动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 5: 3274 - 3283

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.280

研究论文

玉米秸秆中7种游离单糖的高效液相色谱测定方法

  • 许丽卫 ,
  • 耿梅梅 ,
  • 陈闻 ,
  • 王久荣 ,
  • 张秀敏 ,
  • 孙德慧 , *
展开
  • 中国科学院亚热带农业生态研究所,亚热带农业生态过程重点实验室,长沙 410125
* 孙德慧,工程师,E-mail:

许丽卫(1983—),女,河北定州人,高级工程师,博士,从事色谱分离与分析研究。E-mail:

Office editor: 武海龙

收稿日期: 2023-11-13

  网络出版日期: 2024-05-15

基金资助

湖南省科技创新计划项目(2023RC3206)

收起

A Measurement Method of Seven Free Monosaccharides in Corn Stalks by High-Performance Liquid Chromatography

  • XU Liwei ,
  • GENG Meimei ,
  • CHEN Wen ,
  • WANG Jiurong ,
  • ZHANG Xiumin ,
  • SUN Dehui , *
Expand
  • Key Laboratory for Agro-Ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China
* engineer, E-mail:

Received date: 2023-11-13

  Online published: 2024-05-15

Fold

摘要

本研究旨在建立一种测定玉米秸秆中7种游离单糖[D(+)-葡萄糖、L-鼠李糖、D(+)-木糖、L-阿拉伯糖、D(-)-核糖、D(+)-半乳糖和D(+)-甘露糖]的高效液相色谱测定方法。将玉米秸秆在60 ℃干燥后粉碎,以水作为提取溶剂,98 ℃水浴提取1 h,冷却后离心取上清液;利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化处理,上清液过0.22 μm滤膜,以Agilent Zorbax SB-C18色谱柱进行高效液相色谱分析,7种组分在56 min内达到分离。结果表明:D(+)-葡萄糖、L-鼠李糖、D(+)-木糖、L-阿拉伯糖、D(-)-核糖、D(+)-半乳糖和D(+)-甘露糖的保留时间和峰面积的日内相对标准偏差均分别小于1.0%和5.0%,日间相对标准偏差均分别小于1.0%和7.5%;线性范围分别为0.31~2 000 μg/mL、0.31~200 μg/mL、0.50~200 μg/mL、0.75~200 μg/mL、0.31~200 μg/mL、0.75~200 μg/mL和0.31~200 μg/mL,线性关系良好,相关系数均达到0.999以上;检出限为0.10~0.25 μg/mL,加标回收率为79.9%~114.8%。由此可见,本研究建立的方法不仅操作简单,还可以对玉米秸秆中的7种游离单糖准确定量,为研究玉米秸秆中糖类物质含量以及在动物体内的消化吸收提供技术支撑。

关键词： 玉米秸秆; 单糖; PMP衍生; 高效液相色谱

本文引用格式

许丽卫 , 耿梅梅 , 陈闻 , 王久荣 , 张秀敏 , 孙德慧 . 玉米秸秆中7种游离单糖的高效液相色谱测定方法[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(5) : 3274 -3283 . DOI: 10.12418/CJAN2024.280

Abstract

The objective of this study was to establish an efficient high-performance liquid chromatography method for the determination of seven free monosaccharides [D (+)-glucose, L-arabinose, D (+)-xylose, L-ribose, D (-)-ribose, D (+)-galactose and D (+)-mannose] in corn stalks. Corn stalks were dried at 60 °C and ground into powder before being extracted with water at 98 ℃ for one hour, after cooling and centrifugation to obtain the supernatant; it was derivatized using 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP), filtered through a 0.22 μm membrane filter and analyzed by high-performance liquid chromatography using an Agilent Zorbax SB-C18 column, and the seven components were separated within 56 min. The results showed that the intra-day relative standard deviations of retention time and peak area for D (+)-glucose, L-arabinose, D (+)-xylose, L-ribose, D (-)-ribose, D (+)-galactose and D (+)-mannose were less than 1.0% and 5.0%, respectively; and inter-day relative standard deviations were less than 1.0% and 7.5%, respectively; the linear ranges were 0.31 to 2 000 μg/mL, 0.31 to 200 μg/mL, 0.50 to 200 μg/mL, 0.75 to 200 μg/mL, 0.31 to 200 μg/mL, 0.75 to 200 μg/mL and 0.31 to 200 μg/mL, with good linearity, the correlation coefficients were all above 0.999; the detection limits were 0.10 to 0.25 μg/mL, and the spiked recoveries were 79.9% to 114.8%. In conclusion, the method established in this study is not only simple to operate, but can also accurately quantify seven free monosaccharides in corn straw, this method provides technical support for studying sugar content in corn stalks as well as their digestion and absorption in animals.

