓬勃发展，特别是集约化、规模化程度的不断提高，有效缓解了奶牛市场供求矛盾，但同时奶牛粪污也对周边环境造成了严重污染，其中氮污染对环境的影响已经被公认为是造成环境污染的重要因素之一。反刍动物瘤胃是一个相对稳定的厌氧发酵系统，其中宿主与微生物之间以及微生物与微生物之间存在着一种既协同又相互制约的动态平衡关系^[1]。由于瘤胃微生物对饲粮蛋白质的降解以及对氨基酸的脱氨基作用，导致饲粮蛋白质不能有效地为瘤胃微生物和宿主提供氨基酸，同时过量的氨态氮(NH₃-N)也会超出微生物的利用能力，造成饲粮蛋白质的浪费。因此，通过营养调控技术，在不影响奶牛产奶性能的前提下，提高饲粮蛋白质的利用率，减少氮排泄量，对于解决奶牛养殖过程中产生的氮污染问题具有积极的意义。蛋氨酸作为反刍动物的第一或第二限制性氨基酸，尤其对高产奶牛而言显得更为重要，并有生命氨基酸之称^[2]。邹阿玲等^[3]给泌乳早期荷斯坦奶牛补饲过瘤胃蛋氨酸(rumen-protected methionine，RPMet)后，产奶量、乳蛋白率和牛奶比重均显著提高，同时RPMet还能提高乳脂率和乳非脂固形物的含量。杨维仁^[4]在肉牛瘤胃内投饲动物油包被的蛋氨酸后发现，可以显著提高可消化氮和沉积氮。肉桂醛(cinnamic aldehyde，CA)又被称为桂醛、桂皮醛、三苯基丙烯醛等，为黄色液体，既可以从肉桂等植物中提取，也可以通过人工合成获得^[5]。Cardozo等^[6]发现低水平肉桂油能够降低乳尿素氮含量和乳体细胞数。曹爱青^[7]在肉牛饲粮中添加300、600、900 mg/(d·头)CA，饲料转化效率呈显著的线性增加趋势。本课题组前期的试验分别研究了RPMet对奶牛产奶性能和氮排泄的影响、CA对奶牛产奶性能和氮排泄的影响，并确定了RPMet和CA的最适添加水平分别为25和18 g/(d·头)^[8-9]。目前，RPMet和CA联合使用对奶牛产奶性能和氮排泄影响的研究鲜有报道，最适添加水平组合也尚不清楚。本试验拟在前期试验最适添加水平的基础上，将RPMet[最适添加水平(25±5) g]和CA[最适添加水平(18±3) g]分别设置3个水平，共9个不同水平组合，探究RPMet和CA的最适添加水平组合，以期提高饲粮蛋白质的利用率和奶牛的产奶性能，降低奶牛的氮排泄，同时也为RPMet和CA在奶牛生产上的联合使用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验设计

本试验选用青岛奥特奶牛良种场年龄、体重、胎次、产奶量、乳成分及泌乳期[(90±15) d]相近的荷斯坦奶牛40头，随机分为10组，每组4头。对照(C)组饲喂基础饲粮，试验组补饲不同水平的RPMet和CA，其中RPMet设3个水平，分别为20、25、30 g/(d·头)；CA设3个水平，分别为15、18、21 g/(d·头)，共组成9个不同水平组合，设计方案见表 1。每头奶牛每天预留0.5 kg精料，将其作为载体与RPMet和CA混合，剩余的精料与粗饲料混匀后制成全混合日粮(TMR)。RPMet和CA与精料混匀后再随TMR一起饲喂，整个试验期为75 d，其中预试期15 d，正试期60 d。试验所用的RPMet(过瘤胃率为85%)和CA均购自青岛润博特生物科技有限公司，其中RPMet为白色颗粒状物质，其组成为DL-蛋氨酸、二氧化硅等，DL-蛋氨酸≥60%，水分≤12%；CA为白色粉末状物质，其组成为CA、二氧化硅和淀粉等，CA≥5%，水分≤12%。

1.2 饲养管理

每天采用利拉伐挤奶机挤奶2次(04:00、16:00)，每天饲喂TMR 2次(04:30、16:30)，并且确保奶牛每天有20 h以上能够接触到TMR。试验牛采食后可以在运动场自由饮水和运动，按照常规对其进行驱虫、光照和管理。TMR组成及营养水平见表 2。

1.3 试样采集与指标测定 1.3.1 采食量测定

试验牛分栏饲喂，单独记录每头牛的采食量。预试期第1~3天、第5~7天、第9~11天、第13~15天记录每头试验牛的投料量和剩料量，根据每次的投料量和剩料量计算每头牛的采食量。预试期结束后，计算出预试期内平均采食量。正试期内每10 d记录1次采食量，共记录6次，每次连续记录3 d，根据3 d的采食量计算平均采食量，按照每次平均采食量调整下一阶段的TMR投料量。正试期结束后，根据6次采食量计算出正试期内平均采食量，用于计算主要养分采食量。

