动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 12: 8594 - 8607

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.700

研究论文

白藜芦醇通过核因子E2相关因子2信号通路缓解热应激诱导的肉鸡骨骼肌细胞氧化损伤

  • 吴琼 ,
  • 陈凯凯 ,
  • 原培强 ,
  • 丁小玲 ,
  • 陈兴勇 ,
  • 张成 , *
展开
  • 安徽农业大学动物科技学院, 合肥 230036
* 张 成,教授,博士生导师,E-mail:

吴 琼(1998—),女,安徽枞阳人,硕士研究生,动物营养与饲料科学专业。E-mail:

收稿日期: 2025-04-29

  网络出版日期: 2025-12-13

基金资助

安徽省自然科学基金项目(2208085MC73)

安徽省高等学校科学研究项目(2022AH050900)

茶树生物学与资源利用国家重点实验室开发基金项目(SKLTOF20220109)

收起

Resveratrol Alleviates Oxidative Damage of Skeletal Muscle Cells in Broilers Induced by Heat Stress through Nuclear Factor E2-Related Factor 2 Signaling Pathway

  • WU Qiong ,
  • CHEN Kaikai ,
  • YUAN Peiqiang ,
  • DING Xiaoling ,
  • CHEN Xingyong ,
  • ZHANG Cheng , *
Expand
  • College of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China
* professor, E-mail:

Received date: 2025-04-29

  Online published: 2025-12-13

Fold

摘要

本试验旨在探究白藜芦醇介导核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路缓解热应激诱导骨骼肌细胞氧化损伤。试验选取11日龄肉鸡鸡胚的胸部肌肉进行分离,培养原代骨骼肌细胞。通过不同温度(37.0、39.5、42.0、44.5和47.0 ℃)和不同浓度的白藜芦醇(0、12.5、25.0、50.0和100.0 μmol/L)处理骨骼肌细胞,以筛选热应激的温度和白藜芦醇的处理浓度。将骨骼肌细胞随机分为对照处理(在39.5 ℃下培养24 h)、白藜芦醇处理(在39.5 ℃下,使用25.0 μmol/L白藜芦醇处理24 h)、热应激处理(先于39.5 ℃下培养23 h,随后转移至44.5 ℃热应激处理1 h)和白藜芦醇+热应激处理(在39.5 ℃下,使用25.0 μmol/L白藜芦醇处理23 h,并在44.5 ℃下继续热应激1 h);后续使用Nrf2激活剂(t-BHQ,50.0 μmol/L)或Nrf2抑制剂(ML385,5.0 μmol/L)处理骨骼肌细胞24 h(39.5 ℃),或先处理23 h(39.5 ℃)后再与热应激(44.5 ℃)进行联合处理1 h,收集细胞样品,检测细胞内抗氧化酶活性、丙二醛(MDA)、蛋白质羰基(PC)和活性氧(ROS)的含量以及Nrf2信号通路相关基因和蛋白表达。结果表明:1)与37.0 ℃相比,39.5 ℃显著提高骨骼肌细胞活力(P<0.05);与39.5 ℃相比,44.5 ℃热应激处理显著降低骨骼肌细胞活力、谷胱甘肽(GSH)含量、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)(P<0.05),显著增加细胞MDA、ROS和PC含量(P<0.05)。2)与0 μmol/L白藜芦醇相比,25.0 μmol/L白藜芦醇显著降低骨骼肌细胞MDA、ROS和PC含量(P<0.05),显著提高细胞GSH含量、T-SOD和过氧化氢酶(CAT)活性以及Nrf2、血红素加氧酶-1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)和超氧化物歧化酶2(SOD2)mRNA相对表达量(P<0.05)。3)与对照处理相比,热应激显著增加骨骼肌细胞MDA、ROS和PC含量(P<0.05),显著降低细胞活力以及细胞T-AOC、T-SOD和CAT活性以及Nrf2核蛋白、Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平(P<0.05);与热应激处理相比,添加25.0 μmol/L白藜芦醇显著降低骨骼肌细胞MDA、ROS和PC含量(P<0.05),显著增加细胞T-AOC和CAT活性以及Nrf2核蛋白、Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平(P<0.05)。4)与热应激处理相比,热应激与t-BHQ联合处理显著降低骨骼肌细胞MDA、ROS和PC含量(P<0.05),显著增加细胞T-AOC、T-SOD和CAT活性以及Nrf2核蛋白、Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平(P<0.05)。5)与热应激处理相比,ML385、白藜芦醇和热应激三者联合处理显著增加骨骼肌细胞MDA、ROS和PC含量(P<0.05),显著降低细胞T-AOC、T-SOD和CAT活性以及Nrf2核蛋白、Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平(P<0.05)。综上所述,白藜芦醇能够缓解热应激诱导骨骼肌细胞氧化损伤,其作用机制与激活Nrf2信号通路有关。

关键词： 白藜芦醇; 热应激; 骨骼肌细胞; 氧化应激

本文引用格式

吴琼 , 陈凯凯 , 原培强 , 丁小玲 , 陈兴勇 , 张成 . 白藜芦醇通过核因子E2相关因子2信号通路缓解热应激诱导的肉鸡骨骼肌细胞氧化损伤[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(12) : 8594 -8607 . DOI: 10.12418/CJAN2025.700