Key words： corn stalks; monosaccharides; PMP-derived; high-performance liquid chromatography

玉米秸秆中含有丰富的养分,主要由纤维素类物质、可溶性糖类及少量的粗蛋白质、粗脂肪、无机盐及水等组成,可被制作青贮、黄贮或干草等饲喂给动物[1]。长期以来对玉米秸秆营养成分利用的研究,主要集中在蛋白质、纤维素类物质等,但对玉米秸秆中可溶性糖类物质的测定分析研究较少[2-3]。
玉米秸秆中的碳水化合物经过消化代谢后可为瘤胃微生物和宿主提供能量,分为非结构性碳水化合物和结构性碳水化合物2种,其中非结构性碳水化合物主要有糖类和淀粉[4]。糖类又可以分为单糖、寡糖和多糖等,单糖可以被机体细胞直接利用,供给自身的生长和发育,而复杂的寡糖和多糖先被分解为单糖,再在细胞内酶的作用下生成挥发性脂肪酸,在此过程中产生ATP,供给微生物利用[5]。单糖也可以被用来生成丙酮酸,该过程中释放出的电子被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)捕获生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),进而参与甲烷生成和不饱和脂肪酸的氢化等反应。挥发性脂肪酸通过糖异生作用生成葡萄糖的前体物质,实现动物体内的糖类物质代谢平衡,可见糖类物质在动物生长发育等过程中发挥着至关重要的作用[6]。
单糖是不能再水解的糖类,为构成寡糖和多糖分子的基本单位,主要有葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖等,易溶于水,极性较强,且没有发色团,常见的检测方法有离子色谱法[7]、气相色谱法和液相色谱法[8⇓⇓⇓-12]。离子色谱法灵敏度和分离度较高,但其呈碱性的流动相,易使糖类分解和异构化;气相色谱法需要复杂的衍生化操作且衍生副产物多;高效液相色谱法直接测定单糖常用的示差折光检测器灵敏度较低,无法进行梯度洗脱,而蒸发光散射检测器对含量低的目标物检测不友好,定量误差较大。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生结合高效液相色谱法,反应条件温和、操作简单、产物单一、衍生效率高、紫外吸收强,与其他方法相比,成本相对较低[13]。因此,本试验拟用水作为溶剂,对玉米秸秆中的游离单糖进行提取,利用PMP衍生单糖后通过C18柱分离,采用高效液相色谱结合二极管阵列检测器进行分析,可为研究饲料中的单糖在动物体内的消化代谢机制及开发利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

D(+)-葡萄糖(≥99%)、L-鼠李糖(≥99%)、D(+)-木糖(≥99%)、L-阿拉伯糖(≥99%)、D(-)-核糖(≥99%)、D(+)-半乳糖(≥99%)和D(+)-甘露糖(≥99%)等标准品均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙腈、甲醇(色谱纯,美国Fisher公司),磷酸二氢钾(优级纯,上海国药公司),PMP、三氯甲烷、氢氧化钾、盐酸、氢氧化钠(分析纯,上海国药公司);超纯水(中国科学院亚热带农业生态过程重点实验室自制、电阻率为18.2 MΩ·cm);尼龙滤膜(0.22 μm,天津希波氏公司);玉米秸秆样品为中国科学院亚热带农业生态研究所畜禽健康养殖研究中心提供(正常收获期不带穗的玉米秸秆,风干样),常温保存备用。

