2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193
2. Beijing Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
全混合日粮(TMR)是一种整合了粗料、精料、维生素等基本营养物质，能够满足奶牛生产需要的现代化饲喂技术。然而，动物饲粮既要满足基本营养物质需要，还需要起到一定的生理调节和防御的作用[1]。饲粮中的黄酮、多酚等微量营养活性物质具有的激活动物自身免疫机能、提高体内抗氧化活性和饲料报酬等功能，成为后抗生素时代实现畜禽健康养殖的重要技术策略。占今舜[2]研究指出，添加苜蓿黄酮可提高奶牛采食量，促进营养物质的消化和乳糖合成；同时还可以提高奶牛的抗氧化能力及免疫能力。在饲粮中添加30 mg/kg大豆异黄酮可以提升奶牛的乳蛋白含量，改善乳品质[3]。因此，营养活性物质很有可能作为TMR中保障奶牛健康所需的关键因素，用以区别TMR的营养价值。
卢德勋[4-5]创立的系统动物营养学理论和技术体系，首次将饲粮营养活性物质主效因子测定和分析列入饲粮优化设计，然而当前在制定奶牛TMR配方时往往忽略了TMR中营养活性物质的作用效果，关于饲粮中微量黄酮是否会对奶牛的免疫、健康有促进作用也尚未有文献报道，其中最主要的原因就是饲粮中黄酮类营养活性物质种类繁多，结构复杂，主效因子不明确，无法定量，从而制约了其在畜牧业中的广泛应用。因此，对饲粮中营养活性物质的含量进行定性定量分析势在必行。本研究选用了水浴和超声2种常见提取黄酮的方法，运用响应面分析法(RSM)[6]优化奶牛TMR中总黄酮的最佳提取条件，为进一步研究其成分结构、生物活性、作用机制提供物质基础。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂采自首农集团北京奶牛中心良种场单产12 t以上的泌乳高产奶牛TMR，其组成及营养水平见表 1；芦丁标准品(≥98%)；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝(AR，99.0%)、无水乙醇为分析纯。其余试剂均为色谱级。
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表 1 TMR组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of TMR (DM basis) |
KQ500DE数控超声波清洗器(功率500 W)；Multiskan FC型酶标仪；HH-8电热恒温水浴锅；MD4100D实验室双级反渗透去离子水系统。
1.3 总黄酮的提取称取风干研磨后1.0 g奶牛TMR粉于锥形瓶中，在一定的条件下进行总黄酮的水浴提取或超声提取，然后将得到的提取液抽滤，用30%乙醇定容至100 mL容量瓶，备用。
1.3.1 芦丁标准曲线的绘制配制一系列不同浓度梯度的芦丁标准溶液，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法[7]，用酶标仪在510 nm的波长处测定吸光度，以芦丁浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.2 奶牛TMR中的总黄酮的提取参照秦晶晶等[8]对柿叶总黄酮提取工艺优化的方法，以乙醇浓度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(1 ∶ 20、1 ∶ 30、1 ∶ 40、1 ∶ 50、1 ∶ 60、1 ∶ 70)、提取时间(40、60、80、100、120、140 min)、提取温度(40、50、60、70、80、90 ℃)为影响因素，研究各因素对水浴醇提及超声提取奶牛TMR中总黄酮提取量的影响。
1.3.3 奶牛TMR总黄酮提取量的测定准确量取样品溶液1 mL于25 mL容量瓶中，按照1.3.1中所述方法进行操作，按下式计算黄酮提取量：
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式中：W表示黄酮提取量(mg/g)；c表示根据吸光度值计算出的溶液质量浓度(mg/mL)；D表示溶液稀释倍数；M表示样品取样量(g)。
1.4 响应面试验设计与统计分析在单因素试验结果基础上，按照Box-Benhnken中心组合试验设计原理，采用Design-Expert 8.0.6软件设计响应面试验。采用Excel 2007进行试验数据处理、分析及绘图。
2 结果与分析 2.1 芦丁标准曲线由图 1可知，对标准曲线进行拟合，得到芦丁浓度(x)与吸光度(y)的关系的回归方程：y=6.275 8x+0.038 7(R2=0.999 5)，线性关系极显著，表明芦丁溶液浓度在0~0.02 mg/mL, 与吸光度线性关系良好。
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图 1 芦丁的标准曲线 Fig. 1 Standard curve of rutin |
由图 2可知，奶牛TMR总黄酮提取量会受到乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间的影响，呈现先增后减的变化。通过单因素分析，最终确定最佳水浴醇提奶牛TMR总黄酮的条件为：乙醇浓度为80%，料液比为1 ∶ 30，提取温度为80 ℃，提取时间为80 min。这种条件下得到的总黄酮提取量最高，为9.15 mg/g。
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图 2 不同提取条件下水浴萃取奶牛TMR中的总黄酮提取量 Fig. 2 Water bath extraction of total flavonoid extraction amount in TMR of dairy cows under different extraction conditions |
以奶牛TMR中总黄酮提取量为响应值，选取乙醇浓度(A)、提取温度(B)、料液比(C)、提取时间(D)4因素3水平进行试验设计，因素水平编码见表 2。采用响应面法优化奶牛TMR黄酮提取工艺，结果见表 3，方差分析见表 4。
