动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 5: 2924 - 2937

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.251

研究论文

屎肠球菌对五指山断奶仔猪肠道健康及微生物群落的影响

  • 薛新宇 , 1, 2 ,
  • 孙军航 3 ,
  • 柒启恩 3 ,
  • 孙瑞萍 , 2, * ,
  • 张浩洁 , 1, 4, *
展开
  • 1 广西大学动物科学技术学院,南宁 530005
  • 2 海南省农业科学院畜牧兽医研究所,海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室,海口 571100
  • 3 佛山科学技术学院,佛山 528000
  • 4 广东生态工程职业学院海洋与渔业学院,广州 510520
* 孙瑞萍,副研究员,硕士生导师,E-mail: ;
张浩洁,讲师,硕士生导师,E-mail:

薛新宇(1999—),男,河南南阳人,硕士研究生,动物营养与饲料科学专业。E-mail:

Office editor: 田艳明

收稿日期: 2023-11-27

  网络出版日期: 2024-05-15

基金资助

国家重点研发项目(2021YFF0702804)

海南地方猪产业技术体系(HNARS2023-2-Z1)

海南地方猪产业技术体系(HNARS2023-2-G2)

三亚崖州湾科技城管理局科研项目(SKJC-2020-02-007)

收起

Effects of Enterococcus faecium on Intestinal Health and Microbial Community of Wuzhishan Weaned Piglets

  • XUE Xinyu , 1, 2 ,
  • SUN Junhang 3 ,
  • QI Qien 3 ,
  • SUN Ruiping , 2, * ,
  • ZHANG Haojie , 1, 4, *
Expand
  • 1 College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005, China
  • 2 Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Animal Breeding and Disease Research, Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Hainan Academy of Agricultural Sciences, Haikou 571100, China
  • 3 Foshan University, Foshan 528000, China
  • 4 College of Ocean and Fisheries, Guangdong Eco-Engineering Polytechnic, Guangzhou 510520, China
* SUN Ruiping, associate professor, E-mail: ;
ZHANG Haojie, lecturer, E-mail:

Received date: 2023-11-27

  Online published: 2024-05-15

Fold

摘要

本试验旨在研究屎肠球菌对五指山断奶仔猪肠道健康及微生物群落的影响及对断奶应激的缓解作用。试验选取初始体重为(3.79±0.24) kg的33日龄五指山未断奶仔猪18头,随机分为对照组、断奶组和屎肠球菌组,每组6头(公母各占1/2)。对照组仔猪不进行断奶处理,在33日龄时灌喂20 mL磷酸盐缓冲液(PBS),并饲喂母乳至38日龄;断奶组仔猪33日龄时灌喂20 mL PBS,35日龄断奶,并饲喂饲粮至38日龄;屎肠球菌组仔猪33日龄时灌喂20 mL屎肠球菌(灌喂量为1×109 CFU/kg BW),35日龄断奶,并饲喂饲粮至38日龄。38日龄时,将所有试验猪进行屠宰,并测定其肠道形态、酶活性及微生物群落。结果表明:1)在各组初始体重一致的情况下,断奶组仔猪终末体重出现下降,而对照组和屎肠球菌组仔猪终末体重均有所提高。2)与对照组相比,断奶组仔猪十二指肠、空肠和回肠绒毛高度、绒毛宽度和绒毛表面积均极显著降低(P<0.01),十二指肠隐窝深度显著提高(P<0.05),十二指肠绒毛高度/隐窝深度(V/C)值极显著降低(P<0.01)。与断奶组相比,屎肠球菌组仔猪十二指肠、空肠和回肠绒毛高度、绒毛宽度和绒毛表面积均极显著提高(P<0.01),十二指肠隐窝深度显著降低(P<0.05),十二指肠V/C值极显著提高(P<0.01)。3)与对照组相比,断奶组仔猪十二指肠和回肠β-半乳糖苷酶活性显著降低(P<0.05),屎肠球菌组空肠和回肠α-淀粉酶活性显著或极显著提高(P<0.05或P<0.01)。与断奶组相比,屎肠球菌组仔猪十二指肠β-半乳糖苷酶活性显著提高(P<0.05)。与对照组和断奶组相比,屎肠球菌组仔猪各肠段脂肪酶活性均极显著提高(P<0.01)。4)与断奶组相比,屎肠球菌组仔猪回肠Chao1指数显著提高(P<0.05)。与对照组相比,断奶组仔猪回肠中变形菌门相对丰度明显提高,回肠中厚壁菌门相对丰度明显降低。与断奶组相比,屎肠球菌组仔猪回肠中厚壁菌门和罗姆布茨菌属相对丰度明显提高,结肠中乳杆菌属相对丰度明显提高,结肠中拟杆菌门相对丰度明显降低。综上所述,断奶前灌喂屎肠球菌菌液可通过改善五指山断奶仔猪肠道形态及菌群结构,并通过提高其肠道相关酶活性,缓解断奶对仔猪的负面影响,进而促进断奶仔猪健康生长。