Abstract

The aim of this experiment was to investigate the resveratrol-mediated nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) signaling pathway to alleviate heat stress-induced oxidative damage in skeletal muscle cells. Thoracic muscles of 11-day-old broiler chicken embryos were selected for isolation and culture of primary skeletal muscle cells. Skeletal muscle cells were treated with different temperatures (37.0, 39.5, 42.0, 44.5, and 47.0 ℃) and different concentrations of resveratrol (0, 12.5, 25.0, 50.0, and 100.0 μmol/L) to screen the temperatures of heat stress and treatment concentrations of resveratrol. Skeletal muscle cells were randomly assigned to the following treatments: control (cultured at 39.5 ℃ for 24 h), resveratrol treatment (treated with 25.0 μmol/L resveratrol at 39.5 ℃ for 24 h), heat stress treatment (cultured at 39.5 ℃ for 23 h, followed by transfer to 44.5 ℃ for 1 h heat stress) and resveratrol+heat stress treatment (cells cultured at 39.5 ℃ with 25.0 μmol/L resveratrol for 23 h, followed by continued heat stress at 44.5 ℃ for 1 h). Subsequently, skeletal muscle cells were treated with the Nrf2 activator t-BHQ (50.0 μmol/L) or the inhibitor ML385 (5.0 μmol/L) for 24 h (39.5 ℃), or pretreated for 23 h (39.5 ℃) followed by combined treatment with heat stress (44.5 ℃) for 1 h, and cell samples were collected to detect intracellular antioxidant enzyme activities, malondialdehyde (MDA), protein carbonyls (PC), and reactive oxygen species (ROS) contents, as well as the expression of genes and proteins related to the Nrf2 signaling pathway. The results showed as follows: 1) compared with 37.0 ℃, 39.5 ℃ significantly increased the viability of skeletal muscle cells (P<0.05); compared with 39.5 ℃, 44.5 ℃ heat stress treatment significantly decreased the viability, glutathione (GSH) content, total superoxide dismutase (T-SOD) activity, and total antioxidant capacity (T-AOC) of skeletal muscle cells (P<0.05), and significantly increased the MDA, ROS and PC contents (P<0.05). 2) Compared with 0 μmol/L resveratrol, 25.0 μmol/L resveratrol significantly decreased the content of MDA, ROS and PC in skeletal muscle cells (P<0.05), and significantly increased the content of GSH, the activities of T-SOD and catalase (CAT), as well as the Nrf2, heme oxygenase-1 (HO-1), quinone oxidoreductase 1 (NQO1) and superoxide dismutase 2 (SOD2) mRNA relative expression levels (P<0.05). 3) Compared with the control treatment, heat stress significantly increased the contents of MDA, ROS, and PC in skeletal muscle cells (P<0.05), and significantly decreased cell viability as well as T-AOC, T-SOD, and CAT activities as well as the expression levels of Nrf2 nucleoprotein (nucl-Nrf2), Nrf2, HO-1, and NQO1 protein (P<0.05); compared with heat stress treatment, the addition of 25.0 μmol/L resveratrol significantly decreased the contents of MDA, ROS and PC in skeletal muscle cells (P<0.05), and significantly increased T-AOC and CAT activity, as well as the expression levels of nucl-Nrf2, Nrf2, HO-1, and NQO1 protein (P<0.05). 4) Compared with heat stress treatment, the combination of heat stress and t-BHQ treatment significantly decreased the contents of MDA, ROS and PC in skeletal muscle cells (P<0.05), and significantly increased T-AOC and the activities of T-SOD and CAT, as well as the expression levels of nucl-Nrf2, Nrf2, HO-1 and NQO1 protein (P<0.05). 5) Compared with heat stress treatment, the combined treatment of ML385, resveratrol and heat stress significantly increased the contents of MDA, ROS and PC in skeletal muscle cells (P<0.05), and significantly decreased T-AOC and the activities of T-SOD and CAT as well as the expression levels of nucl-Nrf2, Nrf2, HO-1 and NQO1 protein (P<0.05). In summary, resveratrol can alleviate heat stress-induced oxidative damage in skeletal muscle cells, and its mechanism of action is related to the activation of the Nrf2 signaling pathway.