1.2 试剂配制

0.3 mol/L的氢氧化钠溶液:称取1.20 g氢氧化钠,加入少量水完全溶解并放至室温后,定容至100 mL。
0.3 mol/L的盐酸溶液:向水中加入2.5 mL盐酸,定容至100 mL。
1.0 mol/L的氢氧化钾溶液:称取5.60 g氢氧化钾,加入少量水完全溶解并放至室温后,定容至100 mL。
0.5 mol/L的PMP甲醇溶液:称取0.871 g PMP,用少量甲醇完全溶解后,再用甲醇定容至10 mL。现用现配,因需配制。

1.3 仪器与设备

1290高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography,HPLC)(美国Agilent公司),配有二元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器和色谱柱Zorbax SB-C18(4.6 mm× 250 mm,5 μm);Vortex-6涡旋混合器(江苏其林贝尔有限公司);ME104、XPR2电子天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司);Classic DI超纯水系统(英国Elga公司);CR22GⅡ高速离心机(日本日立公司)。

1.4 色谱条件

流动相A:100 mmol/L磷酸盐溶液;称取13.60 g磷酸二氢钾,用900 mL水完全溶解后,加入1.0 mol/L的氢氧化钾溶液调整pH为6.8,再用水定容至1 000 mL。流动相B:乙腈。流动相A∶流动相B(体积比)=84∶16,等度洗脱;运行时间:56 min;进样体积:10 μL;流速:1.0 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:245 nm。

1.5 样品前处理

玉米秸秆样品在60 ℃干燥后粉碎,过60目筛,称取0.100 0 g,加入水3.0 mL,98 ℃水浴提取1 h,取出后冷却至室温;10 000×g离心10 min,取出上清液待衍生。将上清液100 μL放置于2 mL离心管中,加入0.3 mol/L的氢氧化钠溶液50 μL,涡旋混合均匀后,继续加入0.5 mol/L的PMP甲醇溶液50 μL,再次涡旋混合均匀,然后将其放置在70 ℃金属加热板上,反应30 min后取出,自然冷却至室温,加入0.3 mol/L的盐酸溶液50 μL,涡旋混合均匀后,继续加入1.0 mL三氯甲烷,涡旋混匀后静置分层。吸取上层清液90 μL至另一离心管中,然后加入等体积的水,混合均匀,过0.22 μm滤膜后装入带有内插管的样品瓶中,待测。

1.6 标准工作曲线配制、线性范围及检出限

D(+)-葡萄糖、L-鼠李糖、D(+)-木糖、L-阿拉伯糖、D(-)-核糖、D(+)-半乳糖和D(+)-甘露糖的标准品,各称取10.0 mg于10 mL容量瓶中,用水溶解并定容,摇匀,配制其浓度均为1.00 mg/mL的标准储备液;以此作为母液,以水为稀释液配制一系列标准曲线,各个标准曲线的浓度见表1。目标化合物根据衍生物峰响应强度进一步稀释测定其定量限和检出限。以各目标物质的浓度为横坐标,衍生物峰面积为纵坐标作图,得线性回归方程;以目标物3倍信噪比的浓度为其检出限,10倍信噪比的浓度为其定量限。
表1 目标物标准工作液的浓度

Table 1 Concentrations of target standard working solution μg/mL

项目
Items		 标准1
Standard 1		 标准2
Standard 2		 标准3
Standard 3		 标准4
Standard 4		 标准5
Standard 5		 标准6
Standard 6
D(+)-甘露糖D (+)-mannose 10.00 5.00 2.50 1.25 0.63 0.31
D(-)-核糖D (-)-ribose 10.00 5.00 2.50 1.25 0.63 0.31
L-鼠李糖L-rhamnose 1.50 0.75 0.38 0.19 0.09 0.05
D(+)-葡萄糖D (+)-glucose 100.00 50.00 25.00 12.50 6.25 3.13
D(+)-半乳糖D (+)-galactose 10.00 5.00 2.50 1.25 0.63 0.31
D(+)-木糖D (+)-xylose 5.00 2.50 1.25 0.63 0.31 0.16
L-阿拉伯糖L-arabinose 10.00 5.00 2.50 1.25 0.63 0.31

