不同发酵工艺对酵母培养物营养活性物质及瘤胃体外发酵参数和营养物质降解率的影响

云梓辰; 徐子萱; 张小洁; 刘世雄; 罗启斐; 乌英嗄; 卢玉; 刘大程; 杨岚

doi:10.12418/CJAN2025.709

动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 12: 8710 - 8721

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.709

研究论文

不同发酵工艺对酵母培养物营养活性物质及瘤胃体外发酵参数和营养物质降解率的影响

云梓辰 ^,¹ ,
徐子萱 ¹ ,
张小洁 ¹ ,
刘世雄 ¹^,² ,
罗启斐 ¹^,² ,
乌英嗄 ¹ ,
卢玉 ¹ ,
刘大程 ^,¹^,^* ,
杨岚 ^,¹^,^*

展开

¹ 内蒙古农业大学兽医学院, 呼和浩特 010010
² 国家乳业技术创新中心, 呼和浩特 010010

^* 刘大程,教授,博士生导师,E-mail: nmgldc@163.com;

杨岚,讲师,硕士生导师,E-mail: yanglanimau@126.com

云梓辰(2000—),男,蒙古族,内蒙古呼和浩特人,硕士研究生,从事兽医微生物与免疫学相关研究。E-mail: Zichen_Yun@163.com

收稿日期: 2025-05-16

网络出版日期: 2025-12-13

基金资助

国家重点研发计划(2023YFE0100400)

内蒙古自治区直属高校基本科研业务项目(BR22-11-17)

国家乳业技术创新中心(2023-JSGG-5)

内蒙古一流学科科研专项(YLXKZX-NND-012)

收起

Effects of Different Fermentation Processes on Nutritional Active Substances in Yeast Cultures and Rumen Fermentation Parameters and Nutrient Degradation Rates in Vitro

YUN Zichen ^,¹ ,
XU Zixuan ¹ ,
ZHANG Xiaojie ¹ ,
LIU Shixiong ¹^,² ,
LUO Qifei ¹^,² ,
WU Yingga ¹ ,
LU Yu ¹ ,
LIU Dacheng ^,¹^,^* ,
YANG Lan ^,¹^,^*

Expand

¹ College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010010, China
² National Dairy Technology Innovation Center, Hohhot 010010, China

^* LIU Dacheng, professor, E-mail: nmgldc@163.com;

YANG Lan, lecturer, E-mail: yanglanimau@126.com

Received date: 2025-05-16

Online published: 2025-12-13

Fold

摘要

发酵工艺是影响酵母培养物品质及其作用效果的重要因素之一,本试验旨在研究不同发酵工艺对酵母培养物品质及肉牛瘤胃体外发酵参数和营养物质降解率的影响。试验采用单因素试验设计,根据发酵工艺分为4个组,分别为:对照组(CON组,未接菌的混合饲料)、堆积发酵组(AF组,发酵池中堆积发酵)、袋装发酵组(BF组,装入发酵袋中厌氧发酵)和两段式发酵组(TF组,先堆积发酵后装袋发酵),发酵72 h后采集样品,测定营养活性物质含量、理化指标和益生菌数量;并利用瘤胃体外发酵技术,测定发酵参数和营养物质降解率。结果表明:1)与CON组相比,3个试验组酵母培养物中营养活性物质含量均显著提高(P<0.05)。同时,TF组甘露聚糖含量显著高于BF组(P<0.05),牛磺酸含量显著高于AF组和BF组(P<0.05);AF组花生四烯酸含量最高,显著高于其他试验组(P<0.05)。2)与CON组相比,3个试验组三氯乙酸可溶蛋白和总有机酸含量显著提高(P<0.05),pH显著降低(P<0.05)。同时,TF组粗蛋白质含量显著高于其他各组(P<0.05)。3)与CON组相比,各试验组益生菌数量均显著提高(P<0.05)。同时,AF组和TF组马克斯克鲁维酵母XR4数量显著高于BF组(P<0.05)。4)TF组体外干物质降解率、体外酸性洗涤纤维降解率、体外发酵产气量以及氨态氮和总挥发性脂肪酸含量显著高于BF组(P<0.05),菌体蛋白含量显著高于AF组(P<0.05)。综上所述,两段式发酵工艺制备的酵母培养物品质优于堆积发酵和袋装发酵工艺,更适合用于酵母培养物的生产。

关键词： 酵母培养物; 发酵工艺; 发酵品质; 瘤胃体外发酵

本文引用格式

云梓辰 , 徐子萱 , 张小洁 , 刘世雄 , 罗启斐 , 乌英嗄 , 卢玉 , 刘大程 , 杨岚 . 不同发酵工艺对酵母培养物营养活性物质及瘤胃体外发酵参数和营养物质降解率的影响[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(12) : 8710 -8721 . DOI: 10.12418/CJAN2025.709