Key words： resveratrol; heat stress; skeletal muscle cells; oxidative stress

随着全球气温的上升,高温环境对集约化养殖中的畜禽健康构成挑战,尤其是肉鸡因缺乏汗腺对热应激尤为敏感。高温影响肉鸡体温调节,损害其健康和生产性能[1]。肌肉是人类摄取优质蛋白质、脂肪以及多种必需微量元素等营养成分的主要来源。随着人们生活品质的不断提高,消费者对肉类的品质与营养愈发重视。然而,热应激会降低肌肉产量和品质,从而危害动物的健康和造成巨大的经济损失[2]。研究表明,热应激通过削弱肌肉的抗氧化能力、引发机体氧化应激,最终导致肉鸡肌肉损伤[1-3]。因此,缓解肌肉氧化损伤,对改善肉鸡生产性能和肌肉品质具有重要意义。
白藜芦醇是一种广泛存在于葡萄、浆果、花生和其他植物中的天然多酚,具有抗氧化[4]、抗炎[5]和抗癌[6]等多种生物活性。研究表明,白藜芦醇可提高过氧化氢诱导的牛骨骼肌细胞抗氧化能力,并增强血红素加氧酶-1(HO-1)表达,从而减轻氧化损伤[7]。本课题组前期研究发现,白藜芦醇可改善肉品质,提高热应激肉鸡的抗氧化能力,但其作用机制尚不明确[1]。
核因子E2相关因子(Nrf2)信号通路作为细胞核心抗氧化防御体系,可有效抵御氧化损伤、炎症反应及细胞凋亡[8]。Ding等[4]研究表明,白藜芦醇通过上调Nrf2和HO-1基因和蛋白表达来发挥其抗氧化作用,从而减轻慢性热应激引起的肉鸡肝脏氧化损伤。Lu等[9]试验表明,白藜芦醇可上调Nrf2、HO-1和醌氧化还原酶1(NQO1)的mRNA表达来减轻热应激引起的肉鸡肺脏损伤。尽管现有研究已证实白藜芦醇在畜禽抗氧化领域具有潜在应用价值,但针对其在热应激条件下通过Nrf2/抗氧化反应元件(ARE)信号轴调控肉鸡骨骼肌细胞氧化还原稳态的分子机制仍缺乏系统性研究。因此,本试验采用热应激构建骨骼肌细胞氧化损伤模型,探究白藜芦醇通过Nrf2信号通路对热应激诱导的骨骼肌细胞氧化损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

主要试剂包括胶原酶Ⅰ型(C0130,美国Sigma公司)、DMEM高糖培养基(D5796,美国Sigma公司)、胎牛血清(FB25015,美国Clark公司)、青霉素-链霉素溶液(BL505A,北京白鲨生物公司)、0.25%胰蛋白酶溶液(SH30042.01,美国Hyclone公司)、马血清(SH30074.03,美国Hyclone公司)、CCK-8试剂(BL1055B,北京白鲨生物公司)、二甲基亚砜(DMSO,67-68-5,美国Sigma公司)、核蛋白提取试剂盒(R0050,北京索莱宝科技有限公司)、RNAiso Plus(9108,日本TaKaRa公司)、cDNA第1链合成试剂盒(RK20400,武汉爱博泰克生物公司)、2×SYBR Green快速qPCR混合液(RK21203,武汉爱博泰克生物公司)。
丙二醛(MDA,A003-1-2)、蛋白质羰基(PC,A087-1-2)、活性氧(ROS,E004-1)、总超氧化物歧化酶(T-SOD,A001-3-2)、总抗氧化能力(T-AOC,A015-2-1)、谷胱甘肽(GSH,A006-2-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px,A005)、过氧化氢酶(CAT,A007-1-1)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;抗体组蛋白H3(Histone H3,GB11026)、Nrf2(GB115673)、HO-1(GB15549)、醌氧化还原酶1(NQO1,GB11282)和β-肌动蛋白(GB15001)均购自武汉赛维尔生物科技有限公司;Nrf2激活剂特丁基对苯二酚(t-BHQ,HY-100489)和Nrf2抑制剂(ML385,HY-100523)均购自美国Med Chem Express公司。

1.2 试剂配制

增殖培养基:DMEM高糖培养基中添加20%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合液。
分化培养基:DMEM高糖培养基中添加2%马血清、1%青霉素-链霉素混合液。
白藜芦醇母液(100 mmol/L):22.824 mg白藜芦醇干粉溶于1 mL DMSO中,-80 ℃可储存6个月,-20 ℃可储存1个月。

1.3 试验方法

1.3.1 原代成肌细胞分离培养

本课题组前期已完成成肌细胞的分离培养,并成功诱导其分化为骨骼肌细胞。经鉴定,分化细胞已具备成熟细胞特性,满足后续试验要求。且成肌细胞在39.5 ℃、5% CO2培养条件下增殖活性显著增强[10]。基于此,本试验对照处理将成肌细胞培养温度设定为39.5 ℃。

1.3.2 热应激模型的构建及细胞处理

热应激模型:骨骼肌细胞诱导分化72 h后,将细胞培养器皿分别置于预热温度为37.0、39.5、42.0、44.5、47.0 ℃的恒温水浴锅中,水浴处理1 h,收集样品,进行后续试验。
白藜芦醇处理:骨骼肌细胞诱导分化48 h后,更换不同浓度(0、12.5、25.0、50.0和100.0 μmol/L)白藜芦醇的分化培养基,继续培养24 h后,收集样品进行后续试验。
白藜芦醇和热应激共处理:骨骼肌细胞经25.0 μmol/L白藜芦醇处理23 h,再放入44.5 ℃热应激环境下处理1 h后,收集细胞样品进行后续试验。
t-BHQ或ML385处理:骨骼肌细胞诱导分化48 h后,更换含50.0 μmol/L t-BHQ或5.0 μmol/L ML385的分化培养基,继续细胞培养24 h,收集样品。
t-BHQ和热应激共处理或ML385和热应激共处理:骨骼肌细胞先经50.0 μmol/L t-BHQ或5.0 μmol/L ML385处理23 h,再经1 h的热应激处理后,收集样品,进行后续试验。
白藜芦醇、热应激和ML385共处理:骨骼肌细胞先经5.0 μmol/L ML385和25.0 μmol/L白藜芦醇处理23 h,再经1 h的热应激处理后,收集样品,进行后续试验。