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表 2 因素水平编码 Table 2 Factor level coding |
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表 3 响应面分析方案及试验结果 Table 3 Response surface analysis scheme and test results |
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表 4 响应面分析法方差分析 Table 4 ANOVA of response surface analysis |
对表 3中奶牛TMR总黄酮提取量(Y)及4个影响因素进行二次回归模型拟合，得到多元回归模型：Y=9.22+0.66A-0.17B-0.15C+0.37D+0.20AB-0.19AC+0.087AD-0.62BC+0.074BD-0.27CD-1.44A2-0.82B2-0.68C2-0.57D2。方差分析结果见表 4。
由表 4可知，失拟项P>0.05，差异不显著，说明没有失拟因素；结合模型P≤0.0001，差异极其显著，可以看出模型拟合效果很好。根据F值可知，4个因素对TMR中总黄酮提取量的影响大小依次为：乙醇浓度>料液比>提取温度>提取时间。
乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间交互作用对奶牛TMR总黄酮提取量影响的等高线图与响应面3D图见图 3。
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图 3 奶牛TMR总黄酮水浴萃取响应面分析等高线(A、B、C、D、E、F)及响应面(a、b、c、d、e、f) Fig. 3 Contour lines (A, B, C, D, E, F) and response surfaces (a, b, c, d, e, f) of water-bath extraction of total flavonoids from dairy cow TMR |
根据图 3进行响应面分析，得到最优提取条件为：乙醇浓度82.6%、提取温度80.37 ℃、提取时间75.11 min、料液比1 ∶ 34.05，此条件下奶牛TMR黄酮提取量预测值为9.396 3 mg/g。
2.3 超声提取TMR中总黄酮的条件优化 2.3.1 不同提取条件下奶牛TMR中总黄酮的提取量通过单因素分析，最终确定乙醇浓度为90%，料液比为1 ∶ 40，当提取时间为40 min时奶牛TMR总黄酮提取量最高，为10.97 mg/g(图 4)。
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图 4 不同条件下超声提取奶牛TMR中的总黄酮含量 Fig. 4 Ultrasonic extraction of total flavonoids contents from TMR of dairy cows under different conditions |
总黄酮提取量为响应值，选取乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)3因素3水平进行试验设计，因素水平编码见表 5。采用响应面法优化奶牛TMR黄酮提取工艺，结果见表 6，方差分析见表 7。
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表 5 因素水平编码 Table 5 Factor level coding |
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表 6 响应面分析方案及试验结果 Table 6 Response surface analysis scheme and test results |
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表 7 响应面分析法方差分析 Table 7 ANOVA of response surface analysis |
对表 6中奶牛TMR总黄酮提取量及4个影响因素进行二次回归模型拟合，得到多元回归模型：Y=11.39+0.21A+0.71B-0.017C-0.17AB-0.47AC-0.87BC-1.97A2-0.46B2-0.76C2。方差分析结果见表 7。
由表 7可知，失拟项P＞0.05，差异不显著，说明没有失拟因素；结合模型P≤0.05，差异显著，可以看出模型拟合效果较好。根据F值可知，3个因素对TMR中总黄酮提取量的影响大小依次为：料液比>乙醇浓度>提取时间。
乙醇浓度、料液比、提取时间交互作用对奶牛TMR总黄酮提取量影响的等高线图与响应面3D图见图 5。
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图 5 超声提取奶牛TMR总黄酮响应面分析等高线(A、B、C)及响应面(a、b、c) Fig. 5 Response surface analysis of contour lines (A, B, C) and response surfaces (a, b, c) of ultrasonic extraction of total flavonoids from dairy cows TMR |
由图 5可知，响应面优化的最优提取条件为：乙醇浓度为90.34%、料液比为1 ∶ 49.84、提取时间为37.45 min，此条件下奶牛TMR黄酮提取量预测值为11.898 mg/g。