Abstract

Fermentation process is one of the important factors affecting the quality of yeast cultures and their effects, and this experiment was designed to investigate the effects of different fermentation processes on the quality of yeast cultures and the fermentation parameters and nutrient degradation rates in rumen of beef cattle in vitro. A single factor experimental design was used in this experiment, which was divided into four groups according to the fermentation process as the control group (CON group, mixed feed without bacteria), the accumulation fermentation group (AF group, accumulation fermentation in fermentation tank), the bag fermentation group (BF group, anaerobic fermentation in fermentation bag), and the two-stage fermentation group (TF group, accumulation fermentation followed by bag fermentation), and the samples were collected after 72 h fermentation to determine the nutritional active substance contents, physicochemical indices, and quantity of probiotics; and the fermentation parameters and nutrient degradation rates were determined using rumen fermentation technology in vitro. The results showed as follows: 1) compared with CON group, the nutrient active substance contents in yeast cultures in the three experimental groups were significantly increased (P<0.05). Meanwhile, the mannan content in TF group was significantly higher than that in BF group (P<0.05), and the taurine content was significantly higher than that in AF group and BF group (P<0.05). The arachidonic acid content in AF group was the highest, which was significantly higher than that in the other experimental groups (P<0.05). 2) Compared with CON group, the contents of trichloroacetic acid-soluble protein and total organic acids in the three experimental groups were significantly increased (P<0.05), and the pH was significantly decreased (P<0.05). Meanwhile, the crude protein content in TF group was significantly higher than that in the other groups (P<0.05). 3) Compared with CON group, the quantity of probiotics in each experimental group was significantly increased (P<0.05). Meanwhile, the quantity of Kluyveromyces marxianus XR4 in AF group and TF group was significantly higher than that in BF group (P<0.05). 4) The in vitro dry matter degradation rate, in vitro acid detergent fiber degradation rate, in vitro fermentation gas production, as well as the contents of ammonia nitrogen and total volatile fatty acids in TF group were significantly higher than those in BF group (P<0.05), and the bacterial protein content was significantly higher than that in AF group (P<0.05). In conclusion, the yeast cultures prepared by the two-stage fermentation process are of superior quality to those prepared by the accumulation fermentation and bag fermentation processes, and the two-stage fermentation process is more suitable for the production of yeast cultures.

Key words： yeast culture; fermentation process; fermentation quality; rumen fermentation in vitro

微生物发酵过程中,适宜的发酵工艺是菌群生长的必要条件。不同发酵工艺会影响酵母培养物的发酵品质,进而影响其使用功效^[1]。近年来,酵母培养物品质的提升及其发酵工艺的优化已成为当前研究热点。在微生物发酵领域,国外在精准发酵、发酵过程的自动化控制等方面处于领先地位^[2-3]。然而,目前国内关于酵母培养物的生产工艺多采用单一发酵模式,且主要集中在水分、温度和菌种筛选等工艺参数的研究,对于两段式发酵这种新兴工艺的相关研究尚处于起步阶段,相关报道极为有限^[4]。此外,该工艺条件下酵母培养物中营养活性物质的积累、理化指标的变化及对瘤胃发酵特性的影响仍不清晰。因此,本研究系统评估了堆积、袋装及两段式发酵方式对酵母培养物中营养活性物质、理化指标及瘤胃发酵参数和营养物质降解率的综合影响,旨在筛选出更高效、稳定的酵母培养物生产工艺,为其在畜牧业中的科学应用提供技术支撑。

酵母培养物种类繁多,但对于酵母培养物品质的评价尚未有明确的技术指标。目前主要以活菌数或粗蛋白质(CP)含量等指标作为酵母培养物品质评定的标准,而将发酵产生的营养活性物质纳入评定范围的研究相对较少。本研究团队前期开发的复合菌培养物,其主效成分主要包含甘露聚糖、β-葡聚糖、牛磺酸、N-乙酰谷氨酸和花生四烯酸5种营养活性物质,并以β-葡聚糖、甘露聚糖、活菌数和有机酸含量作为技术指标评定了复合菌培养物的品质。选择合适的指标评定是有效提升酵母培养物品质和营养价值的关键。基于此,本试验通过探讨不同发酵工艺对酵母培养物发酵品质的影响,探寻其适宜的发酵工艺,以期为提高酵母培养物产品品质及其在动物生产中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 酵母培养物的制备

根据本研究团队前期的研究成果^[5]制备酵母培养物,按比例选用12%麸皮、12%喷浆玉米皮、16%玉米、10%米糠粕、8%干酒糟及其可溶物(DDGS)、27%玉米胚芽粕和12%豆粕作为固态发酵培养基,将课题组保存的2株高活性酵母菌——马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)XR4和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BC活化扩培后的菌液按1∶1混合,以10%的接种量接入500 kg固态发酵培养基中,混合均匀后进行固态发酵。本试验在发酵车间中进行固态堆积发酵,堆积料高设为50 cm,初始含水量为38%~40%,翻料温度为40~45 ℃,发酵过程中使用高精度电子温度记录仪记录发酵温度,当发酵时间达到48 h,且温度达到40 ℃以上时进行翻料,翻料结束后继续进行堆积发酵,发酵终点为72 h,待发酵结束后取样。酵母培养物技术指标如下:β-葡聚糖含量≥0.50%,甘露聚糖含量≥0.35%,N-乙酰谷氨酸含量≥190 mg/kg,花生四烯酸含量≥4 mg/kg,牛磺酸含量≥125 mg/kg^[5-6]。