1.3.3 细胞活力检测

将成肌细胞接种在96孔板中培养,在37.0 ℃和5% CO2条件下培养,增殖至80%左右,诱导分化为骨骼肌细胞,骨骼肌细胞经指定处理后,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次,每孔加入100 μL分化培养基和10 μL CCK-8溶液,放置细胞培养箱中孵育2 h后,酶标仪在450 nm处测量吸光度(OD),以仅含CCK-8溶液和分化培养基的孔为空白孔,计算细胞活力,计算公式如下:
细胞活力(%)=[OD(处理细胞)-OD(空白细胞)]/[OD(对照细胞)-OD(空白细胞)]×100。

1.3.4 细胞ROS含量检测

按1∶1 000体积比用无血清培养基配制DCFH-DA探针ROS工作液,弃去细胞器皿中的分化培养基后加入ROS工作液培养1 h,经PBS洗涤2次后刮取细胞,PBS重悬并吹打成单细胞悬液,调整细胞密度后转移至酶标板,于500 nm激发波长或525 nm发射波长检测荧光值。

1.3.5 抗氧化指标检测

骨骼肌细胞经指定处理后,刮取细胞,收集细胞沉淀,采用超声细胞破碎仪破碎细胞,测定蛋白浓度。最后根据南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书,测定细胞MDA、PC和GSH含量及T-AOC、CAT和T-SOD活性。

1.3.6 抗氧化相关基因表达检测

骨骼肌细胞诱导分化3 d后弃培养基,PBS洗涤2次。通过Trizol裂解法提取总RNA,并检测其浓度和纯度,检测合格后用于后续试验。根据逆转录试剂盒说明书合成cDNA,并置于-20 ℃保存备用。PCR反应程序如下:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,40个循环。引物由通用生物有限公司合成,以β-肌动蛋白为内参基因,使用2-△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达量。引物序列见表1。
表1 引物序列

Table 1 Primer sequence

基因
Genes		 引物序列
Primer sequence (5'—3')		 产物大小
Product size/bp		 登录号
Accession number
核因子E2相关因子2
Nrf2		 F:TTCGCAGAGCACAGATACTTC
R:TGGGTGGCTGAGTTTGATTAG		 188 NM_205117.1
血红素加氧酶-1
HO-1		 F:TGTCCCTCCACGAGTTCAAG
R:CTCCAGTTGCTGCCATAGAA		 181 NM_205344.1
醌氧化还原酶1
NQO1		 F:CTCCGAGTGCTTTGTCTACGA
R:ATGGCTGGCATCTCAAACC		 150 NM_001277619.1
Kelch样ECH相关蛋白1
Keap1		 F:CTGCTGGAGTTCGCCTACAC
R:CACGCTGTCGATCTGGTACA		 96 XM_025145847.1
超氧化物歧化酶1
SOD1		 F:GGAGTGGCAGAAGTAGAAATAGAAG
R:AGGTCCAGCATTTCCAGTTAG		 150 NM_205064.1
超氧化物歧化酶2
SOD2		 F:CGTGACTTTGGTTCCTTCGC
R:TCTTGATTTGCACAGGCTGC		 137 NM_204211.1
过氧化氢酶
CAT		 F:GGCGTATGACCCTAGCAACA
R:TCTGATAATTGGCCACGCGA		 167 NM_001031215.2
谷胱甘肽过氧化物酶
GSH-Px		 F:ACGGCGCATCTTCCAAAG
R:TGTTCCCCCAACCATTTCTC		 73 NM_001277853.2
β-肌动蛋白
β-actin		 F:TGATATTGCTGCGCTCGTTG
R:AACCATCACACCCTGATGTCTG		 127 NM_205518.1

1.3.7 抗氧化相关蛋白表达检测

细胞经指定处理后用PBS洗涤2~3次并弃之,随后加入含苯甲磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀测定(RIPA)裂解液裂解3~5 min,刮取裂解物至离心管,冰浴30 min(间歇吹打),4 ℃、12 000×g离心5 min,取上清得总蛋白。核蛋白按试剂盒说明书提取。使用BCA法测蛋白浓度,浓度过低则冻干浓缩,过高用dd H2O稀释至均一浓度,按4∶1加5×上样缓冲液,95 ℃变性5 min,4 ℃暂存或-80 ℃长期保存。按照说明书要求配制不同浓度的分离胶进行电泳,转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,一抗孵育过夜,次日相应标记二抗孵育1 h,通过凝胶成像系统曝光获取信号。

1.4 数据统计分析

数据采用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析,组间采用Duncan氏法进行多重比较。试验结果以“平均值±标准误”表示,P<0.05表示显著差异。

2 结果与分析

2.1 不同温度处理对肉鸡骨骼肌细胞活力及抗氧化能力的影响

如图1所示,与39.5 ℃相比,37.0、42.0、44.5和47.0 ℃均显著降低细胞活力(P<0.05)。而骨骼肌细胞经47.0 ℃处理后,细胞大面积死亡。因此,后续试验未选择47.0 ℃。
图1 不同温度处理对骨骼肌细胞活力及抗氧化能力的影响

数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。下图同。

Fig.1 Effects of different temperature treatments on viability and antioxidant capacity of skeletal muscle cells (n=3)

Data columns labelled with different lowercase letters indicated significant difference (P<0.05), while identical letters denoted no significant difference (P>0.05). The same as below.