3 讨论黄酮是植物内生真菌产生的具有多种生物活性的次生代谢产物[9]，其化学成分、生物活性和含量会受到提取技术的强烈影响[10]。奶牛饲粮中的常规饲料，如苜蓿、燕麦常采用超声辅助提取法[11-14]、复合酶解协同乙醇法[15]、微波提取法[11, 16]、索氏提取法[17]、浸提法[18]对其中的总黄酮进行提取；而豆粕中的黄酮成分主要是大豆异黄酮，可采用超声提取法[19]、加热回流法[20]、微波提取法[21]、磁力搅拌法[22]等进行提取。采用不同的方法提取植物中的黄酮类营养活性物质，均会受到提取溶剂浓度、料液比、提取温度和提取时间等多方面的影响。
外源添加植物黄酮对奶牛的生产性能、免疫等各方面具有积极的促进作用。王明等[23-25]将不同浓度的大豆异黄酮与淋巴细胞共育培养发现，添加低剂量(0.25~5.00 μg/mL)的大豆异黄酮能够提高奶牛的免疫能力。李义等[27]和栗明月等[28-29]在竹叶黄酮对奶牛代谢、免疫及抗氧化方面的研究中发现，竹叶黄酮提高了热应激奶牛的抗氧化能力。然而，除了黄酮类饲料添加剂，奶牛常规饲粮中的黄酮类营养活性物质也被证明具有抗菌、抗氧化、提高动物机体免疫机能等作用。王家皓等[15]对南苜蓿叶总黄酮的抑菌效果和抗氧化能力进行研究，发现其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用，并且对羟基自由基和1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)均表现出一定的清除能力。同样，许英一等[14]也通过试验证明了苜蓿叶总黄酮在一定的质量浓度范围具有较明显的抗氧化活性，并随着质量浓度的增加而增强。而王双慧等[13]采用滤纸片法及牛津杯法探究燕麦黄酮的抑菌效果，数据显示燕麦黄酮对大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、产酯酵母以及黑曲霉4种供试菌均有抑制作用，作用大小顺序为大肠埃希氏菌＞枯草芽孢杆菌＞产酯酵母＞黑曲霉，并且其抑制作用随其浓度增大而增强。并且苜蓿黄酮还能够上调奶牛乳体细胞中免疫和抗氧化相关基因的表达[30]。
根据本试验研究结果，通过超声提取奶牛TMR中的总黄酮最大提取量达到了干物质含量的1.13%(前期测出该饲粮干物质含量为97.4%)，比钙、磷含量总和还要略高，因此饲粮中的微量活性物质很有可能具有潜在的重要作用。下一步研究可将提取工艺与HPLC等色谱技术结合，实现对饲粮中黄酮类物质的定性定量分析，从而探究不同提取方法或提取条件对奶牛TMR中总黄酮成分和含量的影响。对饲粮中的营养活性物质提取工艺进行优化，是研究这些微量成分的基础，对于探究其生物学价值、优化饲粮配方将具有重要意义。
4 结论通过对响应值结果进行分析，得到奶牛TMR中总黄酮最佳提取工艺为：在乙醇浓度为90%，提取时间为40 min，料液比为1 ∶ 40的条件下，通过超声提取到的总黄酮最大提取量为10.97 mg/g，该提取工艺可为奶牛TMR中总黄酮的进一步研究提供参考。
| [1] |
卢德勋. 动物营养学科发展在战略方向上的重大突破: 构建动物健康营养理论和技术体系及其实际应用[J]. 动物营养学报, 2021, 33(1): 1-12. LU D X. A major breakthrough in development of animal nutrition in strategic direction: building an animal health and nutrition theory and technology system and its application[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2021, 33(1): 1-12 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2021.01.001 |
| [2] |
占今舜. 苜蓿黄酮对奶牛生产性能、瘤胃代谢和免疫性能影响的研究[D]. 博士学位论文. 扬州: 扬州大学, 2016. ZHAN J S. Effects of alfalfa flavonoids on production performance, ruminal metabolism and immunity[D]. Ph. D. Thesis. Yangzhou: Yangzhou University, 2016. (in Chinese) |
| [3] |
沈菲, 肖凡, 李婷婷, 等. 饲喂不同水平大豆异黄酮对奶牛产奶量、乳品质及血清相关细胞因子含量的影响[J]. 动物营养学报, 2020, 32(1): 276-284. SHEN F, XIAO F, LI T T, et al. Effects of feeding different levels of soy isoflavones on milk yield, milk quality and serum related cytokines contents of dairy cows[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2020, 32(1): 276-284 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2020.01.034 |
| [4] |
卢德勋. 系统动物营养学导论[M]. 北京: 中国农业出版社, 2004. LU D X. Introduction to systematic animal nutrition[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2004 (in Chinese). |
| [5] |
卢德勋. 新版系统动物营养学导论[M]. 北京: 中国农业出版社, 2016. LU D X. New introduction to systematic animal nutrition[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2016 (in Chinese). |
| [6] |