1.2 试验设计

本试验采用单因素试验设计,根据发酵工艺不同分为4组,分别为:对照组(CON组),未接菌的混合饲料;堆积发酵组(AF组),固态发酵培养基与菌液混合后于发酵池中堆积发酵;袋装发酵组(BF组),固态发酵培养基与菌液混合后置于发酵袋中厌氧发酵;两段式发酵组(TF组),固态发酵培养基与菌液混合后于先堆积发酵48 h后再置于发酵袋中发酵24 h。每组设置3个重复。各组于30 ℃车间环境中发酵72 h,发酵结束后采集样品,测定5种营养活性物质(甘露聚糖、β-葡聚糖、牛磺酸、N-乙酰谷氨酸和花生四烯酸)含量、理化指标以及益生菌数量,进一步采用瘤胃体外发酵技术评价不同发酵工艺的酵母培养物对肉牛瘤胃体外发酵参数和营养物质降解率的影响。

1.3 试验方法

1.3.1 酵母培养物中营养活性物质含量的测定

参考标准《酿酒酵母培养物中甘露聚糖和β-葡聚糖含量的测定高效液相色谱法》(T/CFIAS 6006—2024)中方法测定甘露聚糖和β-葡聚糖含量,参考标准《饲料中牛磺酸的测定高效液相色谱法》(农业部2483号公告-5-2016)中方法测定牛磺酸含量,参考李裕^[7]的方法测定N-乙酰谷氨酸含量,参考标准《粮食作物中脂肪酸含量的测定气相色谱法》(NY/T 3566—2020)中方法测定花生四烯酸含量。

1.3.2 酵母培养物理化指标的测定

采用pH计(FE-20K,梅特勒托利多,瑞士)测定酵母培养物pH,参考标准《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》(GB/T 6432—2018)中方法测定CP含量,参考标准《饲料原料中酸溶蛋白的测定》(NY/T 3801—2020)中方法测定三氯乙酸可溶蛋白(trichloroacetic acid-soluble protein,TCA-SP)含量,参考标准《食品安全国家标准食品中有机酸的测定》(GB 5009.157—2016)中方法测定有机酸含量。

1.3.3 酵母培养物中益生菌数量的测定

采用真菌DNA提取试剂盒[DP307,天根生化科技(北京)有限公司]提取各组酵母培养物样品中酵母菌菌株的基因组DNA,然后进行PCR,详细引物序列、片段大小以及退火温度见表1。PCR扩增后经3%琼脂糖凝胶检测,扩增产物回收纯化后作为标准品,测定其吸光度(OD)值后换算为拷贝数^[8],标准品倍比稀释后上机测定。以各梯度拷贝数的对数值为横坐标,循环阈值(CT值)为纵坐标,绘制标准曲线。将各组PCR的CT值带入标准曲线完成结果计算。扩增体系:2×MagicSYBR Green qPCR Master Mix 10.0 μL,Forward Primer 0.4 μL,Reverse Primer 0.4 μL,模板DNA 2.0 μL,ddH₂O 7.2 μL。预变性95 ℃,30 s;变性95 ℃,5 s;退火/延伸62 ℃,30 s;40个循环。

表1 引物序列、片段大小以及退火温度

Table 1 Primer sequences, fragment size, and annealing temperature

项目 Items	引物序列 Primer sequences (5'—3')	扩增长度 Amplification length/bp	退火温度 Tm/℃
酿酒酵母BC Saccharomyces cerevisiae BC	F:CGAGAGACCGATAGCGAACAAG	144	61.70
	R:CCCTACCCACAAGGAGCAGA		59.80
马克斯克鲁维酵母XR4 Kluyveromyces marxianus XR4	F:CCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATA	200	61.80
	R:GAGACAAACACCAGCGAGTCTTTAT		61.30

1.3.4 瘤胃体外发酵试验

试验选取6头体况相近的西门塔尔肉牛[体重为(615±35) kg]作为瘤胃液供体动物,试验动物的使用按照内蒙古农业大学实验动物福利与伦理委员会批准的方案进行管理(审批编号:NND2023070)。发酵底物为供体动物的基础饲粮,基础饲粮采用养殖场饲粮配方,其组成及营养水平见表2。其中,干物质(DM)、CP、粗脂肪(EE)、粗纤维(CF)、钙(Ca)和磷(P)含量的测定方法分别参考标准《饲料中水分的测定》(GB/T 6435—2014)、《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》(GB/T 6432—2018)、《饲料中粗脂肪的测定》(GB/T 6433—2006)、《饲料中粗纤维的含量测定》(GB/T 6434—2022)、《饲料中钙的测定》(GB/T 6436—2018)和《饲料中总磷的测定分光光度法》(GB/T 6437—2018),总能(GE)采用全自动氧弹量热仪(C6000,IKA,德国)测定。

表2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

项目Items	含量Content
原料Ingredients
玉米Corn	47.48
豆粕Soybean meal	15.82
玉米秸秆Corn stalk	17.00
燕麦干草Oat hay	17.00
磷酸氢钙CaHPO₄	0.90
食盐NaCl	0.50
石粉Limestone	0.80
预混料Premix¹⁾	0.50
合计Total	100.00
营养水平Nutrient levels²⁾
干物质DM	83.42
总能GE/(MJ/kg)	16.14
粗蛋白质CP	15.31
粗脂肪EE	5.22
粗纤维CF	11.09
钙Ca	0.69
磷P	0.46

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of the diet:Zn (as zinc sulfate) 50 mg,Mn (as manganese sulfate) 25 mg,Cu (as copper sulfate) 2.5 mg,Fe (as ferrous sulfate) 40 mg,I (as potassium iodide) 0.70 mg,VA 3 000 IU,VD 3 290 IU,VE 3.2 mg。

2)营养水平均为实测值。Nutrient levels were all measured values.

