肠道健康与动物生产性能息息相关。肠道不仅是营养物质消化和吸收的主要场所,还聚集了大量的免疫细胞,是机体最大的免疫器官[1]。肠道上皮是持续与外界接触的部位之一[2],这些肠道上皮不仅要保证营养物质的消化和吸收,也时刻面临外界有害物质的威胁。为保障肠道功能和肠道上皮的完整性,肠道上皮细胞会快速更新,基本每3~5 d就会全部更新一遍[3]。因此,位于肠道基底部干细胞的增殖和分化是维持肠道功能及各种生命活动的基础。肠道干细胞(intestinal stem cells,ISCs)能快速产生转运扩增(transit amplifying,TA)细胞,TA细胞向上迁移,这个过程中伴随着增殖分化,最终形成完全分化的肠功能细胞[4]。越来越多的研究证明,肠道的健康状态直接影响动物的整体健康和生产性能[5]。为了探索肠道功能及其相关反应机制,研究过程需要可靠的模型。然而,传统模型存在显著局限性:动物试验由于种间差异、个体差异等因素影响试验结果的准确性和可重复性[6],动物伦理审查及其复杂性也会影响试验进度[7];常用的二维细胞系试验则无法对肠道的基本生理结构与功能进行模拟。肠道类器官提供了克服这些局限的潜力,能更为精准地反映细胞对外界刺激发生的功能变化[8]。自Sato等[9]利用基质胶在体外条件下构建出小鼠小肠类器官,并首次将这种起源于富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor,Lgr)5阳性的ISCs三维细胞结构定义为肠道类器官,体外三维培养便进入了新的研究纪元。目前,肠道类器官的体外培养已广泛用于个体发育和疾病建模、评价有毒或活性物质等领域。在体外模型构建时,肠道类器官分离及培养过程中所涉及的培养基成分对肠道类器官的活性有重要的影响[10]。在使用动物肠道类器官构建相关模型时,培养过程中的稳定性和可重复性仍是一个挑战。本文综述了肠道隐窝干细胞的分离方法、肠道类器官的培养以及肠道类器官在动物生产中的应用进展。
1 ISCs(隐窝)分离手段对肠道类器官活性的影响
肠道作为消化系统的重要器官,由单层柱状上皮细胞层构成的绒毛及周围数个内陷的隐窝所构成,包含数百万绒毛-隐窝结构。隐窝基底部存在着一类具有自我更新和分化能力的ISCs,这类细胞可以通过特异性表达Lgr5的分子标记物进行鉴定[11]。ISCs不仅维持着自我更新能力,还能够定向分化为各类成熟肠上皮细胞。在隐窝基底部区域,ISCs与具有分泌功能的潘氏细胞呈现规律性的间隔分布模式,共同构成维持肠道上皮稳态的关键微环境。
在肠隐窝的分离技术中,胶原酶消化法和离子螯合法作为2种经典方法具有不同作用机制:前者通过胶原酶Ⅰ对细胞外基质中富含脯氨酸的胶原纤维进行特异性酶解,破坏上皮组织的空间构象稳定性,从而实现隐窝结构的离散化并获得有活性的干细胞;后者则基于二价阳离子的螯合作用,通过移除细胞膜表面蛋白与胞外基质间结合的钙离子(Ca2+)和镁离子(Mg2+),导致细胞间连接蛋白构象改变,进而减弱细胞黏附力促进分离[13]。乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)作为二价阳离子螯合剂,通过高效结合金属离子显著提升上皮组织的解离效率[14],在类器官构建中应用广泛。但螯合剂的细胞毒性与其理化参数密切相关,具体毒性效应与试剂类型、处理浓度、作用时长及环境温度等参数呈正相关[13]。胶原酶消化法和EDTA螯合法对隐窝分离效率的影响见表1[13,15-25]。
表1 胶原酶消化法和EDTA螯合法对隐窝分离效率的影响Table 1 Effects of collagenase digestion and EDTA chelation methods on efficiency of crypt separation |
| 方法 Methods | 物种 Species | 部位 Parts | 酶种类 Enzyme types | 最佳处理条件 Optimal treatment conditions | 效果 Effects | 参考文献 References | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 胶原酶消化法 Collagenase digestion method | 胎牛 | 空肠 | 胶原酶Ⅰ | 1%、40~50 min、 25 ℃ | 成功分离且生长 状态良好 | 石亚珂[15] | |||||||
| 小鼠 | 小肠 | 胶原酶Ⅺ、 中性蛋白酶Ⅰ | 1.0和0.5 mg/L, 20~30 min,4 ℃ | 获得大量隐窝, 但后续生长受限 | 汪煜鹏[16] | ||||||||
