近年来，抗生素的药物残留问题及其危害日益突出，禁用抗生素已是大势所趋。因此，研发饲用抗生素替代品成为动物营养领域的一个研究热点。发酵饲料是利用益生菌对饲料进行发酵得到的一种新型微生物类饲料，其在生产过程中微生物发酵可以产生大量有益于动物健康的代谢产物，具有提高饲料利用率、改善肠道健康等特点^[1]。因此，发酵饲料可以在一定程度上减少养殖过程中饲用抗生素的使用，从而降低养殖成本。目前，关于蛋鸭养殖中使用发酵饲料的信息很有限，研究发酵饲料在蛋鸭饲粮中的合理应用技术对蛋鸭健康养殖具有重要意义。

近年来研究显示，在家禽生产中使用发酵饲料可维持家禽消化道微生态平衡、增强机体免疫力、提高生长性能^[2-4]。崔卫涛等^[5]报道，饲粮添加4%发酵棕榈粕可提高蛋鸡产蛋性能、鸡蛋哈氏单位和蛋黄色泽，改善蛋品质。Feng等^[6]在饲粮中添加发酵豆粕显著提高了1~21日龄肉仔鸡小肠内容物中胰蛋白酶、脂肪酶和糜蛋白酶活性。蛋鸭养殖模式粗放，由病毒、细菌感染、恶劣饲养环境等导致的肠道性疾病非常普遍，造成蛋鸭产蛋性能和蛋品质下降，机体抗氧化和免疫机能低下。目前，有关发酵饲料在蛋鸭生产中的应用报道较少，不同底物来源发酵饲料对蛋鸭产蛋性能、蛋品质、肠道消化酶活性及免疫功能的影响未见报道。因此，本试验拟采用复合益生菌对以玉米、豆粕、麸皮为底物和以酒糟为底物分别发酵制备发酵饲料，研究不同发酵饲料对产蛋高峰期蛋鸭产蛋性能、蛋品质、肠道消化酶活性及免疫功能的影响，旨在为发酵饲料在蛋鸭生产中合理应用提供参考依据。

1 材料与方法 1.1 试验设计与饲养管理

试验在广东省农业科学院动物科学研究所原花都蛋鸭实验基地进行，试验选用35周龄的福建龙岩山麻母鸭750只，随机分为5个组，每组6个重复，每个重复25只鸭。试验鸭地面平养(水域面积:陆地面积为1 : 3)。蛋鸭产蛋率在80%以上时开始正式试验，试验期间自由采食和饮水，每日光照16 h，试验期为3个月。

1.2 试验饲粮

试验采用玉米-豆粕型饲粮。实测玉米、小麦麸和豆粕的粗蛋白质含量，其余营养参数参照《中国饲料成分及营养价值表(2017年第28版)》配制饲粮，试验饲粮的营养水平参照本课题组研究结果确定，各组的营养水平保持一致，试验饲粮组成及营养水平见表 1。对照组饲喂不含抗生素的基础饲粮，试验组分别在基础饲粮中添加2%、4%的发酵混合饲料和2%、4%的发酵酒糟。本试验所用的发酵饲料由新希望六和股份有限公司广东新区提供。其中，发酵菌液由乳酸菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌组成，活菌数分别为1×10⁷、1×10⁸和3×10⁷ CFU/g。发酵混合饲料是以玉米、豆粕、麸皮为底物，按质量比20 : 20 : 60比例混合后，以1 000 kg底物接种500 kg发酵菌液厌氧发酵7 d制备而成，烘干后其水分含量为10%，粗蛋白质含量为13%，pH为4.2；发酵酒糟是以酒糟为底物，以1 000 kg底物接种500 kg发酵菌液厌氧发酵7 d制备而成，烘干后其水分为10%，粗蛋白质含量为21%，pH为4.5。

