动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 12: 8761 - 8774

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.713

研究论文

鸡源抑菌乳酸菌的筛选、生物学特性及益生作用研究

  • 胡新苗 ,
  • 闫晓娜 ,
  • 刘天奇 ,
  • 钟静 ,
  • 张日俊 ,
  • 斯大勇 , *
展开
  • 中国农业大学饲料生物技术实验室, 畜禽营养与饲养全国重点实验室, 北京 100193
* 斯大勇,副教授,博士生导师,E-mail:

胡新苗(2002—),女,甘肃白银人,硕士研究生,研究方向为饲料生物技术。E-mail:

收稿日期: 2025-05-16

  网络出版日期: 2025-12-13

基金资助

国家重点研发计划项目(2023YFD1301300)

收起

Screening, Biological Characteristics and Probiotic Effects of Antibacterial Lactic Acid Bacteria from Chicken Origin

  • HU Xinmiao ,
  • YAN Xiaona ,
  • LIU Tianqi ,
  • ZHONG Jing ,
  • ZHANG Rijun ,
  • SI Dayong , *
Expand
  • State Key Laboratory of Animal Nutrition and Feeding, Feed Biotechnology Laboratory of China Agricultural University, Beijing 100193, China
* associate professor, E-mail:

Received date: 2025-05-16

  Online published: 2025-12-13

Fold

摘要

本试验旨在从鸡肠道内容物中分离筛选出乳酸菌,研究其体外生物学特性,并探究其对小鼠生长和免疫功能的影响。试验采集健康肉鸡肠道内容物,通过分离、筛选和鉴定,获得4株具有良好抑菌能力的菌株(菌株10、82、A7和A62);然后经耐酸、耐胆盐、耐高温、耐胃肠液及疏水性试验等评价其生物学特性;最后以小鼠为试验动物,经过14 d的菌液灌胃和3 d的攻毒试验,研究其对小鼠生长和免疫功能的影响。结果表明:1)16S rRNA基因测序显示,菌株10为加氏乳杆菌,菌株82为敏捷乳杆菌,菌株A7为戊糖片球菌,菌株A62为乳酸片球菌。2)菌株A7和A62的抗逆性较好,菌株82和A62的表面疏水性和自聚力较高。3)4株乳酸菌均显著提高小鼠体重增长(P<0.05);菌株A7和A62显著降低攻毒前小鼠血浆肿瘤坏死因子-α含量(P<0.05);菌株A7显著提高攻毒后小鼠血浆白细胞介素-10含量(P<0.05)。综上所述,本试验得到的戊糖片球菌A7和乳酸片球菌A62具有良好的生物学特性和免疫增强功能,可作为鸡源益生菌的候选菌株。

关键词： 乳酸菌; 筛选; 生物学特性; 小鼠

本文引用格式

胡新苗 , 闫晓娜 , 刘天奇 , 钟静 , 张日俊 , 斯大勇 . 鸡源抑菌乳酸菌的筛选、生物学特性及益生作用研究[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(12) : 8761 -8774 . DOI: 10.12418/CJAN2025.713

Abstract

This experiment aimed to isolate and screen lactic acid bacteria from the intestinal contents of chickens, study their in vitro biological characteristics, and explore their effects on growth and immune function of mice. The intestinal contents of healthy broilers were collected in the experiment. Through isolation, screening and identification, four strains (strains 10, 82, A7 and A62) with good bacteriostatic ability were obtained. Then, their biological characteristics were evaluated through experiments such as acid resistance, bile salt resistance, high temperature resistance, gastrointestinal fluid resistance and hydrophobicity. Finally, mice were used as experimental animals, and after 14 days of intragastric administration of bacterial liquid and 3 days of challenge experiment, the effects on growth and immune function of mice were studied. The results showed as follows: 1) 16S rRNA gene sequencing revealed that strain 10 was Lactobacillus gasseri, strain 82 was Lactobacillus agilis, strain A7 was Pediococcus pentosaceus, and strain A62 was Pediococcus acidilactici. 2) Strains A7 and A62 had better stress resistance, while strains 82 and A62 had higher surface hydrophobicity and automatic aggregation ability. 3) All four strains of lactic acid bacteria significantly increased the weight gain of mice (P<0.05); strains A7 and A62 significantly reduced the plasma tumor necrosis factor-α content in mice before challenge (P<0.05); and strain A7 significantly increased the plasma interleukin-10 content in mice after challenge (P<0.05). In conclusion, the Pediococcus pentosaceus A7 and Pediococcus acidilactici A62 obtained in this experiment possess excellent biological characteristics and immune-enhancing function, and can be used as candidate strains for chicken probiotics.