1.3.2 TMR样和粪样的采集与测定

按四分法收集TMR样，并在烘箱中65 ℃烘干制成风干样，粉碎后备用^[11]。分别在预试期第1~3天、正试期第28~30天、正试期第58~60天采集3次粪样，采用全收粪法进行，每组收集4头试验牛粪样。采集粪样前应先将牛床冲洗干净，每天及时收集粪样，将全部粪样混匀后称重，并按四分法收集当天的粪样，按每100 g粪样添加25 mL 10%的硫酸固氮处理后放入冰箱－20 ℃冷冻保存，采样结束后将3 d内所留的粪样按样重比例均匀混合，放入烘箱中65 ℃烘至恒重后保存。TMR样：采用GB/T 6435—2006测定水分含量，计算干物质(DM)含量；采用凯氏定氮法(GB/T 6432—1994) 测定粗蛋白质(CP)含量；采用NY/T 1459—2007测定酸性洗涤纤维(ADF)含量；采用GB/T 20806—2006测定中性洗涤纤维(NDF)含量；采用高锰酸钾法(GB/T 6436—2002) 测定钙(Ca)含量；采用分光光度法(GB/T 6437—2002) 测定磷(P)含量。粪样粗蛋白质含量测定同TMR样。

1.3.3 尿样的采集与测定

预试期第1~3天、正试期第28~30天、正试期第58~60天采集3次尿样，参考朱雯^[12]报道的点收尿法采样，每次采样时使用人工接尿结合膀胱取尿的方式进行采样，即先使用颈夹将牛固定，再把导尿管插到膀胱中依次采集每头牛的尿样，如果采集过程中试验牛出现自主排尿的姿势，则由专人负责接尿^[11]，每天收集2次尿样，每隔12 h收集1次，连续收集3 d，每天收集尿样的时间在前1天的基础上延后4 h，收集的尿液按一定比例添加98%的浓硫酸，调整pH(pH＜3)，-20 ℃保存。

1.3.4 乳样的采集与测定

使用利拉伐鱼骨式挤奶机挤奶2次(04:00、16:00)，自动显示产奶量。预试期和正试期每隔5 d记录1次试验牛产奶量，每次连续记录3 d，取平均值。

在正试期第15、30、45、60天，按早、晚产奶量的比例共收集65 mL乳样，其中50 mL添加重铬酸钾防腐剂(0.6 mg/mL)，混匀后放入冰箱4 ℃保存用于测定乳成分含量，剩余15 mL经离心处理去除乳脂和乳蛋白后，取1.5 mL处理样置于冰箱中-20 ℃冷冻保存，用于测定乳尿素氮的含量。使用山东省农业科学院奶牛研究中心生产性能测定实验室的乳成分和体细胞自动分析仪(CombiFoss FT⁺，丹麦Foss公司)测定乳脂率、乳蛋白率、乳糖率以及乳体细胞数，并使用加权平均数法计算正试期各乳成分的含量。

1.3.5 氮代谢指标的测定

采用福斯Kjeltec^TM 8200凯氏定氮仪(丹麦Foss公司)测定尿氮含量，采用苦味酸比色法^[13]测定尿肌酐含量，使用UV-1800PC分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)进行比色，测定所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所。参考Valadares等^[13]的试验方法，用尿肌酐(每头牛每天1 kg体重约排出29 mg尿肌酐)标记来测定试验牛的排尿量。

氮代谢计算公式：

粪氮(g/d)=日排粪量×粪中粗蛋白质含量×0.16；

总氮排泄量(g/d)=粪氮+尿氮；

氮表观消化率(%)=[(饲粮食入氮-粪氮)/饲粮食入氮]×100；

氮泌乳转化效率(%)=乳氮/饲粮食入氮×100。

1.4 数据处理与分析

使用Excel 2016软件对试验数据进行初步处理。使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，Duncan氏法多重比较检验组间差异显著性，以P < 0.05和P < 0.01分别表示差异显著和极显著，结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析 2.1 添加不同水平组合RPMet和CA对奶牛主要养分采食量的影响

由表 3可以看出，饲粮中添加不同水平组合的RPMet和CA有利于提高奶牛的主要养分采食量，但试验组与C组之间均无显著差异(P>0.05)。

2.2 添加不同水平组合RPMet和CA对奶牛产奶量的影响

由表 4可以看出，LL、ML、HL、LM、MM、HM、LH、MH、HH组产奶量分别比C组提高了16.07%(P < 0.01)、19.40%(P < 0.01)、22.17%(P < 0.01)、12.49%(P < 0.01)、13.46%(P < 0.01)、15.27%(P < 0.01)、3.94%(P>0.05)、6.60%(P < 0.05)、9.30%(P < 0.01)，其中以HL组最高。

