动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 5: 3340 - 3351

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.286

研究论文

乳酸菌和纤维素酶对马蹄渣和玉米蛋白粉混合青贮饲料品质及体外瘤胃发酵特性的影响

  • 赵超 ,
  • 陈琼 ,
  • 李越 ,
  • 郭勇庆 ,
  • 刘德武 ,
  • 孙宝丽 , *
展开
  • 华南农业大学动物科学学院,广州 510642
* 孙宝丽,教授,博士生导师,E-mail:

赵 超(1995—),男,黑龙江双鸭山人,博士研究生,研究方向为反刍动物营养。E-mail:

Office editor: 菅景颖

收稿日期: 2023-12-22

  网络出版日期: 2024-05-16

基金资助

广东省现代农业产业技术体系南方现代草牧业(羊)产业创新团队-饲料资源开发与利用岗位专家项目(2023KJ127)

收起

Effects of Lactic Acid Bacteria and Cellulase on Quality and in Vitro Rumen Fermentation Characteristics of Mixed Silage of Chinese Water Chestnut Residue and Corn Gluten Meal

  • ZHAO Chao ,
  • CHEN Qiong ,
  • LI Yue ,
  • GUO Yongqing ,
  • LIU Dewu ,
  • SUN Baoli , *
Expand
  • College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
* professor, E-mail:

Received date: 2023-12-22

  Online published: 2024-05-16

Fold

摘要

本试验旨在评价不同添加剂对马蹄渣和玉米蛋白粉混合青贮饲料发酵品质、化学成分、微生物数量和体外瘤胃发酵特性的影响。将马蹄渣和玉米蛋白粉按照76∶24的比例混合均匀作为青贮原料,在青贮时分别进行如下处理:1)不添加乳酸菌和纤维素酶(CON组);2)添加1×108 CFU/g乳酸菌(LAB组);3)添加50 U/g纤维素酶(CE50组);4)添加100 U/g纤维素酶(CE100组);5)添加1×108 CFU/g乳酸菌+50 U/g纤维素酶(LAB+CE50组);6)添加1×108 CFU/g乳酸菌+100 U/g纤维素酶(LAB+CE100组)。每组设3个重复,每个重复设2个平行。混合青贮60 d后打开青贮袋取样进行分析。结果显示:在化学成分方面,与CON组相比,青贮时组合添加乳酸菌和纤维素酶可以显著降低混合青贮饲料的中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、酸性洗涤木质素(ADL)、纤维素、半纤维素含量(P<0.05),同时显著提高粗蛋白质(CP)含量(P<0.05),其中以LAB+CE100组最高。发酵品质方面,LAB、LAB+CE50以及LAB+CE100组混合青贮饲料的pH及氨态氮(NH3-N)含量与CON组相比显著降低(P<0.05),同时乳酸和乙酸含量与CON组相比显著升高(P<0.05),且以LAB+CE100组最高;单独添加乳酸菌或组合添加乳酸菌与纤维素酶均可显著提高混合青贮饲料中乳酸菌的数量(P<0.05),并降低不良细菌数量或抑制不良细菌的增殖。在体外产气方面,随着发酵时间的延长,各组的产气量不断升高,其中LAB+CE100组的产气速率、48 h产气量最高。在体外瘤胃发酵参数方面,各组发酵液pH均在6.56~6.84,且与发酵时间呈负相关趋势;各添加剂组发酵液中总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸含量与CON组相比均显著增加(P<0.05);添加乳酸菌的各添加剂组发酵液中乙酸/丙酸比值与CON组相比显著降低(P<0.05)。由此可见,组合添加乳酸菌和纤维素酶可改善马蹄渣和玉米蛋白粉混合青贮饲料的品质和体外瘤胃发酵特性,其中以添加1×108 CFU/g乳酸菌+100 U/g纤维素酶的效果最好。

关键词： 乳酸菌; 纤维素酶; 马蹄渣; 玉米蛋白粉; 混合青贮

本文引用格式

赵超 , 陈琼 , 李越 , 郭勇庆 , 刘德武 , 孙宝丽 . 乳酸菌和纤维素酶对马蹄渣和玉米蛋白粉混合青贮饲料品质及体外瘤胃发酵特性的影响[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(5) : 3340 -3351 . DOI: 10.12418/CJAN2024.286