Key words： lactic acid bacteria; screening; biological characteristics; mice

随着我国畜牧养殖业的规模化发展以及人们对食品安全问题关注度的提高,抗生素作为用于预防疾病、促进生长的饲料添加剂所带来的危害已被社会广泛认识。我国自2020年起已禁止在畜禽饲料中添加抗生素类药物[1],但畜禽饲养过程中各种病原菌如大肠杆菌、沙门氏菌等严重危害畜禽健康,阻碍畜禽养殖业的发展。因此,寻求更加绿色健康的解决畜禽病原菌感染、提高畜禽免疫力的方法迫在眉睫。
世界卫生组织将益生菌定义为:当摄入足够数量时,对宿主健康有益的活的微生物。益生菌的种类很多,概括起来常用的主要有4类:乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌和霉菌[2]。在畜牧养殖业中,益生菌在减少药物使用和无抗养殖方面有着巨大的应用前景,其益生作用主要表现在一方面可以在动物体表或体内黏膜定植,形成一层生物屏障,维持黏膜上的正常菌群比例,调节肠道菌群平衡,增加有益菌数量,抵抗病原菌的入侵[3];另一方面能产生对动物有益的物质,参与动物体的新陈代谢,维持机体健康,因此益生菌的应用对畜禽的集约化养殖和生态养殖具有重要意义。
乳酸菌是应用最早、人们日常生活中经常接触到的一类益生菌,它安全无毒、无致病性,且具有很强的肠道上皮黏附能力,成为生物肠道内的常驻菌群[4]。乳酸菌在畜禽肠道内的定植不仅增加了肠道微生物群落的种类,增强了肠道生态系统的稳定性,还可以提高畜禽的消化吸收能力,增强代谢和免疫反应,缓解机体氧化应激,提高畜禽产品的品质[5-7]。研究发现,在肉鸡饲粮中添加植物乳杆菌显著改善了肉鸡生长性能、免疫力和肠道健康[8];添加戊糖片球菌可以提高肉鸡肉品质,使肉鸡屠宰性能更高、胴体品质更好[9]。乳酸菌能有效改善仔猪由于应激产生的腹泻,显著降低仔猪死亡率[10];德氏乳杆菌OLL1073R-1可以通过产生胞外多糖来刺激猪肠道上皮细胞提高免疫能力,并通过在猪肠道内的定植提高其抵御病毒的潜力[11-12];唾液乳杆菌CICC 23174可通过刺激肠道上皮细胞分泌免疫球蛋白来增强猪机体的免疫力[13]。
乳酸菌是微生态制剂的重要来源。本试验从鸡肠道内容物中分离筛选出乳酸菌,研究了其体外生物学特性,并通过动物试验探究了筛选出的乳酸菌对小鼠生长和免疫功能等的影响,旨在为乳酸菌在畜禽上的应用以及乳酸菌制品的开发提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

用于菌株分离的鸡肠道内容物样品采自中国农业科学院昌平试验基地饲喂正常饲粮的35日龄爱拔益加(AA)肉鸡和35日龄北京油鸡。指示菌为大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、肠出血性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、鸡白痢沙门氏菌CVCC 519、金黄色葡萄球菌CVCC 1882、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、金黄色葡萄球菌ATCC 43300、铜绿假单胞菌ATCC 9027及铜绿假单胞菌ATCC 27853。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌的分离、筛选和鉴定

鸡肠道内容物经悬浮、稀释后涂布于含溴甲酚紫的MRS固体平板上,培养24 h后挑取变黄色菌落在含溴甲酚紫的MRS固体平板上重复划线以纯化细菌,纯化后的细菌经液体培养后取200 μL上清液,采用牛津杯法[14]检测各分离菌株的抑菌能力。抑菌能力较好的菌株使用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN目录号:DP302)提取基因组DNA,测定16S rRNA基因序列,测序结果与NCBI数据库进行BLAST对比分析。