1.3 样品的采集与制备

试验鸭饲养3个月后，每重复选接近平均体重试验鸭2只，称活体重后，试验鸭颈部放血致死，剖开腹腔，取出内脏，分离出肌胃、腺胃、十二指肠、空肠和回肠，用于测定pH；另外，用手术刀分离10 cm空肠中段，取空肠内容物。然后用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后置于冰板上用载玻片快速刮取空肠黏膜，黏膜样和空肠段分别装入冻存管，于液氮速冻，-80 ℃保存备用。在产蛋高峰期每个月末，从每个重复栏选取4枚未破损蛋(接近平均蛋重)，共计120枚，做好标记，用于测定蛋品质指标。

1.4 检测指标与方法 1.4.1 产蛋性能

试验期间，所有栏试验鸭每天的给料量都保持一致，每天准确记录剩料量。以重复为单位，准确记录试验鸭每天的蛋重、产蛋数量、破蛋、畸形蛋数量和重量，统计产蛋率、平均蛋重、日产蛋重、料蛋比、破蛋率、畸形蛋率。

1.4.2 蛋成分和蛋品质

蛋壳厚度用数显千分尺(MODEL-1061)测定蛋壳钝端、中部和锐端蛋壳厚度，取其平均值表示；蛋形指数采用游标卡尺(沪制01120028)量出其纵径和横径后计算比值表示；蛋壳强度、哈氏单位、蛋重和蛋黄颜色采用蛋壳强度仪(EFR-01，以色列)和全自动蛋品分析仪(ORKA，北京天翔飞域仪器设备有限公司)测定；蛋黄重采用精密电子分析天平(AL104)测定；蛋壳重为含有蛋壳膜的蛋壳在烘箱105 ℃烘干冷却后称重；蛋清重则通过蛋重减去蛋黄重和蛋壳重后计算得出。测定在鸭蛋采集后48 h内完成，最后取各批次的蛋品质指标的平均值表示。

1.4.3 胃肠道pH

屠宰结束分离出胃肠组织后，立即用pH90型直插式pH计测定肌胃、腺胃、十二指肠、空肠和回肠内容物pH，每个组织样测定3次，取平均值。

1.4.4 空肠消化酶活性和分泌型免疫球蛋白A(SIgA)含量

分别取空肠内容物和空肠黏膜0.3 g，按质量比1 : 9加匀浆介质，匀浆，4 ℃下4 000 r/min离心10 min，取上清液，分别用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定空肠内容物中淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶活性和SIgA含量。

1.4.5 肠道免疫相关基因mRNA相对表达量

空肠总RNA的提取采用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)提取，提取的总RNA用ND-1000紫外分光光度计(Thermo Fisher，美国)在OD₂₆₀/OD₂₈₀下检测RNA的浓度和纯度。cDNA的合成采用cDNA合成试剂盒(TaKaRa，日本)两步法在实时荧光定量PCR仪(CFX 96，BIO-RAD，美国)进行。第1步基因组DNA去除反应，反应体系为10 μL，反应参数为42 ℃ 2 min；第2步反转录反应，反应体系为20 μL，反应参数为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。反应结束后样品转移至-80 ℃冻存待用。

实时荧光定量PCR反应程序：第1步预变性，95 ℃ 30 s；第2步PCR扩增，95 ℃ 5 s、退火温度30 s，40个循环。所有引物依据iTaq^TM Universal SYBER^® Green (TaKaRa，日本)试剂盒要求，参照GenBank上已发布序列，采用Primer Premier 5.0设计(跨内含子)或参考相关文献，引物由上海生工生物工程公司广州分公司合成，引物序列见表 2。

参照Livak等^[7]的方法用2^-ΔΔCt法定量目标基因的相对表达量，以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因进行校准。

1.5 统计分析

试验数据采用SAS V8.1软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法进行多重比较。结果用平均值与均值标准误(SEM)表示，统计显著性水平为P＜0.05。

2 结果 2.1 发酵混合饲料和发酵酒糟对蛋鸭产蛋性能的影响

如表 3所示，与对照组相比，饲粮添加2%和4%发酵酒糟显著升高了蛋鸭的日产蛋重(P < 0.05)，饲粮添加4%发酵酒糟显著降低了料蛋比(P < 0.05)。饲粮添加发酵混合饲料和发酵酒糟对蛋鸭产蛋率、平均蛋重、破蛋率以及畸形蛋率均无显著影响(P>0.05)。