与39.5 ℃相比,37.0 ℃显著增加骨骼肌细胞MDA、ROS和PC含量(P<0.05),显著降低T-SOD活性(P<0.05);42.0 ℃显著增加细胞ROS含量(P<0.05),显著降低GSH含量以及T-SOD活性和T-AOC(P<0.05);44.5 ℃显著提高细胞MDA、ROS和PC含量(P<0.05),显著降低GSH含量以及T-SOD活性和T-AOC(P<0.05)。以上结果表明,44.5 ℃显著诱导骨骼肌细胞发生氧化应激,因此,后续试验采用44.5 ℃作为热应激的处理温度。

2.2 不同浓度白藜芦醇处理对肉鸡骨骼肌细胞活力及抗氧化能力的影响

如图2所示,与0 μmol/L白藜芦醇相比,100.0 μmol/L白藜芦醇显著降低骨骼肌细胞活力(P<0.05),其他处理细胞活力均无显著差异(P>0.05)。因此,后续试验采用50.0 μmol/L浓度以内的白藜芦醇处理细胞。
图2 不同浓度白藜芦醇处理对骨骼肌细胞活力及抗氧化能力的影响

Fig.2 Effects of different concentrations of resveratrol treatment on viability and antioxidant capacity of skeletal muscle cells (n=3)

与0 μmol/L白藜芦醇相比,12.5 μmol/L白藜芦醇显著降低骨骼肌细胞PC含量(P<0.05),显著增加细胞GSH含量和T-SOD活性(P<0.05);25.0 μmol/L白藜芦醇显著降低骨骼肌细胞MDA、ROS和PC含量(P<0.05),显著增加细胞GSH含量以及T-SOD和CAT活性(P<0.05);50.0 μmol/L白藜芦醇显著降低骨骼肌细胞MDA、ROS和PC含量(P<0.05),显著增加细胞GSH含量以及T-SOD和CAT活性(P<0.05)。由此可知,白藜芦醇可提高正常条件下骨骼肌细胞的抗氧化能力。

2.3 不同浓度白藜芦醇处理对骨骼肌细胞Nrf2信号通路相关基因表达的影响

如表2所示,与0 μmol/L白藜芦醇相比,25.0 μmol/L白藜芦醇显著提高骨骼肌细胞Nrf2、HO-1、NQO1和SOD2 mRNA相对表达量(P<0.05);50.0 μmol/L白藜芦醇显著提高骨骼肌细胞Nrf2、HO-1、NQO1和SOD2的mRNA相对表达量(P<0.05)。综合上述结果,后续试验以25.0 μmol/L作为白藜芦醇处理浓度。
表2 不同浓度白藜芦醇处理对骨骼肌细胞Nrf2信号通路相关基因表达的影响

Table 2 Effects of different concentrations of resveratrol treatment on expression of genes related to Nrf2 signaling pathway of skeletal muscle cells (n=3)

项目
Items		 白藜芦醇浓度Concentrations of resveratrol/(μmol/L) P值
P-value
0 12.5 25.0 50.0
核因子E2相关因子2 Nrf2 1.00±0.03b 0.99±0.10b 2.05±0.13a 1.84±0.16a <0.001
血红素加氧酶-1 HO-1 1.00±0.31b 1.05±0.07b 4.08±0.24a 3.43±0.25a <0.001
醌氧化还原酶1 NQO1 1.00±0.10b 1.08±0.20b 2.53±0.21a 2.46±0.40a 0.003
Ketch样ECH相关蛋白1 Keap1 1.00±0.13 0.75±0.12 0.95±0.06 1.03±0.07 0.281
过氧化氢酶CAT 1.00±0.14 1.24±0.09 1.71±0.34 1.99±0.30 0.075
谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px 1.00±0.11 1.03±0.15 1.14±0.05 1.21±0.13 0.576
超氧化物歧化酶1 SOD1 1.00±0.06 1.01±0.07 1.29±0.21 1.27±0.09 0.260
超氧化物歧化酶2 SOD2 1.00±0.09b 1.06±0.02b 3.38±0.25a 3.61±0.20a <0.001

2.4 白藜芦醇对热应激条件下肉鸡骨骼肌细胞活力及抗氧化能力的影响

如图3所示,与对照处理相比,热应激显著增加骨骼肌细胞MDA、ROS和PC含量(P<0.05),显著降低细胞活力以及T-AOC、T-SOD和CAT活性(P<0.05);而添加白藜芦醇之后显著降低MDA、ROS和PC含量(P<0.05),显著提高细胞活力以及T-AOC和CAT的活性(P<0.05)。以上结果表明,热应激降低骨骼肌细胞活力及抗氧化能力,而白藜芦醇可逆转此变化。
图3 白藜芦醇对热应激骨骼肌细胞活力及抗氧化能力的影响