2.3 添加不同水平组合RPMet和CA对奶牛乳成分含量的影响

由表 5可以看出，乳脂率以HL组最高，其极显著高于C、LM、LH、MH、HH组(P < 0.01)，显著高于MM组(P < 0.05)；在乳蛋白率方面，也以HL组最高，其极显著高于C、LM、LH、MH、HH组(P < 0.01)，显著高于MM、HM组(P < 0.05)；补饲RPMet和CA后乳体细胞数降低，以HL组最低，极显著低于C组(P < 0.01)；补饲RPMet和CA后，各组间乳糖率差异不显著(P>0.05)。

2.4 添加不同水平组合RPMet和CA对奶牛氮表观消化率及氮排泄的影响

由表 6可以看出，补饲RPMet和CA后，奶牛粪氮和尿氮的排泄量均降低。LL、ML、HL、LM、MM、HM、LH、MH、HH组总氮排泄量比C组分别减少了17.45%(P < 0.01)、18.79%(P < 0.01)、20.80%(P < 0.01)、10.41%(P < 0.01)、12.49%(P < 0.01)、15.22%(P < 0.01)、3.37%(P>0.05)、5.12%(P < 0.05)、7.43%(P < 0.05)，其中以HL组最低。添加RPMet和CA后，各试验组氮表观消化率和氮泌乳转化效率均提高，除LH组外均显著或极显著高于C组(P < 0.05或P < 0.01)。

3 讨论 3.1 添加不同水平组合RPMet和CA对奶牛主要养分采食量的影响

干物质采食量(DMI)作为影响奶牛生产性能的重要因素，提高奶牛DMI有助于为泌乳活动提供更多的营养物质和能量。本试验中，饲喂CA少的试验组DMI相对较高，因此，低水平的CA有提高DMI的趋势，RPMet对DMI影响较小。武安泉等^[14]给绵羊饲喂N-乙酰-DL-蛋氨酸后，有提高绵羊DMI的趋势。张勇等^[15]给奶牛饲喂大蒜油和CA的复合物，也有助于提高DMI。饲喂RPMet和CA后奶牛DMI得到提高，可能是因为RPMet和CA改善了瘤胃内环境，促进了瘤胃和肠道对营养物质的消化吸收；饲粮中补饲CA能够增加唾液的分泌量^[5]，唾液呈碱性有助于维持瘤胃内pH的稳定，同时RPMet在瘤胃中游离出来的少量蛋氨酸，可以改善瘤胃内的营养环境，促进瘤胃微生物的生长与繁殖^[16]，加快了饲粮的分解速率。另外，CA可以促进消化液的分泌，增强消化功能，解除胃、肠平滑肌痉挛以及痉挛性疼痛，也有利于提高DMI^[5]。

3.2 添加不同水平组合RPMet和CA对奶牛产奶量的影响

产奶量作为衡量奶牛产奶性能的重要指标之一，在本试验条件下，CA添加水平低的试验组产奶量显著提高，当CA添加水平相同时，RPMet添加水平多的组产奶量提高幅度较大，其中以HL组最好。韩兆玉等^[17]和张勇等^[15]分别用RPMet和大蒜油与CA的复合物饲喂奶牛后发现，均能提高奶牛的产奶量。Rhoads等^[18]研究发现，奶牛的泌乳系统主要受到以生长激素(GH)为核心的生长激素轴的调控，Macrina等^[19]对泌乳早期奶牛进行GH处理后发现，产奶量比对照组提高了36%。GH和胰岛素(INS)之间相互作用，能够加速乳腺代谢，促使营养物质向乳腺转运，为乳的合成提供更多的前体物质^[20]。饲粮中添加RPMet和CA后能提高血清GH和胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)的含量^[21-22]，其中IGF-Ⅰ能促进乳腺的发育和乳腺细胞的增殖，间接促进了奶牛泌乳^[23]；CA降低了饲粮蛋白质的降解率，提高了到达小肠的氨基酸数量^[24]，对提高奶牛产奶量起到积极的作用；另外，RPMet和CA均能改善瘤胃内环境，促进瘤胃微生物的生长与繁殖，提高了对营养物质的消化吸收，也有利于产奶量的提高。