关键词： 屎肠球菌; 断奶应激; 肠道健康; 肠道菌群

本文引用格式

薛新宇 , 孙军航 , 柒启恩 , 孙瑞萍 , 张浩洁 . 屎肠球菌对五指山断奶仔猪肠道健康及微生物群落的影响[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(5) : 2924 -2937 . DOI: 10.12418/CJAN2024.251

Abstract

The aim of this experiment was to study the effects of Enterococcus faecium on intestinal health and microbial community of Wuzhishan weaned piglets and its alleviating effect on weaning stress. Eighteen 33-day-old Wuzhishan unweaned piglets with initial body weight of (3.79±0.24) kg were randomly divided into control group, weaning group and Enterococcus faecium group, with 6 piglets in each group (half male and half female). Piglets in the control group were not weaned, and were fed 20 mL phosphate buffer (PBS) at 33 days of age and breast milk until 38 days of age. Piglets in weaning group were fed 20 mL PBS at 33 days of age, weaned at 35 days of age, and fed the diet until 38 days of age. Piglets in Enterococcus faecium group were fed 20 mL Enterococcus faecium number with 1×109 CFU/kg BW viable bacteria at 33 days of age, weaned at 35 days of age, and fed the diet until 38 days of age. At 38 days of age, all pigs were slaughtered to determine the intestinal morphology, enzyme activity and microbial community. The results showed as follows: 1) under the condition that the initial body weight of all groups was the same, the final body weight of piglets in weaning group decreased, while that of piglets in the control group and Enterococcus faecium group increased. 2) Compared with the control group, the villus height, villus width and villus surface area of duodenum, jejunum and ileum of piglets in weaning group were extremely significantly decreased (P<0.01), the crypt depth of duodenum was significantly increased (P<0.05), and the villus height to crypt depth ratio (V/C) of duodenum was extremely significantly decreased (P<0.01). Compared with weaning group, the villus height, villus width and villus surface area of duodenum, jejunum and ileum of piglets in Enterococcus faecium group were extremely significantly increased (P<0.01), the crypt depth of duodenum was significantly decreased (P<0.05), and the V/C of duodenum was extremely significantly increased (P<0.01). 3) Compared with the control group, the β-galactosidase activity in duodenum and ileum of piglets in weaning group was significantly decreased (P<0.05), and the α-amylase activity in jejunum and ileum in Enterococcus faecium group was significantly or extremely significantly increased (P<0.05 or P<0.01). Compared with weaning group, the β-galactosidase activity in duodenum of piglets in Enterococcus faecium group was significantly increased (P<0.05). Compared with the control group and weaning group, the lipase activity in each intestinal segment of piglets in Enterococcus faecium group was extremely significantly increased (P<0.01). 4) Compared with weaning group, the ileal Chao1 index of piglets in Enterococcus faecium group was significantly increased (P<0.05). Compared with the control group, the Proteobacteria relative abundance in ileum of piglets in weaning group was increased, and the Firmicutes relative abundance in ileum was decreased. Compared with weaning group, the relative abundances of Firmicutes and Romboutsia in ileum and Lactobacillus relative abundance in colon of piglets in Enterococcus faecium group were increased, and the Bacteroidetes relative abundance in colon was decreased. In conclusion, feeding Enterococcus faecium liquid before weaning can alleviate the negative effects of weaning on piglets by improving the intestinal morphology, microflora structure and related enzyme activity of weaned piglets, thus promoting their healthy growth.

Key words： Enterococcus faecium; weaning stress; intestinal health; intestinal microflora