| 鸡 | 小肠 | 胶原酶、 透明质酸酶 | 200 U/mL+100 U/mL, 30 min,37 ℃ | 成功分离 | Ghiselli等[17] | ||||||||
| 鸡 | 小肠 | 胶原酶Ⅺ、 中性蛋白酶Ⅰ | 300 U/mL和 0.1 mg/mL, 60 min,37 ℃ | 得到完整的隐窝绒毛 单位,产生大量的细胞克隆 | 裴沛等[18] | ||||||||
| 小鼠 | 结肠 | 胶原酶Ⅰ | 2 mg/mL, 30 min,37 ℃ | 类器官存活率 在80%以上 | 曾禹铭等[19] | ||||||||
| EDTA螯合法 EDTA chelation method | 小鼠 | 十二指肠、 空肠和回肠 | 不存在 种类问题 | 5 mmol/L, 10 min, 37 ℃ | 分离时间少于25 min, 提高了隐窝分离纯度和 类器官生成率 | 秦玉梅等[20] | |||||||
| 兔 | 小肠 | 10 mmol/L, 15 min,4 ℃ | 隐窝富集率、纯度较高, 形态完整,细胞活率高 | 沈雪梅等[13] | |||||||||
| 鸡 | 小肠 | 0.5 mmol/L, 20 min,4 ℃ | 快速有效地分离出结构较为 完整、活性良好的小肠隐窝 | 李剑[21] | |||||||||
EDTA螯合法 EDTA chelation method | 小鼠 | 结肠 | 3 mmol/L, 35 min,25 ℃ | 有效脱离隐窝 | Goldspink等[22] | ||||||||
| 小鼠 | 小肠 | 2.5 mmol/L, 30 min,4 ℃ | 成功完成小肠类器官的 分离培养、传代、冻存、 复苏及蛋白提取 | 郭正昌等[23] | |||||||||
| 小鼠 | 小肠 | 5 mmol/L, 5~10 min,4 ℃ | 分离的肠上皮隐窝、 绒毛细胞形态完整 | 宁宇等[24] | |||||||||
| 猪 | 空肠 | 30 mmol/L乙二胺四 乙酸(EDTA)+1 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT), 30 min,4 ℃ | 成功分离并培养 出猪空肠类器官 | Joo等[25] |
2 肠道类器官体外培养
2.1 ISCs的体内生存环境
肠道类器官的体外发育过程本质上是ISCs自我更新和定向分化,其培养体系需精确重建维持干细胞动态平衡的微环境信号网络。Wnt信号通路在培养系统中发挥核心调控功能,其生物学效应是通过与骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信号通路、Notch信号通路等发生协同或拮抗作用[26]。当肠道组织受到外界刺激,如受到局部损伤或生长因子的刺激时,细胞外的Wnt配体与细胞膜上的卷曲蛋白(frizzled protein,Frz)受体紧密结合,Wnt信号通路被激活,使得β-连环蛋白(β-catenin)在细胞质内积聚并向细胞核内迁移,进而激活一系列与细胞增殖相关的靶基因转录,为细胞增殖奠定基础[27]。与此同时,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路也被迅速唤醒,细胞外的生长因子如表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)与细胞膜上的受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)结合,激活大鼠肉瘤(rat sarcoma,Ras)蛋白,依次激活快速加速纤维肉瘤激酶(rapidly accelerated fibrosarcoma kinase,Raf)、丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)和细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)等,形成级联反应,最终将信号传递至细胞核内,磷酸化多种转录因子,进一步促进细胞增殖相关基因的表达[28]。这种协同作用使得肠道细胞能够快速响应外界刺激,启动增殖程序,确保肠道组织的及时修复与更新。