RES:白藜芦醇resveratrol;HS:热应激 heat stress。

Fig.3 Effects of resveratrol on viability and antioxidant capacity of heat-stressed skeletal muscle cells (n=3)

2.5 白藜芦醇对热应激条件下肉鸡骨骼肌细胞Nrf2信号通路相关基因表达的影响

如表3所示,与对照处理相比,单独添加白藜芦醇显著增加骨骼肌细胞Nrf2、HO-1、NQO1、CAT和SOD2 mRNA相对表达量(P<0.05)。与热应激处理相比,白藜芦醇和热应激共处理显著增加HO-1、NQO1、CAT和SOD2 mRNA相对表达量(P<0.05)。
表3 白藜芦醇对热应激骨骼肌细胞Nrf2信号通路相关基因表达的影响

Table 3 Effects of resveratrol on expression of Nrf2 signaling pathway-related genes of heat-stressed skeletal muscle cells (n=3)

项目
Items		 白藜芦醇浓度Concentrations of resveratrol/(μmol/L) P值
P-value
0 25.5
39.5 ℃ 44.5 ℃ 39.5 ℃ 44.5 ℃
核因子E2相关因子2 Nrf2 1.00±0.12b 0.72±0.05b 2.14±0.43a 1.12±0.13b 0.012
血红素加氧酶-1 HO-1 1.00±0.08c 0.67±0.03c 1.59±0.08b 3.42±0.31a <0.001
醌氧化还原酶1 NQO1 1.00±0.07b 0.88±0.09b 2.68±0.31a 2.37±0.08a <0.001
Ketch样ECH相关蛋白1 Keap1 1.00±0.18 1.12±0.11 1.01±0.16 0.97±0.20 0.884
过氧化氢酶CAT 1.00±0.14bc 0.65±0.08c 1.93±0.14a 1.36±0.12b <0.001
谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px 1.00±0.06 1.14±0.09 1.07±0.15 1.17±0.14 0.728
超氧化物歧化酶1 SOD1 1.00±0.04 0.85±0.06 1.42±0.18 1.34±0.19 0.052
超氧化物歧化酶2 SOD2 1.00±0.22c 0.79±0.06c 3.32±0.64b 5.45±0.72a <0.001

2.6 白藜芦醇对热应激条件下肉鸡骨骼肌细胞Nrf2信号通路相关蛋白表达的影响

如图4所示,与对照处理相比,热应激显著降低骨骼肌细胞Nrf2核蛋白以及Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平(P<0.05);而添加白藜芦醇之后显著增加Nrf2核蛋白以及Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平(P<0.05)。综上所述,热应激抑制了骨骼肌细胞Nrf2信号通路,白藜芦醇可能是通过激活Nrf2信号通过来发挥保护作用。
图4 白藜芦醇处理对热应激骨骼肌细胞Nrf2信号通路相关蛋白表达的影响

Nucl-Nrf2:核因子E2 相关因子2核蛋白 nuclear factor E2-related factor 2 nucleoprotein;Nrf2:核因子E2相关因子2 nuclear factor E2-related factor 2;Histone H3:组蛋白H3;HO-1:血红素加氧酶-1 heme oxygenase-1;NQO1:醌氧化还原酶1 quinone oxidoreductase 1;β-actin:β-肌动蛋白;RES:白藜芦醇resveratrol;HS:热应激 heat stress。

Fig.4 Effects of resveratrol on expression of Nrf2 signaling pathway-related proteins of heat-stressed skeletal muscle cells (n=3)

2.7 激活Nrf2信号通路对白藜芦醇处理热应激骨骼肌细胞抗氧化能力的影响

如图5所示,与对照处理组比,单独t-BHQ处理显著降低骨骼肌细胞MDA和ROS含量(P<0.05),显著提高细胞T-AOC、T-SOD和CAT活性(P<0.05)。与热应激处理相比,t-BHQ与热应激共处理显著降低细胞MDA、ROS和PC含量(P<0.05),显著提高细胞T-AOC、T-SOD和CAT活性(P<0.05)。综上所述,激活Nrf2信号通路可提高热应激骨骼肌细胞的抗氧化能力。
图5 激活Nrf2信号通路对白藜芦醇处理热应激骨骼肌细胞抗氧化能力的影响

t-BHQ:特丁基对苯二酚 tert-butylhydroquinone;HS:热应激 heat stress。

Fig.5 Effects of activation of Nrf2 signaling pathway on antioxidant capacity of heat-stressed skeletal muscle cells treated with resveratrol (n=3)

2.8 激活Nrf2信号通路对白藜芦醇处理热应激骨骼肌细胞相关蛋白表达的影响

如图6所示,与对照处理比,单独t-BHQ处理显著增加骨骼肌细胞Nrf2核蛋白以及Nrf2和HO-1蛋白表达水平(P<0.05)。与热应激处理相比,t-BHQ与热应激共处理显著增加Nrf2核蛋白以及Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平(P<0.05)。结果表明,激活Nrf2信号通路可提高热应激骨骼肌细胞抗氧化相关蛋白表达,从而缓解骨骼肌细胞氧化损伤。
图6 激活Nrf2信号通路对白藜芦醇处理热应激骨骼肌细胞相关蛋白表达的影响