通过口腔采样器采集瘤胃液,经4层纱布过滤后,将20 mL瘤胃液与40 mL人工缓冲液混合。人工缓冲液的配制参考Menke等^[9]的方法。混合液39 ℃水浴,并持续通入二氧化碳(CO₂)以保证厌氧环境。准确称取1.80 g发酵底物和0.20 g酵母培养物置于发酵瓶中,加入60 mL人工瘤胃培养液后通入CO₂,进行体外发酵培养。另配一份相同培养液,不添加底物和酵母培养物,置于AGRS-Ⅲ型微生物发酵微量产气自动记录仪中,产气量由产气记录仪软件系统记录和处理。培养48 h时冰浴终止发酵,培养液经尼龙袋过滤后,滤液迅速测定其pH以及其他各项指标,残渣烘干后进行后续营养物质降解率的相关测定。各组设置3个重复。

1.3.4.1 体外营养物质降解率的测定

各组发酵后的样品残渣均被全部保留用于后续试验的测定。残渣经烘箱65 ℃烘干48 h后称重,计算样品的体外干物质降解率(IVDMD)。分别参考标准《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》(GB/T 6432—2018)、《饲料中中性洗涤纤维(NDF)的测定》(GB/T 20806—2022)和《饲料中酸性洗涤纤维的测定》(NY/T 1459—2022)中方法测定CP、NDF和ADF含量。根据公式计算体外粗蛋白质降解率(IVCPD)、体外中性洗涤纤维降解率(IVNDFD)和体外酸性洗涤纤维降解率(IVADFD)。计算公式如下:

某营养物质体外降解率(%)=100×(G₁M₁-G₂M₂)/G₁M₁。

式中:G₁为样品样重;M₁为样品中该营养物质含量;G₂为降解后样品残渣重;M₂为降解后样品残渣中该营养物质含量。

1.3.4.2 体外发酵参数的测定

利用pH计测定发酵液pH,采用AGRS-Ⅲ型微生物发酵微量产气自动记录仪记录产气量,采用考马斯亮蓝法^[10]测定菌体蛋白(BCP)含量,参考冯宗慈等^[11]的比色法测定氨态氮(NH₃-N)含量,采用气相色谱仪(GC-2014,岛津,日本)参考李敏^[12]的方法测定挥发性脂肪酸(VFA)含量。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2016初步整理数据,然后采用SAS 9.0软件对试验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比较,并采用DPS 14.0软件中的理想解相似度排序(TOPSIS)法对不同发酵工艺酵母培养物中的营养活性物质含量及瘤胃体外发酵参数和营养物质降解率等进行多指标综合评价;结果数据采用“平均值±标准差”形式表示,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同发酵工艺对酵母培养物中营养活性物质含量的影响

由表3可见,与CON组相比,AF组、BF组和TF组酵母培养物中营养活性物质(β-葡聚糖、甘露聚糖、牛磺酸、N-乙酰谷氨酸和花生四烯酸)含量均显著提高(P<0.05)。此外,AF组和TF组甘露聚糖含量显著高于BF组(P<0.05);TF组牛磺酸含量最高,显著高于AF组和BF组(P<0.05);AF组、BF组和TF组之间β-葡聚糖和N-乙酰谷氨酸含量无显著差异(P>0.05);AF组花生四烯酸含量显著高于BF组和TF组(P<0.05),TF组花生四烯酸含量显著高于BF组(P<0.05)。

表3 不同发酵工艺对酵母培养物中营养活性物质含量的影响

Table 3 Effects of different fermentation processes on contents of nutritional active substances in yeast cultures

项目 Items	组别Groups				P值 P-value
项目 Items	CON	AF	BF	TF	P值 P-value
β-葡聚糖β-glucan/%	0.05±0.00^b	0.81±0.10^a	0.81±0.08^a	0.88±0.04^a	0.038
甘露聚糖Mannan/%	0.29±0.02^c	0.62±0.02^a	0.56±0.02^b	0.64±0.01^a	<0.001
牛磺酸Taurine/(mg/kg)	0.00±0.00^c	234.80±3.07^b	231.74±1.61^b	249.73±3.52^a	<0.001
N-乙酰谷氨酸N-acetylglutamic acid/(mg/kg)	12.23±3.60^b	233.20±5.16^a	225.38±9.27^a	227.96±4.76^a	0.001
花生四烯酸Arachidonic acid/(mg/kg)	0.00±0.00^d	15.56±0.13^a	13.40±0.16^c	15.21±0.15^b	<0.001

	同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同字母表示差异显著(P<0.05)。表4至表7同。
	In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as Table 4 to Table 7.