1.7 方法的精密性和重复性

以标准1和标准3为供试品,按照1.5处理后同1 d内分别连续测定5次,考察方法的日内重复性;再分别连续测定3 d,考察方法的日间重复性。以玉米秸秆为供试品,平行取样5份,每份称取0.100 0 g,按照1.5处理后,同1 d内分别测定1次,考察方法的日内重复性;再分别连续测定3 d,考察方法的日间重复性。

1.8 方法的加标回收率

以玉米秸秆为供试品,各向其中分别加入50、100和150 μL的混合标准溶液A(取1.6中配制的标准储备液,配制D(+)-葡萄糖、L-鼠李糖、D(+)-木糖、L-阿拉伯糖、D(-)-核糖、D(+)-半乳糖和D(+)-甘露糖的浓度分别为2 000、30、100、200、200、200和200 μg/mL),按照1.5处理后,测定样品加标回收率。

1.9 数据统计分析

试验数据采用Prism 9.3软件进行统计分析,结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

样品前处理对提取溶剂、提取时间和料液比分别进行了考察。提取溶剂分别选择了热水、冷水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇和80%乙醇,结果表明7种目标物在热水中的提取量均高于冷水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇和80%乙醇(图1-a);这可能是由于温度升高,单糖在热水中的溶解度增加所致。提取时间分别选用了1、2和3 h,结果表明7种目标物在1 h的提取效率较高,2和3 h时均有不同程度的下降(图1-b)。试验比较了0.1和0.2 g样品在3.0 mL提取溶剂中的提取效果,结果发现0.2 g样品中目标物含量是0.1 g样品的2倍,表明3.0 mL已足以将0.1 g样品中目标物提取完全。当样品中目标物的浓度较低时,可以将玉米秸秆的质量提高至0.2 g。最终选定了样品提取条件为:以水作为提取溶剂,98 ℃水浴提取1 h,提取料液比为样品质量:提取溶剂体积为1∶30 (g∶mL)。
图1 提取溶剂(a)和提取时间(b)对目标物的影响

Fig.1 Effects of extraction solvent (a) and extraction time (b) on target analytes

2.2 标准工作曲线配制、线性范围及检出限

D(+)-葡萄糖、L-鼠李糖、D(+)-木糖、L-阿拉伯糖、D(-)-核糖、D(+)-半乳糖和D(+)-甘露糖的线性范围分别为0.31~2 000 μg/mL、0.31~200 μg/mL、0.50~200 μg/mL、0.75~200 μg/mL、0.31~200 μg/mL、0.75~200 μg/mL和0.31~200 μg/mL。7种目标物均在线性范围内,且线性关系良好,相关系数均达到0.999以上,检出限为0.10~0.25 μg/mL(表2)。
表2 目标物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

Table 2 Linear range, linear equation, correlation coefficient, detection limit and quantitation limit of target analytes

项目
Items		 保留时间
Retention
time/min		 线性方程
Linear equation		 相关系数
Correlation
coefficient		 线性范围
Linear range/
(μg/mL)		 检出限
Detection limit/
(μg/mL)		 定量限
Quantitation
limit/(μg/mL)
D(+)-甘露糖
D(+)-mannose		 16.9 Y=14.55X-1.487 0.999 0.31~200 0.10 0.31
D(-)-核糖
D(-)-ribose		 21.6 Y=15.69X-1.433 0.999 0.31~200 0.10 0.31
L-鼠李糖
L-rhamnose		 23.6 Y=11.04X-0.187 0.999 0.31~200 0.10 0.31
D(+)-葡萄糖
D(+)-glucose		 35.8 Y=9.419X-0.874 0.999 0.31~2 000 0.10 0.31
D(+)-半乳糖
D(+)-galactose		 40.9 Y=14.44X-0.608 0.999 0.75~200 0.25 0.75
D(+)-木糖
D(+)-xylose		 43.3 Y=11.53X-0.298 0.999 0.50~200 0.15 0.50
L-阿拉伯糖
L-arabinose		 45.1 Y=16.05X-0.488 0.999 0.75~200 0.25 0.75