伴随子代细胞逐步朝绒毛顶端迁移,所处的微环境信号呈梯度式改变,Wnt等增殖信号强度渐次衰减,而Notch、BMP等分化诱导信号则逐步增强[29]。在此过程中,当Notch信号激活时,相邻细胞表面的Notch配体与Notch受体结合后,诱导Notch受体经历蛋白酶切加工,释放出具有转录活性的Notch胞内结构域(Notch intracellular domain,NICD),它会阻碍干细胞向分泌细胞谱系分化,引导细胞优先分化为吸收性肠上皮细胞,这些细胞紧密有序地排列在绒毛表面,摄取肠道内的养分;一旦Notch信号变弱,无调性bHLH转录因子1(Atoh1)等基因便驱使干细胞向杯状细胞、潘氏细胞等分泌细胞分化[31]。与此同时,BMP与细胞膜上的BMP受体(Ⅰ型和Ⅱ型)结合,Ⅱ型受体磷酸化Ⅰ型受体,激活的Ⅰ型受体进一步磷酸化下游的抗背腹蛋白同源物(mothers against decapentaplegic homolog,Smad)1/5/8蛋白[32]。促进其与Smad4形成异源复合体并转位至核内,调节基因表达,促进细胞分化、抑制ISCs特性,并调节肠道细胞向成熟的上皮细胞类型分化,参与肠道细胞极性的建立[33]。
2.2 体外培养添加不同物质对肠道类器官增殖和分化的影响
2.2.1 ISCs增殖相关因子对肠道类器官增殖分化的影响机制
ISCs的体外培养需兼顾营养物质供给与信号通路的动态平衡。氨基酸的添加可以保障干细胞代谢和抗氧化需求,而Wnt激活剂、生长因子及抑制剂等成分则协同模拟体内微环境,实现干细胞的定向增殖或分化。这些组分的精准配比与联用,为类器官的高效培养和疾病建模提供了分子基础。
培养基中的氨基酸含量及种类是类器官体外培养的最基本条件之一。除了维持细胞生长所必需的各种氨基酸外,常常需要在肠道类器官的培养基中额外添加不同种类的氨基酸。L-谷氨酰胺是细胞培养中常见的一种非必需氨基酸,能够为细胞提供氮源,其在细胞培养过程中不仅参与细胞的生物合成,同时也参与细胞的能量代谢过程,是细胞培养较为重要的一部分[34]。但是,L-谷氨酰胺在溶液中不稳定,GlutaMAX(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)可以减少细胞代谢过程中的氨积累,常作为L-谷氨酰胺的替代品得到较为广泛地应用。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)作为内源性抗氧化系统谷胱甘肽(glutathione,GSH)的生物合成前体,可以激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路,以此发挥对细胞增殖、分化以及凋亡等的调控作用[35]。
在满足细胞基础代谢需求的基础上,如何精准调控干细胞命运的关键信号通路,则成为目前类器官培养体系构建的重点。Wnt信号通路的精确调控是类器官增殖和分化的关键。Wnt-3A作为经典Wnt/β-catenin信号通路的配体,直接激活下游β-catenin核转位,驱动干细胞自我更新与组织特异性分化,在脂肪来源的间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)的维持中不可或缺[36]。R-Spondin家族(RSPO)1~4通过结合Lgr4/5/6受体,抑制E3泛素连接酶环指蛋白43/锌指环指蛋白3(ring finger protein 43/zinc and ring finger 3,RNF43/ZNRF3)对Wnt受体的降解,显著增强Wnt信号强度,其中hRSPO1在肠隐窝细胞增殖中表现出高特异性[37]。小分子化合物糖原合成酶激酶-3β抑制剂(CHIR99021)则通过抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)活性,阻断β-catenin的磷酸化降解,促进其核内积累并激活下游靶基因的表达[38]。值得注意的是,CHIR99021与BMP抑制剂Noggin蛋白联用可进一步解除分化抑制,形成利于类器官长期培养的微环境。
除Wnt信号通路调控外,生长因子的多维调控对类器官形态与功能重建同样至关重要。EGF通过激活PI3K/Akt和MEK/ERK信号通路,直接促进肠道上皮细胞的增殖和隐窝-绒毛结构的形态发生,其促修复特性还可缓解培养过程中的物理损伤[39]。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)家族1/2/10则通过拮抗BMP信号并协同Wnt通路,调控干细胞的命运:FGF2通过维持胚胎干细胞多能性相关基因的表达抑制分化[40];FGF1与FGF10则通过旁分泌作用支持隐窝干细胞的扩增与类器官的三维结构构建[41]。这些生长因子通过模拟体内微环境的信号,为类器官的体外培养提供分子基础。
此外,小分子抑制剂的靶向干预进一步优化了类器官培养过程中信号通路与生长因子协同作用的稳定性。Y-27632作为Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(Rho associated coiled coil containing protein kinase,ROCK)的抑制剂,可以通过和ATP竞争与催化位点的结合,以此来达到抑制ROCK1和ROCK2的效果。ROCK具有多个靶标,是Rho的下游效应器,Rho/ROCK信号通路对细胞生长、增殖以及凋亡等均具有较重要的调控作用[42]。Y-27632通过阻断ROCK介导的凋亡信号通路,降低干细胞程序性死亡发生率[43],同时通过维持Wnt/β-catenin信号通路活性增强其干性维持能力和增殖潜能[44]。