2.3 发酵混合饲料和发酵酒糟对蛋鸭蛋成分和蛋品质的影响

如表 4所示，与对照组相比，饲粮添加4%发酵酒糟显著升高了鸭蛋中蛋清重和蛋黄颜色(P < 0.05)。饲粮添加发酵混合饲料和发酵酒糟对蛋鸭蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋形指数、蛋黄重、蛋壳重均无显著影响(P＞0.05)。

2.4 发酵混合饲料和发酵酒糟对蛋鸭胃肠道pH和消化酶活性的影响

如表 5所示，与对照组相比，饲粮添加4%发酵混合饲料和4%发酵酒糟显著降低了蛋鸭肌胃和腺胃pH(P < 0.05)。饲粮添加发酵混合饲料和发酵酒糟对蛋鸭十二指肠、空肠和回肠pH均无显著影响(P>0.05)。

如表 6所示，与对照组相比，饲粮添加4%发酵混合饲料显著提高了蛋鸭空肠脂肪酶和糜蛋白酶活性(P < 0.05)，饲粮添加2%和4%发酵酒糟显著提高了蛋鸭空肠糜蛋白酶、胰蛋白酶活性(P < 0.05)。

2.5 发酵混合饲料和发酵酒糟对蛋鸭空肠免疫细胞因子mRNA相对表达量和SIgA含量的影响

如表 7所示，与对照组相比，饲粮添加4%发酵酒糟显著升高了蛋鸭空肠黏蛋白2(MUC2)、SIgA的mRNA相对表达量以及SIgA含量(P < 0.05)。饲粮添加发酵混合饲料和发酵酒糟对空肠白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、干扰素-α(IFN-α)的mRNA相对表达量均无显著影响(P>0.05)。

3 讨论 3.1 发酵混合饲料和发酵酒糟对蛋鸭产蛋性能的影响

发酵饲料主要是以微生物为生物饲料发酵菌种，将饲料蛋白质转化为微生物菌体蛋白、生物活性小肽、氨基酸、微生物活性益生菌为一体的生物发酵饲料。它可以产生大量有机酸、酶等代谢物，提高饲料中营养物质的消化利用率，降低抗营养因子，改善饲料品质；同时增强机体免疫力和抵抗力。近年来，玉米、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酒糟等饲料资源发酵后饲用效果的研究报道不少，发酵饲料在配合饲料中添加比例一般为2%~50%^{[6, 10-12]}。在生产性能方面，总体表现为产蛋率升高，料蛋比降低，每千克肉、蛋的饲粮成本降低，养殖经济效益增加。崔卫涛等^[5]在蛋鸡饲粮中饲喂添加4%发酵棕榈粕可以提高日产蛋重，降低料蛋比。Engberg等^[13]以湿发酵饲料与水的混合比例按1.0 : (1.2~1.4)饲喂蛋鸡可改善蛋重和饲料转化率，但对产蛋率和日产蛋重无显著影响。Okrathok等^[14]研究报道，蛋鸡饲粮添加24%发酵木薯对蛋鸡采食量、产蛋率和蛋重无负面影响。周建民等^[15]试验表明，饲粮添加0.9%~1.2%酒糟酵母培养物能通过提高肉仔鸡血清抗氧化能力，改善空肠黏膜形态结构，从而改善生长性能。本试验结果表明，饲粮发酵酒糟添加水平达到4%时可改善35周龄龙岩山麻鸭产蛋性能，明显提高麻鸭的日产蛋重，降低料蛋比，这与其他相关研究报道基本一致。豆粕发酵可降低豆粕中的β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、植酸磷等抗营养因子。与玉米、豆粕和麸皮为底物的发酵混合饲料相比，以酒糟为底物的发酵酒糟富含蛋白质、氨基酸、核苷酸、B族维生素、矿物质和微量元素等营养素及多肽、寡糖、有机酸、消化酶和未知生长因子等多种益生物质^[15]。其促生长作用可能与其发酵后降低粗纤维含量、提高饲粮适口性以及富含的各种营养素和益生成分的作用密不可分。蛋白质、氨基酸和维生素等营养物质可保障动物自身正常生长。小肽、寡糖、有机酸和消化酶等可改善肠道内环境，促进营养物质的消化吸收。同时，未知生长因子在促生长中可能存在协同与转化作用。