2.3 方法的精密性和重复性

由表3可见,方法精密性检测结果显示,各色谱峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)分别不超过0.5%和5.0%,表明本方法精密性良好。由表4可见,方法的重复性检测结果显示,各色谱峰的保留时间和峰面积的日内相对标准偏差分别不超过1.0%和5.0%,日间相对标准偏差不超过1.0%和7.5%,说明本方法重复性良好。
表3 标准样品的精密性和重复性

Table 3 Precision and repeatability of standard samples

样品
Samples		 目标物
target
analytes		 保留时间Retention time 峰面积Peak area
日内
Intra-day (n=5)		 相对标
准偏差
RSD/%		 日间
Inter-day (n=15)		 相对标
准偏差
RSD/%		 日内
Intra-day (n=5)		 相对标
准偏差
RSD/%		 日间
Inter-day (n=15)		 相对标
准偏差
RSD/%
标准1
Standard 1		 D(+)-甘露糖
D(+)-mannose		 16.860±0.009 0.13 16.857±0.007 0.17 143.30±0.82 1.28 143.90±0.41 1.11
16.880±0.006 0.09 143.40±0.41 0.64
16.831±0.010 0.13 144.90±0.74 1.14
D(-)-核糖
D(-)-ribose		 21.605±0.009 0.10 21.591±0.010 0.17 174.90±0.21 0.26 178.00±0.63 1.38
21.619±0.007 0.08 178.30±0.17 0.22
21.549±0.012 0.12 180.70±0.14 0.17
L-鼠李糖
L-rhamnose		 23.618±0.010 0.09 23.614±0.009 0.15 16.92±0.10 1.28 17.02±0.10 2.16
23.649±0.006 0.06 16.94±0.22 2.85
23.574±0.009 0.09 17.20±0.16 2.14
D(+)-葡萄糖
D(+)-glucose		 35.863±0.019 0.12 35.866±0.013 0.14 875.10±5.86 1.50 810.10±12.43 5.94
35.912±0.013 0.08 780.20±0.23 0.07
35.822±0.010 0.07 774.90±0.21 0.06
D(+)-半乳糖
D(+)-galactose		 40.982±0.022 0.12 40.987±0.013 0.12 143.40±0.34 1.05 138.90±0.89 2.48
41.033±0.013 0.07 136.30±0.24 0.44
40.946±0.014 0.08 137.10±0.27 0.45
D(+)-木糖
D(+)-xylose		 43.385±0.021 0.10 43.393±0.013 0.12 83.56±0.44 0.18 82.57±0.25 1.16
43.442±0.013 0.07 81.88±0.23 0.63
43.351±0.011 0.06 82.28±0.12 0.33
L-阿拉伯糖
L-arabinose		 45.011±0.023 0.12 45.013±0.013 0.11 185.00±0.54 0.65 184.20±0.30 0.64
45.056±0.015 0.08 183.30±0.36 0.44
44.972±0.011 0.05 184.30±0.43 0.52
标准3
Standard 3		 D(+)-甘露糖
D(+)-mannose		 16.856±0.007 0.09 16.858±0.011 0.27 35.68±0.57 3.57 35.49±0.19 2.07
16.857±0.030 0.39 35.50±0.14 0.89
16.860±0.022 0.29 35.30±0.13 0.80
D(-)-核糖
D(-)-ribose		 21.602±0.007 0.07 21.601±0.009 0.16 42.46±0.14 0.75 43.00±0.12 1.10
21.614±0.014 0.15 43.30±0.13 0.67
21.588±0.022 0.23 43.26±0.09 0.45
L-鼠李糖
L-rhamnose		 23.607±0.013 0.13 23.621±0.014 0.23 3.82±0.06 3.88 3.92±0.05 4.84
23.643±0.024 0.23 3.84±0.06 3.49
23.615±0.033 0.31 4.10±0.07 3.86
D(+)-葡萄糖
D(+)-glucose		 35.873±0.013 0.08 35.871±0.028 0.31 203.70±0.10 1.10 199.10±0.94 1.83
35.909±0.021 0.13 197.50±0.25 0.28
35.830±0.084 0.53 196.10±0.19 0.22
D(+)-半乳糖
D(+)-galactose		 40.979±0.019 0.10 41.014±0.017 0.16 34.80±0.28 1.81 34.53±0.14 1.60
41.030±0.019 0.10 34.46±0.24 1.57
41.023±0.043 0.24 34.34±0.22 1.45
D(+)-木糖
D(+)-xylose		 43.418±0.026 0.13 43.429±0.019 0.17 12.96±0.11 1.94 12.85±0.06 1.81
43.430±0.029 0.15 12.86±0.04 0.69
43.440±0.048 0.24 12.74±0.13 2.33
L-阿拉伯糖
L-arabinose		 45.016±0.011 0.05 45.035±0.015 0.13 35.42±0.15 0.92 36.02±0.13 1.41
45.053±0.022 0.11 36.36±0.14 0.88
45.037±0.038 0.19 36.28±0.05 0.30
表4 样品的重复性