Abstract

The aim of this study was to evaluate the effects of different additives on the fermentation quality, chemical composition, microorganism number and in vitro rumen fermentation characteristics of mixed silage of Chinese water chestnut residue (CWCRS) and corn protein meal (CGM). The CWCRS and CGM were mixed evenly according to the ratio of 76∶24 as silage raw materials, and the following treatments were carried out during the silage process: 1) did not add lactic acid bacteria and cellulase (CON group); 2) added 1×106 CFU/g lactic acid bacteria (LAB group); 3) added 50 U/g cellulase (CE50 group ); 4) added 100 U/g cellulase (CE100 group); 5) added 1×106 CFU/g lactic acid bacteria+50 U/g cellulase (LAB+CE50 group); 6) added 1×106 CFU/g lactic acid bacteria+100 U/g cellulase (LAB+CE100 group). Each group had 3 replicates and each replicate had 2 parallel replicates. After mixed silage for 60 days, the silage bags were opened and sampled for analysis. The results showed as follows: in terms of chemical composition, addition of lactic acid bacteria combined with cellulase in silage could significantly reduce the neutral detergent fiber (NDF), acid detergent fiber (ADF), acid detergent lignin (ADL), cellulose and hemicellulose contents of mixed silage compared with the CON group (P<0.05), and significantly increase the crude protein (CP) content (P<0.05), and the highest CP content was found in LAB+CE100 group. In terms of fermentation quality, the pH, ammoniacal nitrogen (NH3-N) content of mixed silage in LAB, LAB+CE50 and LAB+CE100 groups were significantly decreased compared with the CON group (P<0.05), meanwhile, the lactic acid and acetic acid contents of mixed silage showed a significant increase compared with the CON group (P<0.05), and highest lactic acid and acetic acid contents were found in the LAB+CE100 group. Addition of lactic acid bacteria alone or combined with cellulase could significantly increase the number of lactic acid bacteria in mixed silage (P<0.05), and reduce the number of undesirable bacteria or inhibit the proliferation of undesirable bacteria. In terms of in vitro gas production, with the continuous prolongation of fermentation time, the gas production was elevated in all groups, with LAB+CE100 group having the highest gas production rate and gas production at 48 h. Regarding in vitro rumen fermentation parameters, the pH of fermentation broth of each group was between 6.56 to 6.84, and showed a negative correlation trend with fermentation time. The contents of total volatile fatty acids, acetic acid, propionic acid and butyric acid in fermentation broth in all additive groups were significantly increased compared with CON group (P<0.05), and the ratio of acetic acid/propionic acid in additive groups with lactic acid bacteria showed a significant decrease compared with the CON group (P<0.05). It can be seen that the addition of lactic acid bacteria combined with cellulase can improve the mixed silage quality and in vitro rumen fermentation characteristics, and the best effect is obtained when adding 1×108 CFU/g lactic acid bacteria+100 U/g cellulase.

Key words： lactic acid bacteria; cellulase; Chinese water chestnut residue; corn gluten meal; mixed silage

荸荠(Eleocharis tuberosa)俗称“马蹄”,是一种营养丰富、有益健康的蔬菜。荸荠在治疗咳嗽、喉咙痛和排尿困难等疾病方面的功效已得到临床认可[1]。在民间医学中,荸荠被用来治疗慢性肾炎、咽炎和肠炎等疾病[2]。除药用价值外,荸荠还是一种营养丰富的美食[3]。然而,食用荸荠的过程中会产生副产物马蹄渣(Chinese water chestnut residue,CWCRS),CWCRS经常作为废物被丢弃,导致环境污染[4-5]。但CWCRS中含有丰富的生物活性成分,如酚类、黄酮和多糖等,这些成分被公认为对健康有益[6]。这表明CWCRS具有作为天然功能性饲料的潜力。尽管CWCRS具有良好的特性,但其水分含量较高给保存带来了挑战。高水分在青贮过程中会引起不良微生物大量繁殖,对饲料发酵品质产生不利影响。前人报道,将高水分副产品与干作物混合是解决高水分青贮的一种有效方式[7]。
玉米蛋白粉(corn gluten meal,CGM)是玉米淀粉湿法加工过程中产生的一种重要副产品,其蛋白质含量较高,同时因其含有多种氨基酸而被广泛利用[8]。尽管CGM在畜牧生产中被广泛利用,但也面临着氨基酸不平衡、必需氨基酸含量低和消化率降低等挑战[9⇓⇓-12]。为了提高CGM的有效利用率,通常对其进行酶解处理,酶解处理可有效减少CGM中的抗营养因子,从而提高底物的水解度和消化率。不过,酶解也会带来一些问题,如酶解过程中会产生苦味,影响耐热性、适口性并引起肠道免疫应激等。目前,生产中一种潜力较大的替代方法是在青贮原料中混合添加菌和酶,与青贮原料中的微生物合作加快基质发酵。这种方法大大缩短了发酵时间[13],同时可将底物分解成更容易吸收的小肽。
“菌酶协同”是通过细菌和酶之间的高效协作将饲料原料分解并提高营养水平,这种协同可以改变氨基酸、大分子蛋白质和特定功能肽的组成;此外,它还能提高饲料质量和适口性,促进动物机体对营养物质的消化和吸收[14]。在饲粮中添加纤维素酶(cellulase,CE)已被证明可显著减少大肠杆菌数量,增加乳酸杆菌数量,从而减少肠道疾病,降低腹泻率[15]。CE可催化分解饲料中的纤维素,生成单糖,促进细菌蛋白质合成[16]。菌酶协同发酵可促使饲料的物理特性发生变化。益生菌在这一发酵过程中茁壮成长,产生特定的细胞外酶(如醇和酯),提高饲料质量并改善适口性。事实证明,菌酶协同发酵能有效降解或转化抗营养因子和有毒成分,减少它们对动物机体的不利影响,提高整体饲料质量。
为进一步提高CWCRS和CGM的饲料利用率,本研究以CWCRS和CGM为青贮原料,将乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)与CE相结合,采用双因素试验确定两者在CWCRS和CGM混合青贮过程中的协同效果,并对青贮饲料的化学成分、发酵品质、体外瘤胃发酵特性及微生物群落进行分析,以获得消化率更高的菌酶协同发酵产物,为菌酶协同发酵CWCRS和CGM提供技术支撑,并为CWCRS和CGM的生产加工和开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 青贮饲料调制和样品采集