3.3 添加不同水平组合RPMet和CA对奶牛乳成分含量的影响

乳脂率、乳蛋白率作为评价乳品质的重要指标，在本试验中，补饲RPMet和CA后，试验牛乳脂率和乳蛋白率得均到提高。韩兆玉等^[17]夏季在奶牛饲粮中补饲12 g/d RPMet，可以提高乳脂率和乳蛋白率，降低乳体细胞数。张勇等^[15]给泌乳初期奶牛补饲大蒜油和CA的复合物后，显著提高了试验组产奶量，显著降低了乳体细胞数。当奶牛处于泌乳高峰期时乳蛋白率普遍较低，主要是由于奶牛在泌乳初期DMI的增加幅度低于产奶量的提高幅度，导致奶牛处于营养负平衡状态，因此需要在奶牛泌乳初期补充RPMet以保证乳品质^[25]。如果直接给奶牛补饲蛋氨酸，则大部分都会被瘤胃微生物所降解，能够到达小肠被吸收利用的蛋氨酸较少，最终失去了添加的意义。本试验研究表明，当饲喂相同水平的CA时，高水平的RPMet更有助于提高乳脂率和乳蛋白率，其中以HL组最好。乳脂率和乳蛋白率提高的原因，可能是饲喂RPMet和CA后提高了机体GH和INS的含量，GH能促进乙酰辅酶A羟化酶、脂肪酸合成酶和脂蛋白酶的合成(乙酰辅酶A羟化酶为脂肪酸合成的限速酶)^[23]，这3种酶的合成量增加有利于促进脂肪酸等物质的合成，为泌乳活动提供更多的前体物质和能量；INS则是乳腺发育和维持乳腺功能的必需激素，直接调节乳腺组织蛋白质的合成^[26]；同时，GH和INS的交互作用可以显著提高泌乳早期奶牛产奶量和乳蛋白产量^[27]；另外，RPMet和CA可以改善瘤胃内的营养环境，促进了瘤胃微生物蛋白的合成，进而为乳蛋白的合成提供了更多的前体物质。RPMet中含有的少量过瘤胃脂肪可以为乳脂的合成提供原料^[28]，CA具有降糖调脂的作用^[5]，都有助于提高乳脂率。

乳体细胞数作为衡量乳品质和奶牛乳房健康状况的重要指标，乳体细胞数越少，表明乳房的健康状况越好，隐性乳房炎的发病率就越低。在本试验条件下，饲粮中同时添加RPMet和CA后，乳体细胞数得到降低，说明乳房健康状况得到改善。RPMet和CA均能提高机体的免疫力，其中RPMet可以清除体内的自由基，降低淋巴细胞的凋亡率，提高奶牛机体的免疫力和抗氧化能力^[17]，CA可以显著提高淋巴细胞的增殖能力，极显著活化巨噬细胞的吞噬能力^[29]。另外，CA还具有良好的抑菌杀菌作用，其结构中的醛基为亲水基，容易被真菌表面的亲水基所吸附，从而破坏细胞壁的多糖结构穿透细胞壁^[30]。抑菌杀菌作用和提高机体免疫力的功能，都有助于降低乳体细胞数，提高乳房的健康状况。

3.4 添加不同水平组合RPMet和CA对奶牛氮表观消化率及氮排泄的影响

瘤胃内NH₃-N的损失是造成奶牛饲粮蛋白质利用率较低的重要因素，因此通过营养调控技术提高奶牛瘤胃内NH₃-N的利用率，对于提高氮利用率、减少氮排泄都有重要的意义。蛋氨酸作为反刍动物第一或第二限制性氨基酸^[2]，其缺乏不仅会影响氨基酸平衡，还会限制其他氨基酸的利用，不能利用的氨基酸以氨的形式经过鸟氨酸循环转化为尿素随尿液排出体外。本试验结果表明，CA添加水平低的试验组总氮排泄量极显著降低，当CA的添加水平相同时，RPMet添加水平高的试验组氮排泄降低幅度最大，其中以HL组最好。CA可以降低蛋白质在瘤胃中的降解率^[24]，降低了瘤胃内因蛋白质分解过快而导致的氮损失，RPMet在瘤胃内游离出来的少量蛋氨酸可以改善瘤胃内的营养环境，促进瘤胃微生物的生长与繁殖^[16]，进而加快了瘤胃微生物利用NH₃-N的速度，减少了瘤胃内NH₃-N的损失，RPMet和CA对瘤胃内NH₃-N生成速度和利用速度的调控有利于改善两者的平衡状态，提高氮利用率，减少氮排泄。RPMet在瘤胃后消化道中有效释放的蛋氨酸有助于提高小肠蛋氨酸的数量，促使小肠内的氨基酸组成趋向平衡，提高了小肠氨基酸的利用率^[31]，减少了氮排泄；CA能够促进肠道丁酸的分泌，而丁酸不仅能刺激消化道细胞的增殖分裂，还能刺激胰脏的腺体分泌大量的消化酶，进而提高消化道对养分的吸收能力^[32-33]，也有助于减少氮排泄。

4 结论

奶牛饲粮中同时添加RPMet和CA能够提高奶牛产奶性能、减少氮排泄，综合考虑上述指标，最佳组合为RPMet 30 g/(d·头)、CA 15 g/(d·头)。