2.2 不同发酵工艺对酵母培养物理化指标的影响

由表4可知,与CON组相比,AF组、BF组和TF组酵母培养物pH均显著降低(P<0.05),TCA-SP、苹果酸、琥珀酸和总有机酸含量均显著提高(P<0.05);TF组CP含量显著提高(P<0.05)。此外,TF组CP和TCA-SP含量显著高于AF组(P<0.05);AF组酒石酸和柠檬酸含量显著高于TF组(P<0.05),且pH和乙酸含量显著高于BF组(P<0.05);BF组和TF组乳酸、丙酸和总有机酸含量显著高于AF组(P<0.05);AF组、BF组和TF组之间苹果酸和琥珀酸含量无显著差异(P>0.05)。

表4 不同发酵工艺对酵母培养物理化指标的影响

Table 4 Effects of different fermentation processes on physicochemical indices in yeast cultures

项目 Items	组别Groups				P值 P-value
项目 Items	CON	AF	BF	TF	P值 P-value
pH	6.33±0.02^a	5.79±0.03^b	5.74±0.03^c	5.78±0.01^bc	<0.001
粗蛋白质CP/%	16.63±0.98^b	17.38±0.36^b	17.25±0.74^b	18.52±0.30^a	0.011
三氯乙酸可溶蛋白TCA-SP/%	5.74±0.26^c	6.58±0.08^b	6.66±0.08^ab	6.91±0.16^a	0.001
有机酸Organic acids/(mg/100 g)
酒石酸Tartaric acid	216.56±7.70^b	270.26±17.12^a	236.79±22.17^b	238.12±9.94^b	0.017
苹果酸Malic acid	465.66±43.02^b	919.05±15.99^a	801.83±109.47^a	877.48±109.39^a	0.001
乳酸Lactic acid	1 570.35±21.88^d	1 795.98±16.78^c	2 249.44±78.70^a	2 009.49±48.42^b	<0.001
乙酸Acetic acid	192.03±26.83^c	500.68±19.80^a	426.10±49.49^b	444.14±9.51^ab	<0.001
柠檬酸Citric acid	418.43±27.43^c	561.53±8.39^a	552.27±43.27^ab	508.44±7.77^b	0.001
琥珀酸Succinic acid	188.59±53.68^b	1 034.53±23.29^a	1 100.85±100.60^a	1 017.22±11.95^a	<0.001
丙酸Propanoic acid	2 361.46±145.56^b	2 409.79±277.74^b	3 052.42±205.22^a	2 933.09±89.36^a	0.004
总有机酸Total organic acid	5 413.08±50.10^c	7 491.82±257.85^b	8 419.70±308.76^a	8 027.99±239.42^a	<0.001

2.3 不同发酵工艺对酵母培养物中益生菌数量的影响

由表5可知,与CON组相比,AF组、BF组和TF组酵母培养物中益生菌(酿酒酵母BC和马克斯克鲁维酵母XR4)数量均显著增加(P<0.05)。此外,AF组和TF组马克斯克鲁维酵母XR4数量显著高于BF组(P<0.05),AF组、BF组和TF组之间酿酒酵母BC数量无显著差异(P>0.05)。

表5 不同发酵工艺对酵母培养物中益生菌数量的影响

Table 5 Effects of different fermentation processes on quantity of probiotics in yeast cultures lg(拷贝数/g)

项目 Items	组别Groups				P值 P-value
项目 Items	CON	AF	BF	TF	P值 P-value
酿酒酵母BC Saccharomyces cerevisiae BC	3.11±0.34^b	7.52±0.08^a	7.49±0.02^a	7.49±0.03^a	<0.001
马克斯克鲁维酵母XR4 Kluyveromyces marxianus XR4	3.52±0.56^c	7.41±0.05^a	6.21±0.06^b	6.98±0.08^a	<0.001

2.4 不同发酵工艺酵母培养物对肉牛瘤胃体外营养物质降解率的影响

由表6可知,与CON组相比,AF组、BF组和TF组IVDMD、IVCPD和IVNDFD均显著提高(P<0.05),TF组IVADFD显著提高(P<0.05)。此外,TF组IVDMD最高,显著高于AF组和BF组(P<0.05);同时,TF组IVADFD显著高于BF组(P<0.05);AF组、BF组和TF组之间IVCPD和IVNDFD无显著差异(P>0.05)。

表6 不同发酵工艺酵母培养物对肉牛瘤胃体外营养物质降解率的影响

Table 6 Effects of yeast cultures with different fermentation processes on degradation rates of nutrients in rumen of beef cattle in vitro %

项目 Items	组别Groups				P值 P-value
项目 Items	CON	AF	BF	TF	P值 P-value
体外干物质降解率IVDMD	64.13±0.58^d	68.00±0.49^b	66.14±0.40^c	68.98±0.26^a	<0.001
体外粗蛋白质降解率IVCPD	65.00±0.76^b	68.02±1.51^a	68.02±0.97^a	69.00±1.07^a	0.011
体外中性洗涤纤维降解率IVNDFD	32.08±0.31^b	36.42±0.77^a	35.50±0.63^a	36.98±1.32^a	0.001
体外酸性洗涤纤维降解率IVADFD	26.29±0.76^b	27.99±1.51^ab	27.22±1.21^b	29.74±1.15^a	0.039

2.5 不同发酵工艺酵母培养物对肉牛瘤胃体外发酵参数的影响

由表7可知,体外发酵48 h后,与CON组相比,AF组、BF组和TF组发酵液pH以及BCP、乙酸和总挥发性脂肪酸(TVFA)含量显著提高(P<0.05),AF组和TF组产气量和NH₃-N含量显著提高(P<0.05),TF组戊酸含量显著提高(P<0.05)。此外,AF组和TF组产气量显著高于BF组(P<0.05),TF组NH₃-N、乙酸、戊酸和TVFA含量显著高于BF组(P<0.05),TF组BCP含量显著高于AF组(P<0.05),AF组、BF组和TF组之间pH无显著差异(P>0.05)。各组间丙酸、丁酸、异丁酸和异戊酸含量以及乙酸/丙酸均无显著差异(P>0.05)。