CWCRS和CGM购于广东省温氏食品集团股份有限公司,LAB和CE由华南农业大学草食动物试验室提供。将CWCRS与CGM按照76∶24的比例在小型搅拌机中混合均匀,调节水分含量至70%。本试验采用双因素试验设计,共进行6个处理:青贮时不添加LAB和CE(CON组)、添加1×108 CFU/g LAB(LAB组)、添加50 U/g CE(CE50组)、添加100 U/g CE(CE100组)、添加1×108 CFU/g LAB+50 U/g CE(LAB+CE50组)以及添加1×108 CFU/g LAB+100 U/g CE(LAB+CE100组)。每组3个重复,每个重复2个平行。实际操作中,首先将各组中所需的各添加剂均充分溶解在20 mL蒸馏水中,使用小型喷壶均匀喷洒在1 kg混合青贮原料中,CON组喷洒等量的蒸馏水。随后将混合好的青贮原料置于带有单向排气阀的食品级发酵袋(350 mm×450 mm)中,使用XH-1200BL型真空包装机进行密封以保证厌氧发酵,置于配备恒温系统的青贮室[(24±3) ℃]中发酵60 d。在发酵完成后从每袋取出3份样品。第1份置于-80 ℃用于微生物群落计数,第2份用于化学成分分析和发酵品质测定,第3份则用于测定体外瘤胃发酵试验。

1.2 样品分析

1.2.1 化学成分分析

取出样品后,置于105 ℃烘箱中烘15 min,随后立即降至65 ℃干燥48 h,干燥的样品通过SWLF-600型号研磨机粉碎并过40目筛网。参考GB/T 6435—2014采用直接干燥法测定样品的干物质(DM)含量,然后按照AOAC(1990)[17]描述的方法计算干物质回收率(DMR)。使用6800型全自动凯氏定氮分析仪(Foss,瑞典)按照说明书测定样品的粗蛋白质(CP)含量。使用A200i型纤维分析仪(ANKOM,美国)按照说明书测定样品的中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)和酸性洗涤木质素(ADL)含量,随后将NDF和ADF残渣置于EL-F型马弗炉中(CARBOLITE GERO,德国)550 ℃灼烧2 h得到无灰中性洗涤纤维(NDFom)和无灰酸性洗涤纤维(ADFom)。利用ADFom与ADL的差值计算出纤维素含量,NDFom和ADFom的差值计算出半纤维素含量。样品的水溶性碳水化合物(WSC)含量采用3,5-二硝基水杨酸比色法[18]测定。

1.2.2 发酵品质分析

取混合青贮样品15 g,加入135 mL蒸馏水,4 ℃空气摇床中过夜,使用4层纱布和定性滤纸进行过滤,滤液立即使用pH计(Sartorius PB-10)测数值,随后将滤液在4℃下1 992×g离心15 min,使用0.22 μm滤膜对离心后的液体过滤,所得滤液分为3份,第1份使用Intuvo 9000气相色谱仪(安捷伦,美国)测定滤液中乙酸(AA)、丙酸(PA)和丁酸(BA)含量,第2份采用苯酚-次氯酸钠比色法[19]对氨态氮(NH3-N)含量进行测定,第3份试用高效液相色谱仪(Waters-600,日本)进行乳酸(LA)含量测定。

1.2.3 微生物计数

将混合青贮样品从-80 ℃冰箱中取出,使用平板计数法[20]对混合青贮进行微生物数量测定。首先称取10 g样品,加入90 mL灭菌蒸馏水,装入无菌聚乙烯袋中,混合均匀后使用拍打式无菌均质器拍打2 min,得到10-1稀释液;使用灭菌蒸馏水按1∶9连续稀释,制备10-1~10-9梯度稀释液,选取10-2、10-4及10-6 3个适宜梯度将稀释液涂布于培养基上,使用平板计数法计数,并根据相应稀释倍数进行换算,确定微生物数量[21]。LAB数量测定使用MRS培养基,30 ℃下厌氧恒温培养48 h;酵母菌和霉菌数量测定使用PDA培养基,30 ℃下恒温培养24 h;大肠杆菌数量测定使用BLB培养基,30 ℃下恒温培养48 h[22]。