断奶是仔猪饲养最重要的阶段,传统的仔猪自然断奶一般在45~50日龄[1],但为了满足现代实际生产的需要,一般会提前对仔猪进行早期断奶处理。常见的仔猪如“杜×长×大”三元杂交仔猪一般要达到21~28日龄、体重为6~7 kg再做早期断奶处理[2]。早期断奶可以使母猪正常发情,降低人力和物力成本,但早期断奶会使仔猪产生断奶应激,提高仔猪腹泻率、发病率及死亡率,成为阻碍仔猪生长发育的主要因素[3]。早期断奶对于实际生产意义重大,而如何有效缓解由于断奶对仔猪产生的影响,降低其肠道炎症和腹泻的发生一直是国内外研究的热点和难点。
益生菌是一种微生物,当摄入一定的量或用作饲料添加剂时,具有维持肠道菌群以及提高宿主免疫力的功能。益生菌可通过提高肠道健康和养分消化率,从而提高饲料利用率和断奶仔猪的生长性能,目前可以作为抗生素的替代物,用来预防仔猪断奶腹泻。秦胜容[4]研究表明,在饲粮中添加0.3%的复合益生菌可以提高“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪生长性能,显著提高其回肠绒毛高度,促进肠道发育,使肠道更加健康;刘春汝等[5]研究表明,饲喂包含嗜酸乳杆菌、凝结芽孢杆菌、唾液乳杆菌、海氏肠球菌和屎肠球菌的复合乳酸菌能够抑制“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪肠道鼠伤寒沙门菌的生长,减少肠道的损伤,增强黏膜屏障功能,维护肠道菌群平衡。多种益生菌也被证明对断奶仔猪肠道发育具有促进作用,断奶后灌服5 mL活菌数为3×108 CFU/mL的丁酸梭菌CBX2021可以促进“长×大”二元杂交断奶仔猪生长发育,减少肠道炎症发生,增强肠道免疫功能[6];在饲粮中添加1.0×107 CFU/g的凝结芽孢杆菌BC66可以显著改善“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪的生长性能及肠道绒毛形态[7]。屎肠球菌是动物肠道中正常菌群的一部分,通常定植在动物体的回肠和结肠中,为肠道益生菌,属于乳酸菌类,归属于肠球菌属,其不仅具有乳酸菌的特性,而且对于肠系有害菌具有抑制作用[8]。研究表明,在饲粮中添加500 mg/kg的屎肠球菌,可以提高仔猪的生长性能,改善肠道菌群,增强其免疫力[9];在断奶仔猪饲粮中直接添加屎肠球菌DSM 7134可以降低其腹泻率[10]。不过,关于在断奶前直接灌喂屎肠球菌菌液对于仔猪断奶应激造成的影响是否具有缓解和修复作用,目前仍然存在空缺。
五指山猪是我国海南省中南部的地方猪种,具有抗逆性强、性成熟早、瘦肉率高、肉质好、香味浓、遗传稳定和适应性强等诸多特性[11];且因其器官大小和生理特性等方面与人类相似,因此也是人类试验模型动物的首选[12]。五指山猪自然断奶时间一般在45日龄左右,为满足实际生产的需要会提前至35日龄左右,体重为4~5 kg[13]。与外三元猪种对比[14-15],五指山猪断奶时间较晚,断奶时体重低,断奶应激恢复缓慢,且成活率无法得到保证[16]。目前关于早期断奶对五指山仔猪肠道功能的影响,以及如何减缓因早期断奶产生的应激问题仍存在空缺。因此,为进一步保护与开发这一特色种质资源,本课题以五指山断奶仔猪作为研究对象,探讨屎肠球菌对断奶仔猪生长性能、肠道功能以及微生物群落等方面影响,为屎肠球菌在五指山断奶仔猪上的综合应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本试验所有程序均按照海南省农业科学院畜牧兽医研究所动物伦理委员会批准的方案进行,批准文号为SYXK(LU)20210008。

1.2 试验材料及试验设计

本试验于2022年9月在海南省农业科学院科研基地进行,试验随机从3窝仔猪中选取18头初始体重为(3.79±0.24) kg的33日龄未断奶仔猪,并分为3组(分别为对照组、断奶组和屎肠球菌组),每组6头(公母各占1/2)。试验分组及处理情况见表1。试验所用屎肠球菌为本实验室保存菌株,由生工生物工程(上海)股份有限公司通过16S rRNA基因测序进行菌种鉴定,鉴定结果为屎肠球菌DT1-1。采用MRS液体培养基于37 ℃下在转速200 r/min摇床上振荡培养12~14 h,测定吸光度(OD)值为0.50~0.75。
表1 试验分组及处理情况

Table 1 Experimental grouping and treatment

组别Groups 处理Treatment
对照组
Control group		 不进行断奶处理,在33日龄灌喂20 mL磷酸
盐缓冲液(PBS),饲喂母乳至38日龄
断奶组
Weaning group		 33日龄灌喂20 mL PBS,35日龄断奶,饲喂饲粮至38日龄
屎肠球菌组
Enterococcus faecium group		 33日龄灌喂20 mL屎肠球菌(灌喂量为1×109 CFU/kg BW),
35日龄断奶,饲喂饲粮至38日龄

1.3 测定指标及方法

1.3.1 灌喂方法及体重测定

运用兽药灌喂器单次对未断奶试验仔猪进行灌喂,灌喂前(09:00)对仔猪体重进行称量,采样前(09:00,禁食12 h)再次对体重进行称量,统计数据并分析。

1.3.2 小肠形态测定

试验结束当天,对试验仔猪进行屠宰解剖,仔猪处死后迅速打开腹腔,游离胃肠道,对十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠进行分区无菌结扎。取十二指肠、空肠和回肠肠段约1.5 cm组织样品于4%多聚甲醛[17]中固定保存。切片制作及苏木精-伊红(HE)染色由武汉塞维尔生物科技有限公司完成。1个样品共制作2个切片,每个切片选取6个视野并对视野内肠绒毛的绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度和绒毛表面积等进行数据统计及分析。