1.2.2 乳酸菌生物学特性

1)生长曲线及pH曲线。将分离纯化的乳酸菌活化3代后,按1%的接种量接种于MRS液体培养基中,37 ℃培养48 h,0~20 h,每隔2 h取一次样;20~36 h,每隔4 h取一次样;48 h时再取一次样。每次取样3个重复,测定pH和600 nm吸光度(OD600)值。
2)菌株的酸耐受能力。用盐酸将MRS培养基的pH分别调为2、3和4后,使用0.22 μm无菌滤膜过滤备用。将活化的乳酸菌种子液按2%接种量接种于不同pH的MRS液体培养基中,37 ℃培养24 h后取样涂板计数,计算菌株存活率[15]。以处理前菌液中活菌数为对照,每个pH处理设3个重复。
3)菌株的胆盐耐受能力。将活化的乳酸菌种子液按2%接种量接种于分别含0.1%、0.3%和0.5%牛胆盐的MRS培养基,37 ℃培养24 h后取样涂板计数。以未加胆盐的MRS培养基为对照,每个浓度梯度设3个重复。
4)菌株的温度耐受能力。将活化的乳酸菌种子液接种于MRS液体培养基,37 ℃培养24 h,取2 mL菌液置于65 ℃水浴1和5 min[16],水浴前及水浴1和5 min后分别取样涂板计数,计算菌株存活率。
5)菌株的胃肠液耐受能力。取5 mL乳酸菌液,5 000×g离心10 min,用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗菌体2次,加入5 mL人工胃液(购自国药集团化学试剂有限公司),37 ℃培养3 h,设3个重复,分别在0和3 h时取样涂板计数;加入4 mL人工肠液(购自国药集团化学试剂有限公司),37 ℃培养3和6 h,设3个重复,分别在0、3和6 h时取样涂板计数,计算菌株存活率。
6)菌株表面疏水性和自聚力。取5 mL乳酸菌液,5 000×g离心10 min,用PBS冲洗菌体2次,加入5 mL PBS缓冲液重悬菌体,并用PBS缓冲液调整菌液吸光度值至0.3~0.6,37 ℃孵育2 h,测定其OD600值。试验重复3次,按照以下公式计算菌株的自聚力:
自聚力(%)=100×(1-At/A0)。
式中:At为2 h吸光度;A0为0 h吸光度。
使用二甲苯检测菌株表面疏水性。取5 mL菌液与1 mL二甲苯混合,使用漩涡振荡仪振荡1 min,37 ℃孵育1 h后测量OD600值。试验重复3次,按照以下公式计算菌株表面疏水性:
表面疏水性(%)=100×(A0-A)/A0。
式中:A0为孵育前的吸光度;A为孵育1 h后的吸光度。
7)菌株与病原菌的共聚力。取乳酸菌液离心、洗涤后加入PBS缓冲液重悬为1.0×108 CFU/mL;活化的病原指示菌经离心、洗涤后加入PBS缓冲液重悬为1.0×108 CFU/mL。取1.5 mL乳酸菌的菌悬液和1.5 mL病原菌的菌悬液吹打混匀,37 ℃共孵育2 h,测定菌液吸光度。试验设3个重复,按照以下公式计算菌株与病原菌的共聚力:
菌株与病原菌的共聚力(%)=100×[1-(Am/(Al+Ap)]。
式中:Am为乳酸菌与病原菌混合液在37 ℃孵育2 h后的吸光度;Al表示乳酸菌在37 ℃孵育2 h后的吸光度;Ap表示病原菌在37 ℃孵育2 h后的吸光度。
8)菌株中抑菌物质的初步鉴定。取5 mL液体培养24 h后的乳酸菌液5 000×g离心10 min,取上清液分别进行如下处理:①热处理,将无菌上清液置于65 ℃水浴加热1 h后冷却至室温;②酸中和处理,用氢氧化钠溶液调节菌液pH至6.2,使用0.22 μm的无菌滤膜过滤取上清液;③蛋白酶K处理,在菌液上清液中加入0.5 mg蛋白酶K(0.1 mg/mL),充分混匀后37 ℃处理30 min;④分别对以上处理的无菌上清液使用牛津杯法测定其抑菌能力。