Nucl-Nrf2:核因子E2 相关因子2核蛋白 nuclear factor E2-related factor 2 nucleoprotein;Nrf2:核因子E2相关因子2 nuclear factor E2-related factor 2;Histone H3:组蛋白H3;HO-1:血红素加氧酶-1 heme oxygenase-1;NQO1:醌氧化还原酶1 quinone oxidoreductase 1;β-actin:β-肌动蛋白; t-BHQ:特丁基对苯二酚 tert-butylhydroquinone; β-actin:β-肌动蛋白; HS:热应激 heat stress。

Fig.6 Effects of activation of Nrf2 signaling pathway on expression of proteins related to heat-stressed

skeletal muscle cells treated with resveratrol (n=3)

2.9 抑制Nrf2信号通路对白藜芦醇处理热应激骨骼肌细胞抗氧化能力的影响

如图7所示,与对照处理相比,ML385显著增加骨骼肌细胞MDA、ROS和PC含量(P<0.05),并显著降低T-AOC、T-SOD和CAT活性(P<0.05)。与热应激处理相比,ML385与热应激共处理显著增加细胞MDA、ROS和PC含量(P<0.05),并显著降低T-AOC和T-SOD活性(P<0.05)。与白藜芦醇+热应激处理相比,ML385、白藜芦醇和热应激共处理显著增加细胞MDA、ROS和PC含量(P<0.05),并显著降低T-AOC、T-SOD和CAT活性(P<0.05)。以上结果表明,ML385阻断了白藜芦醇提高热应激骨骼肌细胞抗氧化能力。
图7 抑制Nrf2信号通路对白藜芦醇处理热应激骨骼肌细胞抗氧化能力的影响

RES:白藜芦醇resveratrol;HS:热应激 heat stress;NC:培养基不添加ML385 medium without ML385;ML385;Nrf2抑制剂 Nrf2 inhibitor。

Fig.7 Effects of inhibition of Nrf2 signaling pathway on antioxidant capacity of heat-stressed skeletal muscle cells treated with resveratrol (n=3)

2.10 抑制Nrf2信号通路对白藜芦醇处理热应激骨骼肌细胞相关蛋白表达的影响

如图8所示,与对照处理相比,ML385显著降低Nrf2核蛋白以及HO-1蛋白表达水平(P<0.05)。与热应激处理相比,ML385与热应激共处理显著降低Nrf2核蛋白以及HO-1和NQO1蛋白表达水平(P<0.05)。与白藜芦醇+热应激处理相比,ML385、白藜芦醇和热应激共处理显著降低Nrf2核蛋白以及Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平(P<0.05)。由此可知,ML385阻断了白藜芦醇对热应激骨骼肌细胞抗氧化蛋白表达增强的作用。
图8 抑制Nrf2信号通路对白藜芦醇处理热应激骨骼肌细胞相关蛋白表达的影响

Nucl-Nrf2:核因子E2 相关因子2核蛋白 nuclear factor E2-related factor 2 nucleoprotein;Nrf2:核因子E2相关因子2 nuclear factor E2-related factor 2;Histone H3:组蛋白H3;HO-1:血红素加氧酶-1 heme oxygenase-1;NQO1:醌氧化还原酶1 quinone oxidoreductase 1;β-actin:β-肌动蛋白;NC:培养基不添加ML385 medium without ML385;ML385:Nrf2抑制剂 Nrf2 inhibitor;RES:白藜芦醇resveratrol;HS:热应激 heat stress。

Fig.8 Effects of inhibition of Nrf2 signaling pathway on expression of proteins associated with heat-stressed skeletal muscle cells treated with resveratrol (n=3)