1.3 体外瘤胃发酵试验

1.3.1 试验方法

本研究所使用的瘤胃液由温氏食品有限公司鼎湖牧场提供,并经华南农业大学食草动物实验室批准,瘤胃液供体动物的具体饲粮配方见表1。按照Menke等[23]的方案进行:首先称取0.5 g样品,在105 ℃下干燥2 h,然后装入F75过滤纤维袋中密封。在操作过程中使瘤胃液保持在39 ℃左右。制备的缓冲液需与瘤胃液温度保持一致。缓冲液与瘤胃液按2∶1的比例混合制成人工瘤胃液,并通过CO2的持续流动将温度保持在39 ℃。随后,取50 mL培养液注入含0.5 g样品的发酵瓶内,注入CO2,盖紧瓶盖,并连接到产气记录仪(Cerabar T PMP131)和Alltech记录系统。每个测试样品重复5次,并测定3个空白。发酵瓶在39 ℃下连续通气48 h,并记录0、2、4、8、12、16、24、36和48 h的产气量。
表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis)%

项目Items 含量Content
原料Ingredients
玉米Corn 13.18
麦麸Wheat bran 3.78
糖蜜Molasses 0.97
豆粕Soybean meal 3.18
干酒糟及其可溶物
Distillers dried grains with solubles		 5.74
棉籽粕Cottonseed meal 2.04
玉米纤维饲料Corn gluten feed 7.43
玉米胚芽粕Corn germ meal 4.52
预混料Premix1) 0.48
玉米青贮Corn silage 15.71
羊草Leymus chinensis 42.97
合计Total 100.00
营养水平Nutrient levels2)
泌乳净能NEL/(MJ/kg) 5.44
粗蛋白质CP 14.30
中性洗涤纤维NDF 49.20
酸性洗涤纤维ADF 3.05
钙Ca 0.60
磷P 0.40

1)每千克预混料提供 Provided the following per kg of premix:Fe 1.86 g,Cu 1.01 g,Mn 15.57 g,Zn 4.06 g,Co 9.72 mg,I 100.80 mg,Se 2.52 mg,VA 64 700 IU,VD 17 500 IU,VE 18 000 IU。

2)泌乳净能为计算值[24],其余为实测值。粗蛋白质、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量的测定参照1.2.1中方法,钙含量采用乙二胺四乙酸(EDTA)滴定法[25]测定,磷含量采用硫酸-过氧化氢消煮法[26]测定。NEL was a calculated value[24], while the others were measured values. The determination of CP, NDF and ADF referred to the methods in 1.2.1, Ca content was determined by ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) titration method[25], and P content was determined by H2SO4-H2O2 heating digestion method[26].

1.3.2 体外发酵参数的测定

体外发酵结束后,从每个样品中随机取出3个发酵瓶,取出F75过滤纤维袋,冲洗至清澈无异味,然后置于105 ℃的烘箱中4 h,直至达到恒定重量;从每个发酵瓶取20 mL发酵液放入50 mL离心管中立即测定pH,随后以3 200×g的转速离心15 min取上清液,以5∶1的比例向上清液中加入25%的偏磷酸溶液,所得溶液装在3个15 mL离心管中。第1份采用Intuvo 9000气相色谱仪测定AA、PA和BA含量,第2份采用苯酚-次氯酸钠比色法[19]测定NH3-N含量,第3份使用Waters-600高效液相色谱仪测定LA含量。最后将F75过滤纤维袋置于65 ℃烘箱中4 h,烘干后取出样品并称重。

1.3.3 体外产气量和产气参数的计算

发酵后产气量通过以下公式进行计算:
GPt=(Vt-V0)/W。
式中:GPt为发酵底物在t时刻的产气量(mL/g);Vt为发酵底物在t时间的产气量(mL/g);V0为t时间的空白发酵管产气量(mL/g);W为发酵底物的质量(g)。
产气参数根据Ørskov等[27]提出的产气模型计算:
GP=a+b(1-exp-ct)。
式中:GP表示t时间点的累积产气量(mL/g);a表示快速发酵部分产气量(mL/g);b表示慢速发酵部分产气量(mL/g);c表示产气速率(%/h)。

1.4 数据处理与分析

数据采用Excel 2019进行整理,然后用SAS 9.1中一般线性模型(GLM)程序进行处理,数据显著性检验采用Turkey’s法,以P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 青贮原料的pH、化学成分与微生物数量

CWCRS、CGM以及混合青贮原料CWCRS+CGM(76∶24)的pH、化学成分与微生物数量见表2。CWCRS、CGM以及二者以76∶24的比例混合后的pH差异不大,均在6.5左右。CWCRS和CGM在鲜物质基础下的DM含量分别为19.44%和90.52%,二者以76∶24的比例混合后DM含量为31.03%。干物质基础下,CWCRS的NDF、ADF和WSC含量均高于CGM,但CGM的CP含量远高于CWCRS,2种原料以76∶24的比例混合后营养组成得到改善,可以给LAB提供一个快速繁殖的环境。在CWCRS中检测到的LAB数量为2.19 lg(CFU/g FM),酵母菌数量为2.07 lg(CFU/g FM),大肠杆菌数量低于检测水平[<2.00 lg(CFU/g FM)],并且没有检测到霉菌。在CGM中未检测到LAB、大肠杆菌、酵母菌和霉菌。
表2 CWCRS、CGM以及混合青贮原料CWCRS+CGM(76∶24)的pH、化学成分和微生物数量