陈克克, 强毅. 响应面法优化超声波辅助北苍术多酚提取工艺及其DPPH自由基清除能力研究[J]. 西北大学学报(自然科学版), 2018, 48(1): 78-84. CHEN K K, QIANG Y. Optimization of ultrasonic assisted extraction of polyphenols from Atractylodes chinensis (DC.) Koidz.using response surface methodology and evaluation of its antioxidant activity[J]. Journal of Northwest University (Natural Science Edition), 2018, 48(1): 78-84 (in Chinese). |
| [7] |
邓梦琴, 林晓瑛, 张明, 等. 超声辅助提取菠萝蜜果皮黄酮工艺优化及体外抗氧化活性研究[J]. 食品工业科技, 2016(24): 288-293, 296. DENG M Q, LIN X Y, ZHANG M, et al. Study on ultrasonic assisted extraction and antioxidant function of flavones from the peels of Artocarpus heterophyllus lam[J]. Science and Technology of Food Industry, 2016(24): 288-293, 296 (in Chinese). |
| [8] |
秦晶晶, 钱慧琴, 赵媛, 等. 柿叶总黄酮提取工艺优化及其抗氧化活性[J]. 食品工业科技, 2020, 41(13): 32-38, 45. QIN J J, QIAN H Q, ZHAO Y, et al. Optimization of the extraction technology of total flavonoids and in vitro antioxidant activity of extract from persimmon leaves[J]. Science and Technology of Food Industry, 2020, 41(13): 32-38, 45 (in Chinese). |
| [9] |
谢海伟, 冯嘉琪, 付晓晴, 等. 药用植物内生真菌的研究进展[J]. 江苏农业科学, 2020, 48(14): 1-6. XIE H W, FENG J Q, FU X Q, et al. Research progress of endophytic fungi in medicinal plants[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2020, 48(14): 1-6 (in Chinese). |
| [10] |
刘伟, 刘玉霜, 陈玉, 等. 粘胶乳香树精油化学成分与生物活性研究进展[J]. 中国中药杂志, 2019, 44(17): 3684-3694. LIU W, LIU Y S, CHEN Y, et al. Research progress of chemical constituents and biological activities of essential oil of Pistacia lentiscus[J]. Journal of Chinese Materia Medica, 2019, 44(17): 3684-3694 (in Chinese). |
| [11] |
郭慧敏, 朱慧森, 郭建秀. 不同生育期紫花苜蓿总黄酮的提取和检测方法比较研究[J]. 中国草地学报, 2020, 42(3): 141-146. |
| [12] |
赵娅敏, 马好文, 齐燕娇, 等. 甘肃紫花苜蓿黄酮提取条件的响应面法优化及不同生长时间苜蓿黄酮含量的测定[J]. 西部中医药, 2017, 30(9): 55-59. ZHAO Y M, MA H W, QI Y J, et al. Optimization of response surface method for extraction conditions of flavone from alfalfa of Gansu province and content determination of alfalfa flavone in different growth periods[J]. Western Journal of Traditional Chinese Medicine, 2017, 30(9): 55-59 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1004-6852.2017.09.015 |
| [13] |
王双慧, 梅群芳, 冯晓汀, 等. 燕麦β-葡聚糖, 多酚及黄酮的抑菌活性研究[J]. 食品研究与开发, 2020, 41(12): 96-102. WANG S H, MEI Q F, FENG X T, et al. Study on the antibacterial activity of oat beta-glucan, polyphenols and flavonoids[J]. Food Research and Development, 2020, 41(12): 96-102 (in Chinese). DOI:10.12161/j.issn.1005-6521.2020.12.016 |
| [14] |
许英一, 王宇, 杨伟光. 紫花苜蓿叶总黄酮提取及抗氧化性[J]. 草地学报, 2018, 26(3): 757-763. XU Y Y, WANG Y, YANG W G. Extraction process and antioxidant activity of total flavonoids from alfalfa leaf[J]. Acta Agrestia Sinica, 2018, 26(3): 757-763 (in Chinese). |
| [15] |