表7 不同发酵工艺酵母培养物对肉牛瘤胃体外发酵参数的影响

Table 7 Effects of yeast cultures with different fermentation processes on rumen fermentation parameters of beef cattle in vitro

项目 Items	组别Groups				P值 P-value
项目 Items	CON	AF	BF	TF	P值 P-value
pH	5.85±0.02^b	5.91±0.02^a	5.89±0.01^a	5.91±0.01^a	0.002
产气量Gas production/mL	263.65±5.26^b	279.88±5.50^a	266.20±5.79^b	279.99±6.63^a	0.014
氨态氮NH₃-N/(mg/dL)	10.20±1.21^c	12.84±1.14^ab	11.11±0.51^bc	13.93±0.81^a	0.006
菌体蛋白BCP/(mg/dL)	38.49±1.15^c	47.67±0.60^b	48.50±0.34^ab	50.63±2.30^a	<0.001
挥发性脂肪酸VFA/(mmol/L)
乙酸Acetate	51.59±3.89^c	59.87±0.31^ab	57.23±1.05^b	62.40±2.02^a	0.002
丙酸Propionate	22.04±1.84	24.55±0.87	23.70±1.25	24.10±1.07	0.177
异丁酸Isobutyrate	0.78±0.03	0.84±0.02	0.81±0.03	0.88±0.05	0.051
异戊酸Isovalerate	1.50±0.10	1.57±0.06	1.53±0.01	1.70±0.14	0.113
丁酸Butyrate	12.63±0.62	12.78±0.12	12.64±0.38	13.84±1.25	0.201
戊酸Valerate	1.58±0.07^b	1.66±0.04^ab	1.63±0.05^b	1.74±0.04^a	0.028
总挥发性脂肪酸TVFA	90.11±5.73^c	101.27±0.38^ab	97.54±2.01^b	104.49±2.68^a	0.004
乙酸/丙酸Acetate/propionate	2.34±0.14	2.44±0.10	2.42±0.09	2.59±0.19	0.220

2.6 TOPSIS综合分析

由表8可知,采用TOPSIS法对不同发酵工艺酵母培养物中的营养活性物质含量、理化指标、益生菌数量以及瘤胃体外发酵试验的相关指标进行综合分析,TF组排序位列第1,表明该组发酵工艺为本试验中酵母培养物的最适发酵工艺。

表8 TOPSIS法综合分析结果

Table 8 Results of comprehensive analysis by TOPSIS method

项目 Items	组别Groups
项目 Items	CON	AF	BF	TF
最优解D⁺	16.432	7.348	10.583	6.164
最劣解D^-	5.568	12.923	8.544	14.248
置信区间CI	0.253	0.637	0.447	0.698
排序Ranking	4	2	3	1

3 讨论

3.1 不同发酵工艺对酵母培养物中营养活性物质含量的影响

酵母培养物在发酵过程中代谢产生的β-葡聚糖、甘露聚糖、牛磺酸、N-乙酰谷氨酸和花生四烯酸等活性物质对动物机体具有积极作用^[6,13]。研究表明,β-葡聚糖和甘露聚糖可改善肠道环境,刺激机体产生非特异性免疫,增强抗氧化能力^[14]。牛磺酸作为一种含硫氨基酸,有维持细胞膜稳定性的作用,有助于优化肠道对营养物质的吸收^[15]。Chi等^[16]研究表明,饲料经酵母发酵后其β-葡聚糖、甘露聚糖等物质含量显著提升,这与本研究结果一致。在本试验中,各试验组酵母培养物中5种营养活性物质含量均显著高于CON组,同时TF组甘露聚糖和花生四烯酸含量显著高于BF组,牛磺酸含量显著高于AF组和BF组,表明不同发酵工艺均可促进酵母发酵产物中营养活性物质的积累,从而更利于改善产品品质,其中以TF组效果更佳。本研究团队前期研究表明,堆积发酵阶段酵母快速繁殖,在此过程中其代谢途径建立并逐渐完善;随后进入袋装发酵阶段,由于环境中氧气和CO₂浓度的改变,迫使酵母细胞代谢发生调整,倾向于合成更多的β-葡聚糖和甘露聚糖^[17]。而牛磺酸含量的提升,与蛋氨酸代谢途径以及半胱氨酸代谢途径密切相关,部分中间产物进一步向合成牛磺酸的方向代谢,这一系列的代谢调控导致TF组牛磺酸含量显著升高^[18]。花生四烯酸在反刍动物体内发挥着不可或缺的作用,特别是在细胞膜的结构组成和功能维持方面^[19]。然而,反刍动物自身合成花生四烯酸的能力有限,所以在很大程度上依赖于从饲粮中摄取。N-乙酰谷氨酸是一种内源性氨基酸衍生物,它通过激活肝细胞和肠道细胞线粒体中的氨基甲酰磷酸合成酶1来增加精氨酸的内源性合成,从而在反刍动物生产中发挥积极作用^[20]。Granata等^[21]研究发现,堆积发酵保证了酵母呼吸作用氧气的充足供应,满足了细胞生长代谢能量需求。在本试验中,AF组花生四烯酸和N-乙酰谷氨酸含量最高,其原因可能是在堆积发酵过程中,充足的氧气供应能够保障酵母细胞呼吸作用的高效进行,为细胞代谢提供充足的能量;同时,合适的底物浓度为酶促反应提供了丰富的反应物,底物与酶的活性中心充分结合,诱导酶分子发生构象变化,进而激活参与花生四烯酸合成的酶,这使得酵母细胞内的相关代谢途径得以顺畅运行,能够高效地将相关底物转化为花生四烯酸。此外,堆积发酵过程中酵母细胞的代谢活动十分复杂,氮代谢途径也展现出独特之处^[22]。N-乙酰谷氨酸作为尿素循环中的关键激活剂,其含量升高与这种独特的氮代谢途径紧密相关。在堆积发酵时,酵母细胞对氮源的利用和代谢与其他组存在差异,这种差异导致了N-乙酰谷氨酸合成途径的加强,从而使其含量高于其他组。