1.3.3 小肠相关酶活性测定

分离十二指肠、空肠和回肠,采用载玻片刮取肠道黏膜,并用液氮快速冷冻保存。测定相关酶活性时,取出样品放入冰上待用,按照α-淀粉酶(试剂盒货号ml076677,上海酶联生物科技有限公司)、脂肪酶(试剂盒货号A054-2-1,南京建成生物工程研究所)和β-半乳糖苷酶(试剂盒货号ml076762,上海酶联生物科技有限公司)试剂盒说明书对相应酶活性进行测定。其中,α-淀粉酶活性主要通过检测淀粉酶催化还原的棕红色产物3,5-二硝基水杨酸在540 nm吸光度下的吸收峰进行测定;β-半乳糖苷酶活性主要通过检测其分解产物对-硝基苯酚在400 nm吸光度下的吸收峰进行测定;脂肪酶活性主要通过检测脂肪酶对脂类分解产生的终产物6-甲基试卤灵在580 nm吸光度下的吸收峰进行测定。使用酶标仪(SpectraMax-iD5,Molecular,美国)对吸光度进行检测并统计。

1.3.4 肠道微生物16S rRNA测定

分离回肠和结肠,收集内容物并用液氮快速冷冻保存,使用TGuide S96磁珠法土壤/粪便基因组DNA提取试剂盒[货号DP812,天根生化科技(北京)有限公司]对回肠和结肠内容物样品总DNA进行提取,由北京百迈客云科技有限公司进行16S rRNA V3~V4区测序分析。测序所用引物为338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3';806R:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。

1.3.5 16S rRNA测序结果生物信息学分析

采用Trimmomatic 0.33软件对测序结果raw reads进行质量过滤,并采用Cutadapt 1.9.1软件去除引物序列,得到clean reads;然后采用USEARCH 10软件通过overlap对clean reads进行拼接并进行长度过滤;采用UCHIME 4.2软件去除嵌合体,得到最终数据effective reads。采用USEARCH 10软件对reads在97%水平下进行聚类得到操作分类单元(OTU)结果;采用朴素贝叶斯分类器对特征序列进行分类学注释,参考数据库为SILVA,在门和属水平上统计各组微生物群落组成,并利用QIIME2 2020.6软件生成物种丰度表,采用R语言工具绘制物种分布柱状图;采用QIIME2 2020.6软件,对各组微生物群落alpha多样性指数进行评估统计并进行beta多样性分析,得到多样性指数结果及主坐标分析(PCoA)结果。利用Metastats软件对组间的物种丰度数据进行t检验,得到P值,对P值进行校正,得到Q值,根据P值及Q值筛选出2组样品组成差异的物种,得到Metastats分析结果。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 24.0对试验数据进行单因素方差分析及Duncan氏多重比较,试验结果以“平均值±标准误”表示,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 屎肠球菌对五指山断奶仔猪体重的影响

由表2可知,与对照组相比,断奶组仔猪体重变化差异极显著(P<0.01);与断奶组相比,屎肠球菌组仔猪体重变化差异显著(P<0.05),但与对照组相比,屎肠球菌组体重变化无显著差异(P>0.05)。
表2 五指山断奶仔猪体重变化

Table 2 Body weight change of Wuzhishan weaned piglets kg

项目
Items		 对照组
Control group		 断奶组
Weaning group		 屎肠球菌组
Enterococcus
faecium group		 P值
P-value
初始体重Initial body weight 3.82±0.62 3.80±0.37 3.76±0.25 0.994
终末体重Final body weight 4.45±0.70 3.65±0.33 3.94±0.24 0.493
体重变化Body weight change 0.62±0.09Aa -0.15±0.10Bb 0.18±0.14ABa <0.001

同行数据肩标无字母或相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

2.2 屎肠球菌对五指山断奶仔猪小肠形态的影响

如图1所示,断奶组仔猪小肠绒毛断裂、稀疏,对照组和屎肠球菌组绒毛较为紧密、完整,且屎肠球菌组绒毛比对照组绒毛更为密集。由表3可知,与对照组相比,断奶组仔猪十二指肠、空肠和回肠绒毛高度、绒毛宽度和绒毛表面积均极显著降低(P<0.01),十二指肠隐窝深度显著提高(P<0.05),十二指肠绒毛高度/隐窝深度(V/C)值极显著降低(P<0.01)。与断奶组相比,屎肠球菌组仔猪十二指肠、空肠和回肠绒毛高度、绒毛宽度和绒毛表面积均极显著提高(P<0.01),十二指肠隐窝深度显著降低(P<0.05),十二指肠V/C值极显著提高(P<0.01)。与对照组相比,屎肠球菌组仔猪十二指肠形态各项指标均无显著差异(P>0.05),空肠隐窝深度以及绒毛高度和绒毛表面积极显著降低(P<0.05),回肠绒毛宽度和绒毛表面积显著提高(P<0.05)。
图1 断奶仔猪小肠形态

左侧切片放大倍数为2,右侧切片放大倍数为10。

Fig.1 Small intestine morphology of weaned piglets

Magnification in left section was 2, and magnification in right section was 10.