2.2.2 ISCs分化相关因子及其对肠道类器官增殖和分化的影响机制
肠道类器官的分化维持依赖于多信号通路的动态平衡,其中BMP信号通路的双向调控与前列腺素等旁分泌因子的介入,共同构成了干细胞分化调控的复杂网络。
作为转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族的一种分泌信号因子,BMP信号分子通过配体-受体相互作用激活下游信号转导级联反应,其生物学功能包括但不限于:抑制Wnt信号通路活性,增强磷酸酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)活性,进而通过β-catenin降解途径削弱Wnt信号传导强度。分泌型拮抗蛋白Noggin作为BMP信号的关键拮抗剂,其以不同的亲和力结合BMP4、BMP7等配体。这种分子拮抗作用可解除PTEN介导的β-catenin抑制效应,进而协同增强Wnt信号通路的生物学活性,最终促进干细胞的增殖与定向分化[44]。在长期培养过程中,Noggin可能通过调节Lgr5表达水平及Wnt信号传导效率来维持类器官生长[45]。
除了信号通路的精准调控外,脂类介质在干细胞微环境中的调节作用逐渐受到关注。前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)作为体内一种重要的细胞生长和细胞调节因子,具有免疫抑制和抗炎作用。近年来发现,该介质不仅参与病理性肠上皮损伤修复过程,其生理性功能也逐步被揭示。在基础培养条件下,PGE2可显著增强分泌型上皮细胞的分化潜能,并诱导类干细胞群体的增殖,这种生物学效应可能与Notch信号通路的负向调控相关[48]。然而,PGE2介导的再生修复机制在生理微环境中的具体作用模式及其信号转导路径仍待深入解析。
2.2.3 不同物种ISCs增殖分化所需相关物质及机制
相较于传统单层细胞培养系统,不同物种来源的类器官培养体系需采用差异化的关键信号分子组合。人类肠道类器官培养需添加Wnt信号配体、RSPO1及Noggin等关键调控因子,啮齿类模型需补充EGF联合Noggin和RSPO信号通路调节剂,猪源体系则需联合使用Wnt-3A、EGF、Noggin和RSPO多因子协同作用[49]。Miyoshi等[50]建立了表达Wnt-3A和RSPO3的新细胞系L-WR作为L-WRN细胞的替代物,发现在这个系统中,Noggin对于维持来自小鼠胃、小肠、盲肠和结肠的球状体超过3个月(>30代)不是必需的。Sato等[9]试验表明,对于哺乳动物肠道类器官来说,生长因子Wnt3和RSPO1通过激活Wnt途径对类器官培养物的形成、发育和维持至关重要。为了更有效地强化这一核心信号,CHIR99021和组蛋白脱乙酰酶抑制剂(丙戊酸)的组合被证明是一种有效的策略[51]。Oost等[51]使用鸡源和鼠源的Wnt3和RSPO1对鸡和鼠肠类器官培养物进行培养,得出在补充有鸡源Wnt3和RSPO1的培养基中培养的鸡肠类器官显示球状体样结构的生长,其数量增加,表明鸡类器官需要鸡源的特异性生长因子Wnt3和RSPO1才能实现最佳生长。因此,不同物种ISCs维持最佳的增殖和分化状态所需的相关物质不同,根据目前发表的文献,不同物种肠道类器官培养所需生长因子种类及适宜添加量见表2[15,40,52-54]。
表2 不同物种肠道类器官培养所需生长因子种类及适宜添加量Table 2 Types and appropriate addition amounts of growth factors required for culture of intestinal organoids of different species |
| 物种 Species | 部位 Parts | 生长因子适宜添加量 Appropriate addition amounts of growth factors | 参考文献 References |
|---|---|---|---|
| 小鼠Mouse | 结肠 | Noggin 100 ng/mL,EGF 50 ng/mL,R-Spondin 1 μg/mL,Wnt-3A 100 ng/mL,Y27632 10 μmol/L,A8301 500 nmol/L,SB202190 10 μmol/L | Sato等[52] |