王家皓, 贲蕾洁, 符茜, 等. 南苜蓿叶总黄酮提取及抑菌抗氧化活性[J]. 江苏农业科学, 2020, 48(17): 201-205, 214. WANG J H, BEN L J, FU Q, et al. Extraction of total flavonoids from alfalfa leaves and its antibacterial and antioxidant activities[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2020, 48(17): 201-205, 214 (in Chinese). |
| [16] |
黄晓慧, 张宏, 李鹏, 等. 微波辅助提取航天紫花苜蓿中总黄酮工艺研究[J]. 中国奶牛, 2017(9): 61-64. HUANG X H, ZHANG H, LI P, et al. Study on microwave-assisted extraction process of total flavonoids from space breeding alfalfa[J]. China Dairy Cattle, 2017(9): 61-64 (in Chinese). |
| [17] |
李晨阳, 黄明奇, 李传峥, 等. 不同单因素对"龙牧801"紫花苜蓿总黄酮提取率的影响[J]. 高师理科学刊, 2020, 40(3): 83-86. LI C Y, HUANG M J, LI C Z, et al. Effects of different single factors on the extraction rate of total flavonoids from Medicago sativa.L.cv.longmu No.801[J]. Journal of Science of Teachers' College and University, 2020, 40(3): 83-86 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1007-9831.2020.03.016 |
| [18] |
刘思奇, 刘欣然, 侯超, 等. 浸提法提取不同极性燕麦提取物的工艺优化[J]. 中国食物与营养, 2020, 26(2): 37-41. LIU S J, LIU X R, HOU C, et al. Extraction process optimization of different polar extracts from oat by solvent extraction[J]. Food and Nutrition in China, 2020, 26(2): 37-41 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1006-9577.2020.02.008 |
| [19] |
张晓峥, 邢蓬蕊, 张显香, 等. 发酵豆粕中大豆异黄酮的提取及含量测定[J]. 泰山医学院学报, 2015, 36(1): 57-60. ZHANG X Z, XING P R, ZHANG X X, et al. The extraction and content determination of soybean isoflavonesin in the fermented soybean meal[J]. Journal of Taishan Medical College, 2015, 36(1): 57-60 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1004-7115.2015.01.020 |
| [20] |
王丹. 脱脂豆粕中大豆异黄酮提取工艺的研究[J]. 食品研究与开发, 2017, 38(6): 52-55. WANG D. Study on the extraction technology of isoflavones from defatted soybean meal[J]. Food Research and Developent, 2017, 38(6): 52-55 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2017.06.012 |
| [21] |
王舒, 李文, 梁艳. 微波及溶剂法提取豆粕中大豆异黄酮的工艺研究[J]. 中国药业, 2013, 22(16): 51-53. WANG S, LI W, LIANG Y. Technology study on microwave and solvent methods for extracting soybean isoflavones from soybean meal[J]. China Pharmaceuticals, 2013, 22(16): 51-53 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1006-4931.2013.16.027 |
| [22] |
孙洁心, 孙强, 张永忠. 发酵豆粕中大豆异黄酮提取条件的优化[J]. 食品研究与开发, 2012, 33(9): 1-3. SUN J X, SUN Q, ZHANG Y Z. Optimization of process conditions of extracting soybean isoflavones from fermented soybean meal[J]. Food Research and Developent, 2012, 33(9): 1-3 (in Chinese). |
| [23] |
王明. 大豆异黄酮对奶牛肠系膜淋巴结与脾脏主要免疫指标的影响研究[D]. 硕士学位论文. 北京: 北京农学院, 2012. WANG M. Effect of soy isoflavones on immunity indexes in lymphocyte of lymph nodes and spleenocytes of dairy cows[D]. Master's Thesis. Beijing: Beijing University of Agriculture, 2012. (in Chinese) |