表3 屎肠球菌对五指山断奶仔猪小肠形态的影响

Table 3 Effects of Enterococcus faecium on small intestine morphology of Wuzhishan weaned piglets

项目
Items		 对照组
Control group		 断奶组
Weaning group		 屎肠球菌组
Enterococcus
faecium group		 P值
P-value
十二指肠Duodenum
绒毛高度Villus height/μm 433.44±4.33Aa 375.15±7.34Bb 439.96±3.87Aa <0.001
绒毛宽度Villus width/μm 134.08±3.17Aa 113.04±0.88Bb 134.85±3.58Aa <0.001
隐窝深度Crypt depth/μm 419.57±6.26b 463.26±14.11a 409.22±16.40b 0.023
绒毛高度/隐窝深度V/C 1.03±0.01Aa 0.81±0.03Bb 1.08±0.04Aa <0.001
绒毛表面积Villus surface area/μm2 92 334.90±2 456.38Aa 67 338.04±1 432.21Bb 94 260.45±2 764.16Aa <0.001
空肠Jejunum
绒毛高度Villus height/μm 414.93±14.13A 214.80±3.66C 309.22±9.62B <0.001
绒毛宽度Villus width/μm 127.25±2.86Aa 93.07±2.23Bb 125.03±2.79Aa <0.001
隐窝深度Crypt depth/μm 340.27±11.46Aa 207.99±7.63Bc 262.77±21.72Bb <0.001
绒毛高度/隐窝深度V/C 1.22±0.01 1.04±0.03 1.21±0.09 0.059
绒毛表面积Villus surface area/μm2 84 067.36±4 222.46A 32 118.02±942.29C 62 104.36±3 001.34B <0.001
回肠Ileum
绒毛高度Villus height/μm 360.02±6.77Aa 209.66±4.13Bb 357.62±8.80Aa <0.001
绒毛宽度Villus width/μm 118.73±7.39Ab 87.72±3.48Bc 141.06±6.67Aa <0.001
隐窝深度Crypt depth/μm 457.54±32.90Aa 208.17±2.94Bb 397.31±10.88Aa <0.001
绒毛高度/隐窝深度V/C 0.81±0.07b 1.01±0.01a 0.91±0.05ab 0.020
绒毛表面积Villus surface area/μm2 68 107.16±4 482.67Ab 29 581.15±1 619.12Bc 81 140.85±5 636.89Aa <0.001

2.3 屎肠球菌对五指山断奶仔猪小肠相关酶活性的影响

由表4可知,与对照组相比,断奶组仔猪十二指肠α-淀粉酶活性极显著提高(P<0.01),回肠α-淀粉酶活性显著提高(P<0.05),但十二指肠和回肠β-半乳糖苷酶活性显著降低(P<0.05),空肠各相关酶活性无显著差异(P>0.05),且各肠段脂肪酶活性均无显著差异(P>0.05)。与断奶组相比,屎肠球菌组仔猪十二指肠α-淀粉酶活性显著降低(P<0.05),但α-淀粉酶活性在空肠和回肠中表现为提高趋势(P>0.05);屎肠球菌组十二指肠β-半乳糖苷酶活性显著提高(P<0.05),β-半乳糖苷酶活性在空肠和回肠中表现为有提高趋势,但差异不显著(P>0.05)。与对照组和断奶组相比,屎肠球菌组仔猪各肠段脂肪酶活性均极显著提高(P<0.01)。与对照组相比,屎肠球菌组仔猪空肠和回肠α-淀粉酶活性显著或极显著提高(P<0.05或P<0.01)。
表4 屎肠球菌对五指山断奶仔猪小肠相关酶活性的影响

Table 4 Effects of Enterococcus faecium on small intestinal related enzyme activities of Wuzhishan weaned piglets