Table 2 pH, chemical composition and microorganism number of CWCRS, CGM and mixed ensiling raw material CWCRS+CGM (76∶24)

项目
Items		 马蹄渣
CWCRS		 玉米蛋白粉
CGM		 马蹄渣+玉米蛋白粉
CWCRS+CGM
pH 6.45 6.51 6.56
化学成分Chemical composition
干物质DM/% FW 19.44 90.52 31.03
粗蛋白质CP/%DM 10.38 41.29 15.06
粗脂肪EE/%DM 2.88 2.44 2.84
淀粉Starch/%DM 18.17 12.25 17.39
中性洗涤纤维NDF/%DM 47.28 21.56 43.45
酸性洗涤纤维ADF/%DM 28.32 10.87 26.00
水溶性碳水化合物WSC/%DM 8.79 2.42 7.84
微生物Microorganism/[lg(CFU/g FW)]
乳酸菌LAB 2.19 ND <2.00
大肠杆菌CB <2.00 ND <2.00
酵母菌Yeast 2.07 ND <2.00
霉菌Mold ND ND ND

ND:未检出 not detected。下表同 the same as below。

2.2 混合青贮饲料的化学成分

混合青贮60 d后,不同处理的CWCRS与CGM混合青贮饲料的化学成分如表3所示。添加LAB和CE对混合青贮饲料中DM含量无显著影响(P>0.05);添加LAB和/或CE的5个添加剂组的CP含量与CON组相比均有不同程度提高,其中单独添加或与CE组合添加LAB的组与CON组的差异均达到显著水平(P<0.05),但CE50和CE100组与CON组的差异未达到显著水平(P>0.05);与CON相比,除LAB组的NDF含量差异不显著(P>0.05)外,其余各组NDF含量均呈现极显著下降(P<0.05);ADF含量与NDF含量呈现出相同的趋势;与CON组相比,CE50、CE100和LAB+CE100组的ADL含量显著降低(P<0.05),LAB和LAB+CE50组则无显著差异(P>0.05)。CE100、LAB+CE50和LAB+CE100组的纤维素含量与CON组相比显著降低(P<0.05),但LAB、CE50组与CON组相比无显著差异(P>0.05)。除LAB组外,CE50、CE100、LAB+CE50、LAB+CE100组半纤维素含量与CON组相比均呈现出显著降低(P<0.05)。各组间WSC含量无显著差异(P>0.05)。由此可见,添加LAB和CE能有效降低CWCRS与CGM混合青贮饲料中的NDF、ADF、ADL、纤维素和半纤维素含量并提高CP含量。
表3 LAB和CE对CWCRS和CGM混合青贮饲料化学成分的影响

Table 3 Effects of LAB and CE on chemical composition of mixed silage of CWCRS and CGM

项目
Items		 组别Groups 均值
标准误
SEM		 P值P-value
CON LAB CE50 CE100 LAB+
CE50		 LAB+
CE100		 LAB CE LAB×
CE
干物质DM/% FM 30.32 30.41 30.71 30.45 30.42 32.87 0.15 0.24 0.08 0.83
粗蛋白质CP/% DM 17.06a 19.21b 18.56ab 18.59ab 19.99b 20.13b 1.58 <0.01 0.11 0.54
中性洗涤纤维NDF/% DM 38.45b 39.03ab 32.34a 31.77a 32.74a 32.21a 2.63 0.63 <0.01 0.62
酸性洗涤纤维ADF/% DM 23.58b 24.21ab 19.97a 18.96a 19.47a 18.58a 1.54 0.25 <0.01 0.53
酸性洗涤木质素ADL/% DM 4.17b 4.21b 3.43a 3.03a 3.88ab 3.27a 0.92 0.54 0.02 0.78
纤维素Cellulose/% DM 19.41b 20.00b 16.54ab 15.33a 15.59a 15.31a 1.10 0.27 <0.01 0.88
半纤维素Hemicellulose/% DM 14.87b 14.82b 12.37a 12.81a 13.27a 13.63a 0.72 0.33 0.01 0.54
水溶性碳水化合物WSC/% DM 2.34 2.18 2.16 2.17 2.02 2.01 0.22 0.17 0.08 0.83

LAB:乳酸菌效应;CE:纤维素酶效应;LAB×CE:乳酸菌与纤维素酶的交互效应。同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

LAB: lactic acid bacteria effect; CE: cellulase effect; LAB×CE: the interaction between lactic acid bacteria and cellulase. In the same row, values with different lowercase letter superscripts indicated significant difference (P<0.05), while with the same lowercase letter or no letter superscripts indicated no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.3 混合青贮饲料的发酵品质