3.2 发酵混合饲料和发酵酒糟对蛋鸭蛋品质的影响

本试验中，饲粮添加4%发酵酒糟显著提高了蛋鸭蛋黄颜色，但对蛋形指数、蛋壳厚度、蛋壳强度等无显著影响。有研究报道，发酵饲料中富含乳酸杆菌和双歧杆菌，可以影响宿主代谢，特别是肝脏和肠道组织；它可以提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶活性，降低机体氧化应激，从而提高畜禽产品品质^[16-19]。发酵酒糟富含氨基酸、维生素、辅酶以及微量元素等营养物质，具有抗氧化作用，能通过生理途径进入禽蛋中，改善禽蛋品质^{[15, 20]}。与发酵豆粕和发酵麸皮相比，发酵酒糟富含叶黄素，可调节禽蛋蛋黄颜色。王少琨等^[12]研究表明，饲粮添加2%~8%发酵酒糟可提高72周龄海兰褐蛋鸡蛋黄颜色、蛋白高度和哈氏单位。吴俊锋等^[21]研究显示，饲粮添加2.5%发酵豆粕可提高蛋黄颜色。Lei等^[22]研究报道，蛋鸡在产蛋高峰期饲粮添加地衣芽孢杆菌显著增加了蛋壳厚度、蛋壳强度、哈氏单位和蛋黄颜色。Engberg等^[13]研究报道，饲喂湿发酵饲料显著提高了鸡蛋蛋壳重和蛋壳强度。以上研究表明，饲粮添加适宜比例的发酵饲料可以改善禽蛋品质。以酒糟为底物的发酵酒糟在改善蛋黄颜色和哈氏单位方面优于以玉米、豆粕和麸皮为底物的发酵混合饲料。本试验中，发酵混合饲料并未改善蛋黄颜色，可能与底物中玉米和豆粕含量较低有关。

3.3 发酵混合饲料和发酵酒糟对蛋鸭胃肠道pH和消化酶活性的影响

畜禽消化道酸度是影响其消化环境的重要因素，也是调节胃肠道内环境酸碱平衡、电解质平衡的基础，适宜的酸度是维持畜禽消化系统正常生理功能的关键。胃内pH降低，可使胃蛋白酶迅速活化，当pH提高到4时，活化速度缓慢；当pH大于6时，胃蛋白酶失活^[23]。本试验发现，在蛋鸭饲粮中添加4%发酵混合饲料和4%发酵酒糟均可显著降低肌胃和腺胃pH，有利于胃蛋白酶分泌。动物消化利用营养物质主要通过消化道内消化酶的作用，其活性高低直接影响动物对饲粮的利用程度。淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶是畜禽消化道内主要的3种消化酶。Feng等^[6]在饲粮中添加发酵豆粕替代豆粕显著提高了1~21日龄肉仔鸡小肠内容物中胰蛋白酶、脂肪酶和糜蛋白酶活性，而且在22~42日龄阶段蛋白酶活性进一步加强。Jin等^[24]在肉仔鸡饲粮中添加不同的乳酸菌制剂发现，乳酸菌显著提高了40日龄肉仔鸡小肠中淀粉酶活性。石琳等^[25]研究报道，饲粮添加酵母浓缩物有提高十二指肠内容物淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性的趋势。还有研究表明，益生菌可提高畜禽肠道消化酶活性^[26-27]。本试验结果表明，饲粮添加4%发酵混合饲料显著提高了蛋鸭空肠脂肪酶和糜蛋白酶活性，饲粮添加2%和4%发酵酒糟显著提高了蛋鸭空肠糜蛋白酶、胰蛋白酶活性，与不同动物的研究结果基本一致。可能的原因为：酵母菌、乳酸菌和芽孢杆菌的代谢产物中含有消化酶，可以直接给蛋鸭补充的消化酶；也可能改善蛋鸭肠道微生物菌群结构，促进酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌等有益菌的繁殖，进而提高肠道内消化酶活性。