| 猪Swine | 小肠 | NAC 500 mmol/L,EGF 50 μg/mL,A8301 10 mmol/L, SB202190 30 mmol/L | 吕丽蕾[53] |
| 鸡Chicken | 小肠 | EGF 25 ng/mL,R-Spondin1 250 ng/mL,Noggin 25 ng/mL,PGE2 5 μg/mL | Pierzchalska等[54] |
| 胎牛Fetal bovine | 空肠 | EGF 50 ng/mL,Wnt-3A 100 ng/mL,R-Spondin 100 ng/mL,Noggin 1 μg/mL,Y27632 10 μmol/L | 石亚珂[15] |
| 人Human | 回肠 | EGF 50 ng/mL,NAC 1 mmol/L,Noggin 100 ng/mL, R-Spondin1 1μg/mL,FGF2 50 ng/mL,IGF1 100 ng/mL | Fujii等[40] |
EGF:表皮生长因子 epidermal growth factor;Y27632:Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶抑制剂 inhibitor of Rho associated coiled coil containing protein kinase;A8301:转化生长因子-βⅠ型受体抑制剂 transforming growth factor-β type Ⅰ receptor inhibitor;SB202190:p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂 p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor;NAC:N-乙酰半胱氨酸 N-acetylcysteine;PGE2:前列腺素E2 prostaglandin E2;FGF2:成纤维细胞生长因子2 fibroblast growth factor 2;IGF1:胰岛素样生长因子1 insulin-like growth factor 1。 |
3 培养肠道类器官所用基质胶的现状
肠道类器官的体外重建不仅依赖生化信号调控,其空间结构的形成需要仿生细胞外基质的物理支撑。目前主流的培养措施是采用具有生物黏附特性的基质材料模拟天然细胞外环境,其中源于Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞分泌产物的基底膜提取物Matrigel因其富含层黏连蛋白、蛋白聚糖及内源性细胞因子,可有效支持细胞极性形成与空间排布,因而成为三维培养体系构建的核心材料[55]。然而,该材料的生物来源复杂性、成分异质性及批次稳定性缺陷,严重制约其在精准医学研究中的应用潜力[56]。为突破上述技术瓶颈,研究着力开发组分可控的新型生物支架。近年来,成分明确、性能可调的天然和合成水凝胶材料成为构建三维培养体系的研究热点[57]。
但天然水凝胶材料很难根据不同组织器官需求来定制其理化特性[62],而工程化合成材料体系展现出显著的技术优势。这类人工合成基质可通过分子设计精确调控其流变特性及化学组分,不仅能够模拟天然细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)的纤维网络拓扑结构,还可通过表面修饰减少非靶向蛋白吸附,从而有效降低免疫排斥风险[63]。在材料工程领域,基于聚乙二醇及丙烯酰胺衍生物的合成水凝胶系统经过数十年发展,已形成完善的性能调控体系[57]。例如,Rezakhani等[56]开发的聚乙二醇-多肽复合体系,通过创新交联技术优化凝胶网络稳定性,在低聚合物浓度条件下成功实现啮齿类肠道类器官隐窝结构的体外重建,其培养效率达到商业化基质水平,为无动物源培养体系的临床转化奠定了基础。
4 肠道类器官应用进展
4.1 肠道类器官可作为动物生长和营养物质吸收的研究模型
随着三维培养技术的突破性进展,肠道类器官凭借其多谱系细胞组成的生物学特性,已成为解析营养代谢机制的重要体外模型。构建基于该模型的实验平台,可用于探究营养成分的跨膜转运机制及其对肠屏障功能的干预效应[8]。鉴于肠道类器官可高度模拟体内肠道生理微环境的特性,该模型已被广泛应用于揭示营养素对ISCs行为及屏障功能的调控机制。Spence等[64]通过人多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)成功构建了具有肠上皮特征的三维培养体系,该系统不仅重现了肠黏膜形态发生过程,更通过基因编辑技术证实神经源素3(neurog3)作为关键转录因子调控肠内分泌细胞谱系特化。