| [24] |
王明, 孙志刚, 刘文奇, 等. 大豆异黄酮对奶牛脾脏和肠系淋巴结淋巴细胞干扰素γ、白介素2和白介素4浓度以及雌激素受体β mRNA表达的影响[J]. 动物营养学报, 2012, 24(5): 859-869. WANG M, SUN Z G, LIU W J, et al. Effects of soy isoflavones on concentrations of interferon γ, interleukin 2 and interleukin 4 and mRNA expression of estrogen receptor β in lymphocytes of spleen and intestinal lymph nodes of dairy cows[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2012, 24(5): 859-869 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2012.05.010 |
| [25] |
王明, 孙志刚, 刘文奇, 等. 大豆异黄酮对奶牛脾脏与肠系淋巴结中淋巴细胞增殖的影响[J]. 中国农学通报, 2012, 28(11): 24-27. WANG M, SUN Z G, LIU W J, et al. The effects of soy isoflavone on the lymphocyte proliferation in lymph nodes and splenocyte from dairy cow[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2012, 28(11): 24-27 (in Chinese). |
| [26] |
李义, 方洛云, 熊本海, 等. 植物黄酮在缓解奶牛热应激上的应用前景[J]. 动物营养学报, 2019, 31(8): 3490-3495. LI Y, FANG L Y, XIONG B H, et al. Application prospect of plant flavonoids in relieving heat stress of dairy cows[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2019, 31(8): 3490-3495 (in Chinese). |
| [27] |
李义, 童津津, 栗明月, 等. 竹叶提取物对热应激奶牛泌乳性能及血清生化、抗氧化和免疫指标的影响[J]. 动物营养学报, 2021, 33(2): 900-912. LI Y, TONG J J, LI M Y, et al. Effects of bamboo leaf extract on lactation performance and indexes of biochemical, antioxidant and immune in serum of dairy cows during heat stress[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2021, 33(2): 900-912 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2021.02.031 |
| [28] |
栗明月, 方洛云, 苏汉书, 等. 竹叶提取物对奶牛泌乳性能、血液常规指标、免疫和抗氧化性能的影响[J]. 动物营养学报, 2019, 31(7): 3302-3309. LI M Y, FANG L Y, SU H S, et al. Effects of bamboo leaf extracts on lactation performance, blood routine indexes and immune and antioxidant ability of dairy cows[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2019, 31(7): 3302-3309 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2019.07.043 |
| [29] |
栗明月, 方洛云, 苏汉书, 等. 竹叶提取物对奶牛瘤胃体外发酵参数及产气量的影响[J]. 动物营养学报, 2019, 31(4): 1816-1822. LI M Y, FANG L Y, SU H S, et al. Effects of bamboo leaf extract on rumen in vitro fermentation parameters and gas production of dairy cows[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2019, 31(4): 1816-1822 (in Chinese). |
| [30] |
ABOUZED T K, SADEK K M, AYOUB M M, et al. Papaya extract upregulates the immune and antioxidants-related genes, and proteins expression in milk somatic cells of Friesian dairy cows[J]. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 2019, 103(2): 407-415 (in Chinese). DOI:10.1111/jpn.13032 |