Table 4 Repeatability of samples

项目
Items		 保留时间Retention time 峰面积Peak area
日内
Intra-day (n=5)		 相对标准偏差
RSD/%		 日间
Inter-day (n=15)		 相对标准偏差
RSD/%		 日内
Intra-day (n=5)		 相对标准偏差
RSD/%		 日间
Inter-day (n=15)		 相对标准偏差
RSD/%
D(+)-甘露糖
D(+)-mannose		 16.853±0.006 0.08 16.845±0.009 0.22 91.07±0.95 2.33 91.79±0.60 2.51
16.865±0.015 0.21 91.50±1.47 3.60
16.818±0.019 0.25 92.90±0.41 0.99
D(-)-核糖
D(-)-ribose		 21.615±0.011 0.12 21.617±0.007 0.14 5.16±0.09 4.01 5.13±0.04 3.33
21.636±0.018 0.19 5.04±0.05 2.26
21.599±0.005 0.05 5.18±0.08 3.45
L-鼠李糖
L-rhamnose		 23.662±0.016 0.16 23.886±0.047 0.78 1.54±0.02 3.55 1.51±0.02 4.67
24.081±0.023 0.22 1.50±0.03 4.71
23.917±0.032 0.30 1.50±0.03 4.71
D(+)-葡萄糖
D (+)-glucose		 35.842±0.020 0.13 35.848±0.019 0.21 793.80±17.89 5.04 733.80±14.07 7.42
35.916±0.025 0.16 705.70±13.96 4.42
35.787±0.026 0.16 701.90±14.58 4.64
D(+)-半乳糖
D(+)-galactose		 40.976±0.025 0.14 41.004±0.020 0.19 14.28±0.23 3.58 13.15±0.24 6.92
41.079±0.028 0.15 12.88±0.08 1.39
40.958±0.028 0.15 12.30±0.06 1.15
D(+)-木糖
D(+)-xylose		 43.378±0.027 0.14 43.420±0.021 0.18 40.82±0.45 2.45 40.41±0.39 3.75
43.498±0.031 0.16 40.22±0.87 4.81
43.383±0.021 0.11 40.20±0.78 4.31
L-阿拉伯糖
L-arabinose		 44.993±0.027 0.13 45.003±0.020 0.18 38.82±0.77 4.42 38.37±0.32 3.24
45.078±0.030 0.15 38.34±0.49 2.83
44.938±0.016 0.08 37.96±0.40 2.36

2.4 方法的回收率

由表5可见,样品加标回收率为79.9%~114.8%。
表5 样品加标回收率

Table 5 Spiked recoveries of samples (n=4)