项目
Items		 对照组
Control group		 断奶组
Weaning group		 屎肠球菌组
Enterococcus
faecium group		 P值
P-value
十二指肠Duodenum
α-淀粉酶α-amylase/[mg/(min·g)] 49.85±0.56Bb 52.93±0.45Aa 50.71±0.79ABb <0.001
β-半乳糖苷酶
β-galactosidase/[nmol/(min·g)]		 1 689.12±126.02a 1 242.88±133.65b 1 734.49±124.48a 0.030
脂肪酶Lipase/(U/g prot) 8.64±1.14Bb 13.42±1.36Bb 24.53±3.08Aa <0.001
空肠Jejunum
α-淀粉酶α-amylase/[mg/(min·g)] 48.25±0.93b 49.56±0.63ab 51.42±0.51a 0.021
β-半乳糖苷酶
β-galactosidase/[nmol/(min·g)]		 1 716.11±96.10 1 472.48±153.62 1 697.49±125.28 0.347
脂肪酶Lipase/(U/g prot) 10.34±1.22Bb 10.00±0.22Bb 38.55±2.70Aa <0.001
回肠Ileum
α-淀粉酶α-amylase/[mg/(min·g)] 45.59±1.25Bb 49.05±0.54ABa 49.62±0.52Aa <0.001
β-半乳糖苷酶
β-galactosidase/[nmol/(min·g)]		 1 377.47±180.94a 882.59±82.83b 903.76±46.00b 0.015
脂肪酶Lipase/(U/g prot) 13.35±0.73Bb 10.08±0.74Bb 50.48±1.48Aa <0.001

2.4 屎肠球菌对五指山断奶仔猪肠道微生物群落的影响

2.4.1 OTU划分

16S rRNA测序结果表明,五指山断奶仔猪回肠和结肠内容物共得到平均有效序列数为59 148条,聚类划分到3 596个OTU,共检测到33个门、78个纲、207个目、413个科、868个属和1 103个种。各组肠道内容物微生物群落特征数如图2所示。
图2 肠道内容物微生物群落特征数

Fig.2 Microbial community characteristic number of intestinal contents

2.4.2 肠道微生物群落多样性分析

由表5可知,与对照组相比,断奶组仔猪回肠Chao1指数有降低趋势,但差异不显著(P>0.05)。与断奶组相比,屎肠球菌组仔猪回肠Chao1指数显著提高(P<0.05)。各组间回肠和结肠Simpson指数和Shannon指数均无显著差异(P>0.05)。
表5 肠道微生物群落alpha多样性分析

Table 5 Alpha diversity analysis of intestinal microbial community

项目
Items		 对照组
Control group		 断奶组
Weaning group		 屎肠球菌组
Enterococcus
faecium group		 P值
P-value
回肠Ileum
Chao1指数Chao1 index 545.19±69.39ab 471.26±88.43b 685.71±36.83a 0.025
Simpson指数Simpson index 0.73±0.06 0.76±0.06 0.70±0.04 0.688
Shannon指数Shannon index 2.87±0.32 2.35±0.47 2.47±0.22 0.238
结肠Colon
Chao1指数Chao1 index 1 095.90±92.49 956.99±73.99 1 036.40±44.50 0.424
Simpson指数Simpson index 0.93±0.01 0.95±0.01 0.88±0.06 0.328
Shannon指数Shannon index 5.80±0.27 4.83±0.39 5.11±0.60 0.307
如图3所示,PCoA分析结果表明,不同组间仔猪结肠微生物聚类效果类似,回肠微生物聚类效果也类似,说明仔猪不同肠段微生物组成存在差异。此外,断奶组和屎肠球菌组仔猪结肠微生物组成与对照组聚类效果相似;但是在回肠中,断奶组和屎肠球菌组与对照组之间存在差异。
图3 PCoA分析结果

Fig.3 PCoA analysis result

2.4.3 肠道微生物群落组成比较分析

如图4-A所示,各组仔猪回肠和结肠中的第1优势菌门均为厚壁菌门(Firmicutes),其在断奶组回肠中的相对丰度明显低于对照组和屎肠球菌组;各组回肠中第2优势菌门为变形菌门(Proteobacteria),断奶组回肠变形菌门相对丰度明显高于对照组和屎肠球菌组;此外,断奶组仔猪回肠中蓝细菌门(Cyanobacteria)和放线菌门(Actinobacteriota)的相对丰度相较于其他2个组也明显升高。在结肠中,各组第2优势菌门——拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度在屎肠球菌组中较对照组和断奶组均明显降低,而梭杆菌门(Fusobacteriota)的相对丰度表现出与之相反的结果。
图4 肠道微生物群落组成