3.4 发酵混合饲料和发酵酒糟对蛋鸭肠道免疫功能的影响

肠黏膜免疫屏障系统主要由肠相关淋巴组织构成，包括黏膜固有层及上皮细胞层内淋巴细胞、孤立淋巴滤泡、肠系膜淋巴结、潘氏细胞等。肠道免疫系统受到刺激后，可以分泌免疫球蛋白、白细胞介素和干扰素等，通过免疫调节维持肠道上皮稳态。SIgA是肠道外分泌物中的主要免疫球蛋白，亦是黏膜免疫系统中的优势性抗体，它与非特异性免疫蛋白共同作用可阻止微生物黏附于上皮细胞，阻止损伤的相关炎症反应，还可以中和微生物毒素和病原微生物，调控肠道共生菌群，维持不同肠段菌群特异性^[28-29]。MUC2由肠道杯状细胞分泌，是构成肠道黏液层的主要成分，发挥润滑和拮抗致病菌的侵袭和黏附作用^[30]。细胞因子具有调节白细胞、介导炎症反应、参与免疫应答和组织修复等生理功能。

关于发酵饲料对家禽肠道免疫功能的影响报道较少，大多数研究集中在肠道分泌型免疫球蛋白含量等表观指标测定。Gao等^[2]研究发现，科比肉仔鸡饲粮中添加0.25%~0.50%酿酒酵母发酵物可增加回肠上皮内淋巴细胞数量和盲肠扁桃体SIgA含量，降低球虫感染。刘辉等^[31]在饲粮中添加副干酪乳杆菌发酵饲料能调节菌群平衡，增强机体免疫功能。有研究表明，饲料微生物发酵产生的短链脂肪酸，如丁酸可诱导杯状细胞MUC2的分泌和T细胞的分化，同时可抑制核因子-κB表达，进而提高动物机体的免疫功能^[32]。发酵麸皮多糖具有免疫调节作用，可以刺激免疫细胞分泌细胞因子，具有一定的抗炎活性^[33-34]。本试验中，饲粮添加4%发酵酒糟可提高蛋鸭空肠中MUC2、SIgA的mRNA相对表达量和SIgA含量，但对其他细胞因子的分泌无显著影响，表明适当水平的发酵酒糟可以促进蛋鸭肠道黏蛋白和免疫球蛋白的分泌，抵御病原微生物侵袭。这可能是因为，酒糟发酵饲料中的乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等可以通过调节肠道菌群平衡和刺激肠道组织产生免疫球蛋白，促进肠道淋巴细胞增殖，增强免疫应答，提高机体的免疫力^[35]。本试验中，饲粮添加4%发酵酒糟提高了蛋鸭空肠蛋白酶活性，提高了其对蛋白质的利用效率，降低了后肠段残留蛋白质的含量。有研究报道，提高肠道蛋白质利用率会降低后肠道与蛋白质分解相关菌群丰度，降低后肠道微生物发酵肠道残余的蛋白质产生的吲哚、组胺、硫化氢、粪臭素等有害代谢产物，缓解肠道细胞结构损伤，同时降低机体免疫反应^[36]。本研究中，饲粮添加2%和4%发酵混合饲料对蛋鸭细胞因子分泌无显著影响。这可能是不同方法所获得麸皮多糖的结构类型、理化性质、得率和活性有差异，有待进一步研究。综上所述，本试验条件下，以酒糟为底物的发酵酒糟在调节蛋鸭肠道免疫功能、改善蛋鸭肠道健康方面优于以玉米、豆粕和麸皮为底物的发酵混合饲料。

4 结论

在本试验条件下，发酵酒糟对蛋鸭产蛋性能、蛋品质、肠道消化酶活性和免疫功能优于发酵混合饲料，且以4%的添加水平效果更好。