项目
Items		 初始值
Initial value/
(μg/mL)		 添加量
Additive amount/
(μg/mL)		 测定值
Measured value/
(μg/mL)		 加标回收率
Spiked recovery/%
D(+)-甘露糖
D(+) - mannose		 7.05±0.30 3.33 10.20±0.34 93.5±10.2
6.67 13.40±0.39 94.9±5.9
10.00 17.30±0.39 102.9±3.9
D(-)-核糖
D(-)-ribose		 0.53±0.02 3.33 3.69±0.05 102.9±3.1
6.67 6.72±0.25 102.9±3.1
10.00 10.30±0.11 102.9±3.1
L-鼠李糖
L-rhamnose		 1.87±0.07 0.50 2.34±0.03 94.8±1.4
1.00 2.75±0.08 92.9±3.7
1.50 3.36±0.10 97.4±1.1
D(+)-葡萄糖
D(+)-glucose		 144.00±5.89 33.30 170.00±2.75 79.9±8.3
66.70 202.00±6.28 86.8±9.5
100.00 238.00±7.24 93.7±7.2
D(+)-半乳糖
D(+)-galactose		 1.65±0.06 3.33 5.23±0.17 106.6±4.6
6.67 8.35±0.17 100.4±2.9
10.00 12.50±0.31 108.1±3.1
D(+)-木糖
D(+)-xylose		 7.10±0.31 1.67 9.01±0.15 114.8±8.9
3.33 10.50±0.25 103.1±7.6
5.00 12.90±0.23 115.8±4.7
L-阿拉伯糖
L-arabinose		 3.23±0.15 3.33 6.93±0.30 110.8±8.4
6.67 9.98±0.46 100.8±6.6
10.00 14.00±0.37 107.3±3.7

3 讨论

碳水化合物是一切生物体维持生命活动所需能量的主要来源,不仅是营养物质,而且还具有一些特殊的生理功能,如构成细胞和组织、维持脑细胞的正常功能、抗酮和解毒等[14]。饲料中含有丰富的碳水化合物,但是对于碳水化合物在生物体内的摄入、代谢及转运研究较少,尤其是可溶性糖类,这主要是由于饲料检测糖类技术缺乏。玉米秸秆作为一种典型的常用植物饲料,玉米秸秆中可溶性单糖的研究较少,对其糖类物质在动物体内的转化途径及营养作用更是缺乏技术支持。目前对玉米秸秆中碳水化合物的研究,主要围绕多糖的提取和转化,通常对玉米秸秆多糖经过水解后再进行单糖的分析[15-16]。以上研究方法对助力动物营养及饲料学方面研究的参考价值不大,因此本试验以热水作为提取溶剂,水浴浸提后直接衍生测定其单糖的含量,以游离单糖为主要检测目标物,且通过对提取时间和料液比的优化,为玉米秸秆以及其他饲料中的单糖测定提供了可行的技术支持。
PMP作为实验室常用的单糖衍生试剂,衍生反应温和、操作性强、衍生效率高及副产物少、紫外吸收强,其单糖衍生结合高效液相色谱仪,是对单糖分析测定的经典方法,相对于不衍生直接进行液相测定相比,具有较高的灵敏度,可以对低含量单糖准确测定[17-18]。尽管PMP衍生法灵敏,但是试验中发现,衍生后样品用三氯甲烷萃取分层后取出时,应取上层清液,否则易造成样品间的重复性变差、样品峰中干扰峰增多的现象。此外还发现,PMP的甲醇溶液,常温下容易挥发,而且低温(4 ℃)过夜保存会析出晶体,几乎难以复溶。因此,为了保证试验结果的准确性,PMP的甲醇溶液需要现配现用。

4 结论

本试验通过将玉米秸秆烘干粉碎,热水浴提取后PMP衍生建立了一种测定饲料中D(+)-葡萄糖、L-鼠李糖、D(+)-木糖、L-阿拉伯糖、D(-)-核糖、D(+)-半乳糖和D(+)-甘露糖的高效液相色谱测定方法。该方法操作简单且可靠,并具有较高的灵敏度和重复性,可准确定量测定玉米秸秆中的7种游离单糖,为研究饲料中糖类物质的利用及其在动物体内的代谢与作用机制提供技术支撑。

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