Fig.4 Intestinal microbial community composition

如图4-B所示,各组仔猪回肠和结肠中的第1优势菌属均为乳杆菌属(Lactobacillus),但是对照组仔猪回肠中乳杆菌属的相对丰度明显高于断奶组和屎肠球菌组,但其在结肠中以屎肠球菌组相对丰度最高。第2优势菌属在各组中表现各不相同。在回肠中,对照组、断奶组和屎肠球菌组的第2优势菌属分别为韦荣球菌属(Veillonella)(12.58%)、狭义梭菌属1(Clostridium_sensu_stricto_1)(12.79%)和罗姆布茨菌属(Romboutsia)(27.25%);对照组回肠中韦荣球菌属的相对丰度明显高于断奶组和屎肠球菌组;屎肠球菌组回肠中狭义梭菌属1和罗姆布茨菌属的相对丰度也明显高于对照组和断奶组;此外,断奶组回肠链球菌属(Streptococcus)的相对丰度均高于其他2个组。在结肠中,对照组和屎肠球菌组结肠中的第2优势菌属均为毛螺菌属(Lachnospira),而断奶组结肠中的第2优势菌属为考拉杆菌属(Phascolarctobacterium);此外,与回肠中类似,断奶组结肠链球菌属的相对丰度也均高于其他2个组。
线性判别分析效应大小(LEfSe)分析结果(图5)表明,在回肠中,对照组韦荣球菌科(Veillonellaceae)和韦荣球菌属富集程度较其他2组显著提高(P<0.05);在结肠中,断奶组红蝽菌纲(Coriobacteriia)和红蝽菌目(Coriobacteriales)富集程度较其他2组显著提高(P<0.05)。t检验分析结果(图6和图7)表明,与对照组相比,断奶组仔猪回肠中罗氏菌属(Roseburia)和格鲁比卡氏菌属(Globicatella)的相对丰度显著提高(P<0.05),屎肠球菌组回肠中普罗沃氏菌属(Prevotella)和解琥珀酸菌属(Succiniclasticum)的相对丰度极显著提高(P<0.01);断奶组结肠中普氏粪杆菌属(Faecalibacterium)和Allorhizobium_Neorhizobium_Pararhizobium_Rhizobium的相对丰度显著提高(P<0.05),屎肠球菌组结肠中阴沟杆菌属(Cloacibacillus)和莫吉杆菌属(Mogibacterium)的相对丰度显著提高(P<0.05)。与断奶组相比,屎肠球菌组仔猪回肠中罗氏菌属和韦荣球菌属的相对丰度显著降低(P<0.05),结肠中阴沟杆菌属和另枝菌属(Alistipes)的相对丰度显著或极显著提高(P<0.05或P<0.01)。
图5 LEfSe分析结果

Fig.5 LEfSe analysis result

图6 回肠微生物群落相对丰度t检验分析结果

*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。图7同。

Fig.6 Results of t-test for relative abundance of ileal microbial community

* mean significant difference (P<0.05), and ** mean extremely significant difference (P<0.01). The same as Fig.7.

图7 结肠微生物群落相对丰度t检验分析结果

Fig.7 Results of t-test for relative abundance of colonic microbial community

3 讨论

3.1 屎肠球菌对五指山断奶仔猪体重的影响

肠道是动物体必不可少的器官,不仅负责消化食物、吸收养分,同时具有屏障作用,帮助机体抵抗致病菌侵袭,且是机体最大的免疫器官。断奶应激会导致仔猪肠道[14,18]和免疫系统功能发生紊乱[19],破坏肠道菌群平衡[20-21],影响仔猪的生长性能和健康[22]。屎肠球菌是肠道菌群组成菌之一,其在肠道中发挥抑菌、调节肠道菌群以及促进养分消化吸收等作用[23]。研究表明,饲粮中添加500 mg/kg屎肠球菌SF68饲喂35日龄“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪对其生长性能并无显著影响[9];饲粮中添加1.4×109 CFU/kg屎肠球菌SF68饲喂“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪20 d同样不影响其生长性能[24]。本研究直接灌喂五指山断奶仔猪1×109 CFU/kg BW屎肠球菌菌液20 mL后饲养至38日龄发现,在初始体重一致的情况下,其终末体重虽无显著差异,但灌喂屎肠球菌菌液后可以缓解断奶应激产生的体重下降,使五指山断奶仔猪体重增加,这提示屎肠球菌在缓解断奶应激产生的损伤上具有一定的效果。

3.2 屎肠球菌对五指山断奶仔猪小肠形态的影响

小肠绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度、V/C值以及绒毛表面积等是反映小肠形态的重要指标。小肠绒毛高度可以反映消化吸收能力,隐窝深度的提高一般预示着绒毛组织更替的增加,提示肠道炎症等疾病的发生[25],小肠绒毛表面积的增加对应肠绒毛细胞成熟率的增加[26],V/C值提高则反映肠道消化吸收能力增强[27]。研究表明,断奶应激会破坏仔猪小肠形态完整性,饲喂断奶仔猪含有6×1012 CFU/kg表达猪乳铁蛋白肽的屎肠球菌的饲粮26 d可以使其肠道绒毛结构更完整,充血减少[28];在“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪饲粮中添加500 mg/kg屎肠球菌饲喂14 d可以显著提高V/C值,使肠道具有更好的形态[29]。本研究对肠道切片进行观察并统计绒毛形态数据结果发现,直接灌喂五指山猪断奶仔猪屎肠球菌菌液可以提高小肠绒毛高度,降低隐窝深度,提高十二指肠和空肠V/C值以及提高小肠绒毛表面积,使小肠绒毛形态更为完整,这说明屎肠球菌可以缓解断奶应激造成的小肠绒毛的损伤,对增强小肠的消化吸收能力也存在一定作用。