由表4可知,单独添加LAB或组合添加LAB与CE的各组相比CON组pH均显著降低(P<0.05),其中以LAB+CE100组pH最低,说明单独添加LAB或组合添加LAB与CE都可以使混合青贮饲料中的pH快速降低,且组合添加LAB与CE在混合青贮后期可以更好地保持较低的pH状态,进而提高发酵品质。与CON组相比,LAB、CE50、CE100、LAB+CE50和LAB+CE100组的DMR均未出现显著变化(P>0.05),但在数值上均高于CON组。各添加剂组的NH3-N含量均低于CON组,除CE50组外,其余各添加剂组与CON组均呈现出显著差异(P<0.05),由此说明添加LAB或CE均有利于减少混合青贮初期蛋白质分解的趋势,降低NH3-N含量,提高混合青贮饲料的发酵品质。乳酸含量以LAB+CE100组最高,并显著高于CON组(P<0.05)。各组间AA含量差异不显著(P>0.05),但在数值上各添加剂组均高于CON组。除CE50组检测出PA外,其余各组均未检测出PA;同时,除CON组外,其余各组均未检测出BA。
表4 LAB和CE对CWCRS和CGM混合青贮饲料发酵品质的影响

Table 4 Effects of LAB and CE on fermentation quality of mixed silage of CWCRS and CGM

项目
Items		 组别Groups 均值
标准误
SEM		 P值P-value
CON LAB CE50 CE100 LAB+
CE50		 LAB+
CE100		 LAB CE LAB×
CE
干物质回收率DMR/% 96.77 97.13 97.58 97.27 97.46 97.77 0.32 0.43 0.08 0.86
pH 4.03b 3.85a 3.97ab 3.92ab 3.79a 3.78a 0.03 <0.01 0.16 0.47
氨态氮NH3-N/(mmol/L) 5.54c 3.97ab 4.55bc 4.41b 3.65a 3.27a 0.07 <0.01 0.32 0.59
乳酸LA/(mmol/L) 4.81a 6.25b 5.13ab 5.54ab 6.67b 6.84b 0.15 0.01 0.04 0.13
乙酸AA/(mmol/L) 0.81 0.92 0.87 0.88 0.94 0.96 0.09 0.05 0.22 0.77
丙酸PA/(mmol/L) 0.15 ND 0.05 ND ND ND
丁酸BA/(mmol/L) 0.11 ND ND ND ND ND

2.4 混合青贮饲料的微生物数量

由表5可知,单独添加LAB或组合添加LAB与CE的各组相比CON组LAB数量显著增加(P<0.05);CON组检测到大肠杆菌,LAB+CE100组未检测到大肠杆菌,LAB、CE50、CE100和LAB+CE50组虽然检测到大肠杆菌,但是低于检测水平[<2.00 lg(CFU/g FM)];在添加LAB的3个组均未检测到酵母菌,CON、CE50和CE100组酵母菌数量低于检测水平[<2.00 lg(CFU/g FM)];除CON组霉菌数量低于检测水平[<2.00 lg(CFU/g FM)]以外,5个添加剂组均未检测到霉菌。
表5 LAB和CE对CWCRS和CGM混合青贮饲料微生物数量的影响

Table 5 Effects of LAB and CE on microorganism number of mixed silage of CWCRS and CGMlg(CFU/g FM)

项目
Items		 组别Groups 均值
标准误
SEM		 P值P-value
CON LAB CE50 CE100 LAB+
CE50		 LAB+
CE100		 LAB CE LAB×
CE
乳酸菌LAB 7.15a 8.56b 7.77a 7.98a 8.95b 9.06b 0.71 0.03 0.46 0.87
大肠杆菌CB 2.21 <2.00 <2.00 <2.00 <2.00 ND
酵母菌Yeast 2.56 ND <2.00 <2.00 ND ND
霉菌Mold <2.00 ND ND ND ND ND

2.5 混合青贮饲料的体外发酵产气量

由表6可知,添加LAB或CE对体外产气量呈现出不同的影响。发酵2 h时,除CE50和CE100组的产气量与CON组无显著差异(P>0.05)外,其余各组的产气量均显著低于CON组(P<0.05);发酵4和8 h时的产气量与发酵2 h时呈现出相同的变化趋势;发酵12 h时,CON组的产气量均低于各添加剂组,添加LAB的各组与CON组相比呈现出显著差异(P<0.05),但单独添加CE的各组与CON组相比差异不显著(P>0.05);随发酵时间的延长,各组的产气量均逐渐上升,发酵至48 h时,单独添加LAB或CE的组均与CON组无显著差异(P>0.05),组合添加LAB和CE的LAB+CE50、LAB+CE100组与CON组相比呈现出显著差异(P<0.05),其中以LAB+CE100组的产气量最高。在产气参数方面,组合添加LAB和CE的LAB+CE50、LAB+CE100组的快速发酵部分产气量(a)和慢速发酵部分产气量(b)均较CON组显著增加(P<0.05);除CE50和CE100组外,其余添加剂组的潜在产气量(a+b)均显著高于CON组(P<0.05);各添加剂组的产气速率(c)与CON组相比均无显著差异(P>0.05)。
表6 LAB和CE对CWCRS和CGM混合青贮饲料产气量及产气参数的影响