3 讨论

全球变暖加剧集约化养殖家禽的热应激反应。高温环境刺激下,机体代谢增加引发骨骼肌细胞能量代谢紊乱,最终诱导细胞发生氧化应激[11-12]。Lu等[13]研究表明,42.0 ℃处理羔羊骨骼肌细胞3 d,可显著降低细胞活力、GSH-Px和SOD活性,显著增加MDA含量,从而引发细胞损伤。研究发现,41.5 ℃处理2 d以构建猪骨骼肌卫星细胞热应激模型[14]。Kim等[15]研究表明,41.0 ℃处理3 h可构建牛骨骼肌卫星细胞热应激模型。本研究发现,39.5 ℃处理中细胞活力显著高于其他处理,而44.5 ℃处理中细胞活力显著下降,且细胞内的氧化应激标志物含量显著增加,抗氧化酶的活性显著下降,从而诱导细胞发生氧化应激。虽然47.0 ℃也会诱导骨骼肌细胞发生氧化损伤,但由于温度过高,细胞大片死亡。因此,后续选择44.5 ℃作为热应激处理骨骼肌细胞的最适温度,从而为研究热应激对骨骼肌细胞的影响提供了一个合适的模型。
白藜芦醇作为一种具有显著抗氧化特性的生物活性物质,在动物抗应激[16]、免疫调节[17]以及抗肿瘤[18]等多方面展现出重要的生物学效应。因此,本试验探究不同浓度的白藜芦醇对骨骼肌细胞的影响。本试验发现,25.0 μmol/L白藜芦醇处理显著降低细胞MDA、ROS和PC含量,显著提高GSH含量以及T-SOD和CAT的活性,同时提高Nrf2及其下游抗氧化基因的基因表达水平。同样,安彦昊等[19]发现,白藜芦醇可显著降低奶牛肝细胞ROS含量,显著提高GSH-Px和SOD mRNA表达相对表达量。研究表明,白藜芦醇可通过抑制ROS的产生和脂质损伤,提高GSH含量和抗氧化酶的活性来减轻氧化损伤[20-21]。在山羊小肠上皮细胞热应激模型中,白藜芦醇可提高小肠上皮细胞GSH-Px、T-SOD和T-AOC活性,并降低细胞内MDA含量[22]。研究表明,白藜芦醇可提高热应激肉鸡肝脏GSH-Px和SOD活性,降低MDA含量,并激活Nrf2、HO-1、NQO1和SOD1 mRNA相对表达量,抑制Keap1 mRNA表达,从而缓解肝脏氧化损伤[4]。Zhao等[1]试验表明,白藜芦醇可提高热应激肉鸡肌肉的谷胱甘肽S-转移酶(GST)和GSH-Px活性,并增加肌肉中Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA相对表达量,降低Keap1 mRNA相对表达量,最终提高肌肉品质。本试验同样发现,白藜芦醇可提高热应激骨骼肌细胞Nrf2及其下游抗氧化基因表达,提高骨骼肌细胞的抗氧化能力,从而缓解热应激诱导的氧化损伤。综上所述,白藜芦醇可缓解热应激骨骼肌细胞氧化损伤,其潜在的机制可能是通过介导Nrf2信号通路有关。
已有多项研究佐证了Nrf2信号通路在热应激诱导氧化应激模型中发挥至关重要的作用,在维持细胞氧化还原平衡中必不可少[4,9,23]。武亚南等[24]的研究发现,使用Nrf2激活剂t-BHQ可提高热应激肉鸡心肌细胞SOD活性、Nrf2和HO-1基因以及蛋白表达水平,从而缓解氧化损伤。在牛乳腺上皮细胞热应激模型中,t-BHQ显著降低热应激细胞ROS含量,显著促进Nrf2的核转位和提高HO-1的蛋白表达[25]。本研究也有同样的结果,使用t-BHQ处理热应激骨骼肌细胞,显著降低细胞的氧化应激标志物含量,显著提高细胞的抗氧化能力,并提高细胞Nrf2及其下游抗氧化基蛋白的表达。因此,本试验猜测白藜芦醇可能是通过激活Nrf2信号通路缓解热应激骨骼肌细胞氧化损伤。为了明确白藜芦醇是否依赖Nrf2信号通路介导其对热应激损伤的缓解效应,本研究通过抑制剂阻断试验进行分子机制验证。试验结果发现,ML385处理骨骼肌细胞后,显著增加细胞MDA、ROS和PC含量,显著降低细胞的抗氧酶活性,并且抑制细胞内Nrf2及其下游抗氧化基因蛋白的表达,说明ML385削弱了白藜芦醇对热应激骨骼肌细胞的保护作用。在大鼠脑卒中后抑郁症模型中,白藜芦醇可激活大鼠脑组织Nrf2信号通路,提高抗氧化能力从而缓解氧化应激,然而使用ML385之后,大鼠脑组织的抗氧化能力显著下降,而MDA的含量显著增加,且脑组织内Nrf2和HO-1的蛋白表达受到抑制[16]。李艳萍等[26]研究发现,ML385减弱白藜芦醇对过氧化氢诱导肺泡上皮细胞的保护作用,加重细胞氧化应激。同时,Song等[27]也证明了ML385阻断白藜芦醇缓解缺血再灌注小鼠氧化应激的作用,从而诱导小鼠发生氧化损伤。此外,史治宇等[28]发现,白藜芦醇可通过激活沉默信息调节因子1(SIRT1)/Nrf2信号通路缓解高糖诱导的心肌细胞氧化应激。然而,白藜芦醇是否通过SIRT1/Nrf2信号通路缓解热应激诱导的骨骼肌细胞氧化应激还需进一步研究。综上所述,本研究证实了Nrf2信号通路在白藜芦醇缓解热应激诱导的肉鸡骨骼肌细胞氧化损伤的关键作用,并为将白藜芦醇开发为功能性饲料添加剂,以减轻热应激对肉鸡造成的损害提供了科学依据。

4 结论

① 本试验条件下,诱导骨骼肌细胞氧化损伤的适宜热应激温度为44.5 ℃,白藜芦醇处理骨骼肌细胞的适宜浓度为25.0 μmol/L。
② 白藜芦醇可提高骨骼肌细胞的抗氧化能力,降低细胞内氧化应激标志物含量,从而有效缓解氧化损伤。
③ 白藜芦醇通过激活Nrf2信号通路,发挥其保护作用,以缓解热应激诱导的肉鸡骨骼肌细胞氧化损伤。

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