3.2 不同发酵工艺对酵母培养物理化指标的影响

适宜的pH在为微生物提供良好生长环境的同时,还可以抑制杂菌的生长,提升酵母培养物的品质。本试验中,各试验组酵母培养物pH较CON组相比均显著降低,这说明不同发酵工艺均可降低酵母培养物pH,这与刘雅萍^[23]的研究结果一致。同时,BF组pH最低,这是由于在袋装发酵过程中,酵母菌无氧呼吸产生的有机酸难以被快速分解或转化,有机酸的积累导致pH持续下降。CP是评价饲料营养价值的核心指标之一,其含量直接影响动物的生长性能和生产效益。好氧发酵为酵母提供充足氧气,利于其生长代谢,在此过程中微生物作用于饲料原料,促使蛋白质分解为小分子肽段和氨基酸并部分转化为TCA-SP,更易于被动物机体消化吸收,从而提高酵母培养物品质以及营养物质利用率^[24]。黄振勇等^[25]采用分级固态发酵技术发酵甘蔗尾梢饲料,有效提高了饲料中CP含量。杨连弟等^[26]通过筛选一株酵母菌后优化发酵工艺,使得饲料中的CP、有机氮、小肽、总氨基酸含量以及抗氧化能力显著提高。本试验中,TF组酵母培养物CP含量最高,且TCA-SP含量显著高于CON组和AF组,这表明TF组发酵工艺对于提高酵母培养物CP含量有显著影响。这可能是由于TF组发酵工艺可促进蛋白酶等酶类产生,使得蛋白质水解程度更高,从而提高TCA-SP含量^[27]。

微生物在发酵过程中产生的有机酸能切实改善酵母培养物的营养价值及适口性。万宁等^[28]研究指出,有机酸在改善肠道环境及提高采食量等方面具有优势,同时强调了其在饲料领域的应用价值。本试验中,AF组酵母培养物酒石酸和柠檬酸含量显著高于TF组,乙酸含量显著高于BF组;BF组和TF组乳酸、丙酸和总有机酸含量显著高于AF组,这表明不同发酵工艺对酵母培养物中有机酸含量产生了显著影响,产生差异的原因可能与不同发酵工艺的代谢途径存在一定差异有关。在有氧条件下,酵母可通过有氧呼吸消耗大量氧气并产生能量,并进入三羧酸循环等代谢途径产生乙酸、柠檬酸等有机酸;而在无氧条件时,发酵中产生的有机酸(乙酸、乳酸、琥珀酸等)则主要通过丙酮酸分支代谢和还原型辅酶Ⅰ再氧化生成,是维持氧化还原平衡的副产物。上述结果表明,不同发酵工艺通过影响酵母的呼吸代谢相关途径,导致其有机酸合成途径的变化,从而影响酵母培养物中的有机酸含量。

3.3 不同发酵工艺对酵母培养物中益生菌数量的影响

酵母培养物的制备是多种微生物协同作用的复杂过程,通过接种优势菌株有助于维持发酵环境和菌株生长代谢的稳定性。马克斯克鲁维酵母具有较强的产香能力,且可改善发酵环境,提升发酵产品感官品质。在酵母培养物生产中,该酵母常与酿酒酵母复配使用,不仅可提高发酵效率,还可丰富酵母培养物的营养价值^[29]。前期研究报道,马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母被广泛证实具有肠道黏附、免疫调节等益生作用,复合使用可发挥协同作用,增强彼此益生功能和发酵产物的营养价值^[30]。在此过程中,益生菌数量则被认为是评估不同工艺条件下菌株生长的重要指标,直接反映菌株间的相互作用关系,对于酵母培养物发酵工艺参数的优化和产品品质提升具有重要意义。本试验中,3个试验组酵母培养物中益生菌数量均显著高于CON组,其中AF组和TF组马克斯克鲁维酵母XR4数量显著高于BF组,说明AF组和TF组发酵工艺更能显著提高益生菌数量,从而改善酵母培养物品质。Scheiblauer等^[31]研究发现,酵母菌在固态有氧发酵阶段可以进行充分增殖。在工厂大批量制备酵母培养物的过程中,原料在未经灭菌的条件下可能存在杂菌污染的潜在风险,通过接种优势益生菌种,使其在发酵过程中占据主导地位,可以起到抑制杂菌生长的作用。本试验中,接种的2株酵母菌是发酵优势菌种,能够在好氧条件下通过消耗氧气快速增殖,并在对数生长期,在充足氧气和营养物质支持下通过糖酵解和三羧酸循环高效代谢碳源,从而产生大量ATP和生物合成前体物质。这些前体物质进一步合成氨基酸、核苷酸和脂类,促进细胞快速增殖,使菌种数量显著升高。同时,在此过程中,酵母菌在发酵体系中占据主导地位,通过竞争性利用培养基中的营养物质以及产生抗菌物质,可有效减少杂菌污染^[17]。然而,在本试验中TF组酵母菌数量略低于AF组,这可能与袋装发酵的厌氧条件有关。厌氧环境可能会改变酵母菌的代谢途径,使其从以增殖为主转向以代谢产物合成为主的方向发展,这在一定程度上提高了酵母培养物的营养价值^[17]。此外,由于本试验是在规模化工厂生产条件下进行的,无法实现高温高压灭菌,原料混合过程中搅拌桶内残存的少量菌液和培养基可能与CON组中的发酵原材料混合,导致CON组益生菌数量偏高。