Table 6 Effects of LAB and CE on gas production and gas production parameters of mixed silage of CWCRS and CGM

项目
Items		 组别Groups 均值
标准误
SEM		 P值P-value
CON LAB CE50 CE100 LAB+
CE50		 LAB+
CE100		 LAB CE LAB×
CE
产气量Gas production/(mL/g)
2 h 18.41a 19.41b 18.31a 18.74a 19.44b 19.61b 1.18 0.04 0.08 0.37
4 h 25.21a 27.01b 26.21a 26.32a 27.54b 28.11b 3.36 0.01 0.21 0.46
8 h 56.21a 58.94b 57.28a 57.41a 59.32b 60.21b 3.47 <0.01 0.09 0.58
12 h 65.64a 68.34b 67.25ab 67.43ab 68.88b 69.61b 2.59 <0.01 0.25 0.66
24 h 96.88a 98.57ab 100.28b 99.54ab 102.32b 103.54b 2.85 <0.01 0.36 0.87
48 h 124.21a 135.47ab 129.12ab 131.54ab 144.76b 145.24b 2.77 <0.01 0.07 0.51
产气参数Gas production parameters
a/(mL/g) 1.27a 1.82b 1.61ab 1.75b 1.87b 1.95b 0.23 0.02 0.11 0.42
b/(mL/g) 159.93a 167.87ab 159.32a 160.42a 175.70b 181.73b 1.91 0.01 0.35 0.58
a+b/(mL/g) 161.2a 169.69b 160.93a 162.17a 177.57bc 183.68c 2.04 <0.01 0.08 0.19
c/(%/h) 0.050 1 0.048 3 0.042 1 0.046 3 0.052 1 0.058 7 0.007 0 0.13 0.27 0.84

a:快速发酵部分产气量 rapidly fermentation fraction gas production;b:慢速发酵部分产气量 slowly fermentation fraction gas production;a+b:潜在产气量 potential gas production;c:产气速率 gas production rate。

2.6 混合青贮饲料的体外瘤胃发酵参数

由表7可知,各组间发酵液pH无显著差异(P>0.05);与CON组相比,各添加剂组发酵液中总挥发性脂肪酸、AA、PA、BA含量均显著增加(P<0.05),且LAB+CE100组均处在较高水平;添加LAB的各添加剂组发酵液中AA/PA比值与CON组相比显著降低(P<0.05)。
表7 LAB和CE对CWCRS和CGM混合青贮饲料体外瘤胃发酵参数的影响

Table 7 Effects of LAB and CE on in vitro rumen fermentation parameters of mixed silage of CWCRS and CGM

项目
Items		 组别Groups 均值
标准误
SEM		 P值P-value
CON LAB CE50 CE100 LAB+
CE50		 LAB+
CE100		 LAB CE LAB×
CE
pH 6.84 6.78 6.68 6.72 6.70 6.56 0.14 0.07 0.23 0.45
总挥发性脂肪酸
TVFA/(mmol/L)		 46.06a 54.36b 52.25b 52.26b 54.36b 55.47b 1.21 <0.01 0.07 0.38
乙酸AA/(mmol/L) 32.31a 36.81b 36.33b 36.01b 36.97b 37.41b 0.85 0.02 0.11 0.56
丙酸PA/(mmol/L) 11.02a 13.79b 12.46b 12.74b 13.75b 14.22c 0.62 0.03 0.41 0.83
丁酸BA/(mmol/L) 2.73a 3.76b 3.46b 3.51b 3.64b 3.84b 0.11 0.01 0.54 0.72
乙酸/丙酸AA/PA 2.93b 2.67a 2.92b 2.83b 2.69a 2.63a 0.04 0.04 0.23 0.94