Yin等[65]使用肠道类器官探究铜在断奶仔猪中的应用,发现10 μmol/L五水合硫酸铜(CuSO4·5H2O)可促进断奶仔猪肠道类器官的增殖,进而改善断奶仔猪肠道形态,降低仔猪腹泻。Zhou等[66]发现,来自植物乳杆菌NCU116的胞外多糖可通过调节ISCs的增殖和分化以及改变结肠炎小鼠肠道微生物群来促进肠道内稳态,触发肠上皮再生以从肠损伤中恢复。Wang等[67]利用人小肠类器官模型,结合转录组和代谢组学分析,揭示了婴儿配方奶粉和母乳处理下类器官在基因表达谱和代谢谱上的显著差异,显示了两者对小肠类器官生长发育的不同影响。Hou等[68]研究表明,L-精氨酸处理可缓解葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的小鼠结肠炎损伤,其机制包括维持ISCs增殖和稳定潘氏细胞数量。体外小鼠肠道类器官试验进一步证实,L-精氨酸能增强干细胞的隐窝形成能力。
4.2 肠道类器官可作为宿主-微生物互作的研究模型
结肠类器官系统在药物安全性评价中展现出独特优势。雷颖等[69]通过将5种细胞毒性药物作用于啮齿动物结肠三维培养体系,建立了化疗相关性腹泻的体外预测模型,为临床化疗方案的优化提供了重要参考。此外,肠道类器官也在病原体-宿主互作研究中有较多应用,Krüger等[70]利用该体系揭示了严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)主要靶向肠上皮非杯状细胞亚群,通过破坏细胞超微结构导致屏障功能障碍,这为解释新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)消化道症状提供了分子依据。Alfajaro等[71]研究阐明了牛轮状病毒G6P[5]WC3及其疫苗株单重排G4P[5]的VP8*结构域能双重识别唾液酸(α2,6-连接型)和α半乳糖苷(αGal)表位,并利用分化的牛小肠类器官和人类小肠类器官进行感染试验,发现病毒仍能在其中有效复制,这为其潜在的跨物种传播提供了试验依据。Pierzchalska等[72]利用鸡胚肠道类器官与嗜酸乳杆菌LA-5共培养模型发现嗜酸乳杆菌LA-5通过激活前列腺素PGE2/前列腺素D2(PGD2)分泌(较对照组倍增)并协同肌成纤维细胞旁分泌作用,显著促进肠上皮类器官生长和再生。食品添加剂毒性评估研究也证实了类器官系统可灵敏检测日落黄等物质对小肠吸收功能的损伤效用[73]。
4.3 肠道类器官可作为揭示肿瘤发生机制的研究模型
相较于传统二维单层培养系统,肿瘤类器官在保留原发肿瘤异质性和分子特征方面具有显著优势,使其成为个体化治疗决策的理想工具[74]。自Sato等[52]首次建立结直肠肿瘤三维培养体系以来,该技术已实现从药敏预测到耐药机制解析的全链条应用。Yao等[75]证实,结直肠癌类器官对放化疗的体外反应谱与临床疗效呈现高度一致性。李亮[76]通过体外培养肠癌类器官,并结合泛素样含PHD和无名指结构域2(Uhrf2)基因编辑试验证实,该表观调控因子通过影响肿瘤干细胞的稳态调控恶性进展。Dekkers等[77]研究了在药物开发领域中,囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)靶向药物在类器官模型中的疗效验证。Lorenzi等[78]利用5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)对突变肿瘤抑制基因的肠道类器官耐药机制进行了解析。
5 小结与展望
肠道类器官作为一种新兴的体外模型,在研究营养物质吸收和肠道健康方面具有重要潜力。然而,现有技术体系仍面临多维度挑战。例如,肠道类器官尚未完全模拟消化过程中的复杂生理环境,因此无法直接进行消化试验的验证;目前,大多数肠道类器官培养过于依赖基质胶,由于基质胶价格高昂,肠道类器官无法大规模培养;禽类肠道类器官特异性生长因子商业化程度不够;肠道类器官因品种、日龄等问题批次稳定性有待提高。微生物互作方面虽能通过显微注射实现共培养,但操作复杂且难以还原体内微生物群落结构,缺乏动态评估体系。随着肠道类器官培养技术的不断完善,未来有望实现耦合肠芯片与人工消化系统,模拟出全流程营养物质消化过程;对于应用推广程度不足的基质胶替代品的开发,未来的研究将更多的聚焦于价格低廉的合成水凝胶以降低生产成本;此外,借助基因编辑、生物工程等技术使禽源或猪源等特异性细胞因子的商业化成为可能,并实现规模化生产,助力饲用动物肠道类器官的培养和应用;未来可借助力学调控、智能监控等技术提升肠道类器官批次的稳定性,使其成为研究肠道健康和疾病机制的有力工具。
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