3.4 不同发酵工艺酵母培养物对肉牛瘤胃体外营养物质降解率和发酵参数的影响

营养物质降解率是评价饲粮在瘤胃内降解情况的重要指标。以往研究已证实,添加酵母培养物对体外营养物质降解率有积极影响^[32]。Qi等^[33]研究同样表明,添加酵母培养物对营养物质降解率有显著影响。本试验中,与其他组相比,TF组IVDMD、IVCPD、IVNDFD和IVADFD最高,这表明TF组发酵工艺能显著提高酵母培养物的体外营养物质降解率。这可能是由于一些复杂的碳水化合物、蛋白质等大分子物质被分解成更易被瘤胃微生物利用的小分子物质,同时产生更多的β-葡聚糖、甘露聚糖、牛磺酸等营养活性物质刺激了纤维分解菌活化,促进了底物中营养物质的消化吸收,从而提高了瘤胃体外营养物质降解率。

瘤胃pH是反映瘤胃正常生理功能最直接的指标,其波动与饲粮的组成密不可分,反刍动物瘤胃pH正常范围为5.5~7.5^[34]。有研究指出,酵母培养物可以调节瘤胃pH,提高饲粮消化率^[35]。本试验中,各试验组间发酵液pH虽无显著差异,但均显著高于CON组;且各组发酵液pH变化范围为5.85~5.91,属于正常范围内,这表明添加不同发酵工艺的酵母培养物对瘤胃内环境未产生不利影响。产气量能够在一定程度上反映饲粮的发酵程度、发酵类型以及微生物的活性等^[36]。本试验中,AF组和TF组产气量显著高于BF组和CON组,这表明发酵在有氧条件下进行会促进产气量的升高。这是由于好氧发酵的过程会促进底物发酵以及微生物的增殖,发酵产生的代谢产物能提高瘤胃微生物活性,从而加快微生物对底物的分解利用。NH₃-N与BCP关系密切,NH₃-N是瘤胃微生物利用底物中含氮物质合成BCP的原料,同时也是反映BCP合成能力的重要指标。BCP可以反映瘤胃微生物对NH₃-N的利用程度^[36]。研究表明,瘤胃内NH₃-N含量较为适宜的范围应处在6~30 mg/mL^[37]。本试验中,各组NH₃-N含量均处于正常范围内,且各试验组NH₃-N和BCP含量均不同程度高于CON组,这表明不同发酵工艺制备的酵母培养物不会对瘤胃发酵参数中NH₃-N含量产生不利影响。此外,TF组NH₃-N和BCP含量最高,这是由于其CP含量较高,提供了充足氮源,加快了底物中氮向NH₃-N转化的速度,使得瘤胃微生物能够更充分地利用底物,为BCP的合成供应了充足的资源。

瘤胃VFA可以为反刍动物提供所需能量的70%~80%,且VFA的组成和含量可以反映瘤胃内环境稳定性^[34]。现有研究中,酵母培养物对VFA的影响存在差异,这种不一致性可能源于动物个体差异、发酵底物组成差异、所用发酵菌种以及生产工艺参数差异等多种因素。张炯奇等^[38]研究表明,饲粮中添加酵母复合物可有效提高泌乳早期奶牛体外发酵液中丙酸、戊酸、己酸、异丁酸和异戊酸含量。此外,惠文^[39]对荷斯坦奶牛的研究表明,添加酵母培养物可以提高乙酸、TVFA及BCP含量,这与本试验结果基本一致。本试验中,添加不同发酵工艺的酵母培养物均可提高发酵液中乙酸、戊酸和TVFA含量,这表明酵母培养物可以通过改变瘤胃发酵模式促进肉牛对营养物质的消化吸收,有助于提高肉牛生长性能。推测这可能归因于不同发酵工艺制备的酵母培养物中的酵母菌代谢产物与发酵产生的营养活性物质的相互作用,共同影响了瘤胃内相关微生物的代谢活动,从而改变了瘤胃发酵模式。

4 结论

① 堆积发酵(AF组)有利于提高酵母培养物中花生四烯酸、有机酸含量以及马克斯克鲁维酵母菌XR4数量。

② 袋装发酵(BF组)有利于提高酵母培养物中乳酸、丙酸和总有机酸含量,并降低pH。

③ 两段式发酵(TF组)有利于提高酵母培养物中甘露聚糖、牛磺酸、CP和TCA-SP含量,并提高瘤胃体外发酵BCP、NH₃-N和VFA含量以及产气量和营养物质降解率,是本试验条件下酵母培养物的最佳发酵工艺。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序

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ZHANG

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