3 讨论

水分是影响青贮质量的关键因素,水分含量直接影响微生物繁殖,从而对青贮质量高低产生影响[28]。在青贮中,DM含量低于30%的原料被归类为高水分青贮原料,DM含量不足会减少自由水的比例,降低发酵速度和总量,导致pH升高[29]。在本研究中,CWCRS的水分含量为80.59%。将其与CGM混合后,水分含量降至68.97%,这与之前关于青贮饲料最佳水分含量的研究结果[30]一致。Ni等[31]研究发现,要制备高质量的青贮饲料,WSC含量必须超过5%。在本试验中,CGM的WSC含量为2.42%,低于微生物对WSC的需求。然而,将CWCRS和CGM以76∶24的比例混合后,该混合青贮原料的WSC含量为7.84%,达到了制备青贮对WSC含量的要求。
pH是评价青贮饲料发酵品质的重要指标,其波动受DM、化学成分和青贮周期等因素的影响,混合青贮过程中pH的下降速率是发酵成功与否的关键。张俊丽等[32]的研究表明,添加LAB和CE可以降低干靡草青贮饲料的pH,提高青贮饲料的发酵品质。在本试验中,各添加剂组混合青贮饲料的pH均低于4.00,这表明在青贮开始时,LAB和CE的组合添加迅速增殖成为青贮中的优势菌株,抑制了不良微生物的生长;此外,pH的逐渐下降还与腐败菌活性和蛋白质水解作用的降低有关。LA是决定青贮成功与否的关键,也是青贮后期获得最佳储存的重要因素[33]。在本研究中,LA含量在60 d的青贮过程明显增加,这可能是由于厌氧发酵阶段促进了LAB的生长[34]。NH3-N的含量也会影响青贮饲料的pH,本试验中NH3-N含量较低的原因可能是兼性LAB或者异型LAB数量减少所致[35]。此外,在各添加剂组中均没有BA产生,说明混合青贮饲料的质量较高,没有腐败。青贮饲料中的酵母菌和霉菌与青贮饲料的质量息息相关。在有氧条件下,酵母菌等休眠好氧微生物可利用青贮饲料发酵产生的物质,提高青贮饲料的pH和NH3-N含量,造成DM的大量损失,导致青贮饲料变质[36]。本试验结果表明,添加LAB和CE能有效缓解青贮饲料中不良微生物的存在,赵超等[37]也得出了类似的结果,并强调了添加LAB和CE后对桑叶和豆渣青贮中酵母活性的抑制作用。
减少饲料养分和DM的损失对保存高水分饲草至关重要[38]。在本研究中,LAB和CE这2种添加剂在混合青贮饲料的DMR方面没有表现出显著差异,但在数值上都高于CON组。这表明LAB和CE有可能减轻混合青贮饲料中的DM损失。何家俊等[39]在玉米秸秆和酒糟混合青贮中加入纤维素酶,观察到青贮饲料中DM损失、NH3-N含量、pH和大肠杆菌数量均有所减少。同样,吴征敏等[40]在菠萝渣青贮中添加LAB和CE,证明可有效减少DM损失并提高发酵品质,这与本试验结果一致。WSC是青贮过程中LAB的主要能量来源,直接影响LA的产生率和含量。因此,青贮过程中WSC含量的下降是正常现象。在初始发酵阶段,较高的WSC含量有利于LAB的快速繁殖,从而导致pH迅速下降并抑制不良微生物的生长[41]。与CON组相比,5个添加剂组的WSC含量都大幅降低,这可能是由于添加了LAB和/或CE导致预发酵阶段的pH迅速降低;同时,这促进了青贮饲料中LAB的繁殖并产生大量有机酸,导致青贮60 d后WSC含量较低。微生物发酵过程会产生次级代谢产物和细菌蛋白质,从而提高青贮饲料的CP含量。本研究发现,添加LAB和CE能显著提高混合青贮饲料中的CP含量,这与万荣等[42]观察到的结果一致。ADF中的硅酸盐和ADL在反刍动物瘤胃中难以消化。NDF是细胞壁的主要成分,直接影响反刍动物的采食量。赵小雪等[43]的研究表明,在藜麦秸秆青贮中添加LAB和CE能有效降解青贮饲料中的NDF、ADF和ADL含量,本试验结果与此一致,说明LAB和CE的添加具有提高CWCRS和CGM混合青贮饲料中化学成分的潜力。
家畜瘤胃是一个由细菌、真菌、原生动物和古细菌组成的庞大而复杂的生态系统[44]。饲料经瘤胃发酵后产生的气体与营养物质消化率呈正相关。本研究表明,加入LAB和CE可显著提高混合青贮饲料的体外产气量,这意味着它们具有提高CWCRS和CGM混合青贮饲料体外瘤胃消化率的潜力[45]。挥发性脂肪酸中的AA、PA和BA能直观反映出瘤胃发酵模式。本研究发现,添加LAB和CE后,发酵液中总挥发性脂肪酸、AA、PA和BA的含量大幅增加。这种提高可能是由于添加了LAB或CE后,瘤胃中的WSC发生了降解,从而促进了挥发性脂肪酸的产生;另外,LAB和CE的组合添加也可能提高了混合青贮饲料对总产气量的影响。因此可以推断,尽管添加LAB组的总体产气量超过了添加CE组,但CE也有助于影响瘤胃发酵。通常,pH是保证瘤胃内部环境功能正常的重要因素。瘤胃中任何异常的pH偏差都会对瘤胃微生物产生重大影响[46]。在本试验中,虽然各添加剂组发酵液的pH与CON组相比没有显著差异,但都低于CON组。这表明瘤胃中的发酵环境相对稳定,添加LAB和CE能促进瘤胃微生物的生长和新陈代谢。

4 结论

本试验结果表明,LAB和CE组合添加可提高CWCRS和CGM混合青贮饲料的LA和CP含量,提升其营养价值;同时,LAB和CE组合添加还可有效改善CWCRS和CGM混合青贮饲料的体外发酵并降低不良微生物的数量。因此,LAB和CE组合添加可大幅改善CWCRS和CGM混合青贮饲料的品质,使其具有应用于奶牛生产的潜力,其中以添加1×108 CFU/g乳酸菌+100 U/g纤维素酶时效果最好。

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DOI

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