3.3 屎肠球菌对五指山断奶仔猪小肠相关酶活性的影响

肠道酶活性是鉴定肠道消化吸收能力的重要指标,肠道形态的改变也影响肠道消化酶的活性[30],而肠道酶活性及肠道形态的完整性都影响着饲粮养分的利用率[31]。断奶应激会使仔猪大多数胰腺酶、二糖酶和肽酶的活性降低,使得肠道对养分的消化吸收能力受到限制[32-33],而在饲粮中添加200 mg/kg屎肠球菌能够显著提升小肠蛋白酶、麦芽糖酶等消化酶活性[34]。本研究对五指山断奶仔猪小肠相关酶活性的检测结果显示,直接灌喂屎肠球菌菌液可以使小肠部分酶活性提高,尤其对脂肪酶和β-半乳糖苷酶提升效果较为显著,这与小肠形态结果相对应。由此说明,屎肠球菌可以提高五指山断奶仔猪小肠消化酶的活性,从而加强肠道的消化能力,提高饲粮的养分利用率。

3.4 屎肠球菌对五指山断奶仔猪肠道微生物群落的影响

早期断奶仔猪由于消化道、肠道微生物及免疫功能发育尚未成熟,容易造成早期断奶仔猪生长迟缓以及腹泻等问题。稳定的肠道菌群可以降低有害菌对肠道的影响,并参与调控机体健康[35]。当添加一定量的益生菌在动物饲粮中后,能够提高宿主肠道中有益微生物的比例,抑制不良微生物滋生,促进动物肠道健康[36]。早期研究结果表明,在饲粮中添加500 mg/kg屎肠球菌饲喂35 d可以提高“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪肠道中乳杆菌属的比例[9],抑制病原菌和腐败菌的增殖[37]。本研究16S rRNA测序结果显示,断奶前灌喂屎肠球菌菌液能显著调节断奶仔猪肠道菌群物种的多样性和丰富度,且断奶仔猪回肠中变形菌门、蓝细菌门和放线菌门等有害菌相对丰度较对照组明显升高。研究发现,蓝细菌门在肠道中的相对丰度与炎症性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)的发生有关,对机体健康造成威胁[38];而灌喂屎肠球菌菌液会使断奶仔猪回肠和结肠中乳杆菌相对丰度在门(厚壁菌门)和属(乳杆菌属)水平上均得到提升,从而增强肠道健康。本试验中,第2优势菌属在各组中表现各不相同。在回肠中,对照组、断奶组和屎肠球菌组的第2优势菌属分别为韦荣球菌属、狭义梭菌属1和罗姆布茨菌属;在结肠中,对照组和屎肠球菌组的第2优势菌属为毛螺菌属,断奶组则为考拉杆菌属。罗姆布茨菌属主要影响脂质代谢调节和脂肪消化吸收[39],毛螺菌属一般认为主要调节肠道淀粉的消化及代谢[40],均属于益生菌。而韦荣球菌属被证明与肝病、哮喘等多种免疫疾病有关[41-42];狭义梭菌属1为梭杆菌门,与多种感染类疾病有关[43],均为有害菌。考拉杆菌属为条件致病菌,研究表明其与情绪有关[44],会间接影响仔猪食欲。本试验在断奶前灌喂屎肠球菌菌液后第2优势菌属相对丰度变化较大,但呈现出益生菌(罗姆布茨菌属、毛螺菌属)相对丰度提高、有害菌(变形菌门、狭义梭菌属1和韦荣球菌属)及条件致病菌(考拉杆菌属)相对丰度降低的趋势,即断奶前灌喂屎肠球菌菌液可以促进有益菌的增殖,抑制有害菌及条件致病菌的增殖。研究表明,肠道酶活性的改变可以对肠道微生物群落造成一定的影响,间接改善肠道微生态环境,进一步加强肠道健康,而肠道微生物群落的改变也可以改善肠道酶环境及绒毛健康[45],这与本研究结果一致,说明屎肠球菌可以通过维持小肠绒毛健康、提高消化酶活性及改善肠道微生物群落从而提升断奶仔猪消化吸收和抗应激能力,从而使生长性能得到恢复。

4 结论

综上所述,在五指山仔猪33日龄时灌喂1×109 CFU/kg BW屎肠球菌菌液可以缓解断奶应激造成的影响,具体表现为使仔猪的体重恢复、维护小肠形态、提高肠道酶活性以及维持肠道微生物群落平衡,从而保证仔猪肠道健康,促使仔猪正常生长发育。

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