1.2.3 乳酸菌对小鼠生长和免疫功能的影响

本研究所有动物试验均在中国农业大学动物伦理委员会的批准下进行,批准编号为AW71302202-1-1。
1)动物饲养。选取60只5周龄雄性BALB/C无特定病原体(SPF)小鼠,随机分为5组,分别为MRS培养基组、菌株10菌液组、菌株82菌液组、菌株A7菌液组和菌株A62菌液组,每组12只。适应性饲养7 d后,MRS培养基组小鼠每日灌胃200 μL无菌MRS培养基,其他组每日灌胃200 μL浓度为1.0×109 CFU/mL的对应菌株菌悬液;连续灌胃14 d后,每组各随机抽取6只小鼠,每日灌胃200 μL鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028,浓度为1.0×109 CFU/mL,连续灌胃3 d。
2)生长和免疫功能测定。试验期间,每2 d称量小鼠体重,绘制体重增长曲线;每2 d称量饲粮重量并记录小鼠采食量,计算小鼠的饲料转化率(饲料转化率=100×体重增长/采食量)。试验结束后,摘除小鼠眼球取血,用抗凝管收集血液,4 000×g离心10 min获得上清液,测定各组小鼠血浆白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转化生长因子-β(TGF-β)等细胞因子含量;采用脱颈法处死小鼠,采集脾脏、肾脏(双肾)、肝脏和睾丸,去除多余组织及表面水分,用电子天平称重,计算脏器指数。

1.3 数据统计分析

采用SPSS 22.0软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)程序进行试验数据的处理和分析,采用Duncan氏法进行差异显著性的多重比较,结果以“平均值±标准差”形式表示,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离、筛选和鉴定

2.1.1 菌株的分离

本试验中,通过培养基变色反应从北京油鸡的肠道内容物中共分离得到21株产酸的菌株,在AA肉鸡的肠道内容物中共分离得到22株产酸的菌株。

2.1.2 抑菌能力筛选

本研究首先采用牛津杯法对分离得到的43株菌的抑菌效果进行评价,结果发现菌株4、10、29、82、A7、A62及A69共7株菌的抑菌效果较好;继续选用11株病原菌对初筛的7株菌的抑菌能力进行复筛发现,菌株10、82、A7和A62对11株病原菌均具有较高的抑菌能力(表1),因此,选择这4株菌进行后续试验。
表1 初筛的7株菌对病原菌的抑菌效果

Table 1 Bacteriostatic effects of 7 strains on pathogenic bacteria

病原菌
Pathogenic bacteria		 菌株编号Strain No.
4 10 29 82 A7 A62 A69
S. aureus CVCC 1882 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. aureus ATCC 25923 ++ ++ ++ +++ +++ +++ ++
S. aureus ATCC 6538 ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++
S. aureus ATCC 43300 + + + ++ ++ ++ ++
P. aeruginosa ATCC 9027 ++ ++ ++ +++ ++ +++ ++
E. coli K99 + + + ++ ++ ++ ++
E. coli K88 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
Enterohemorrhagic E. coli + ++ ++ ++ + ++ ++
S. pullorum CVCC 519 ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++
S. typhimurium ATCC 14028 + + + ++ ++ ++ ++
P. aeruginosa ATCC 27853 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++

S. aureus:金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus;P. aeruginosa:铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa;E. coli:大肠杆菌 Escherichia coli;Enterohemorrhagic E. coli:肠出血性大肠杆菌;S. pullorum:鸡白痢沙门氏菌 Salmonella pullorum;S. typhimurium:鼠伤寒沙门氏菌 Salmonella typhimurium。

“+”表示抑菌圈直径为10~14 mm,“++”表示抑菌圈直径为15~19 mm,“+++”表示抑菌圈直径≥20 mm。“+” indicates that the diameter of inhibition zone is 10 to 14 mm, “++” indicates that the diameter of inhibition zone is 15 to 19 mm, and “+++” indicates that the diameter of the inhibition zone is ≥20 mm.

2.1.3 16S rRNA基因测序和菌株鉴定

将菌株的16S rRNA基因测序结果在NCBI上进行BLAST比对,结果显示菌株10与加氏乳杆菌DMBCT6(Lactobacillus gasseri strain DMBCT6,KM056281.1)相似性为99%;菌株82与敏捷乳杆菌DSM 102821(Lactobacillus agilis strain DSM 102821,MN 537457.1)相似性为99%;菌株A7与戊糖片球菌PP(Pediococcus pentosaceus strain PP,HQ286591.1)相似性为99%;菌株A62与乳酸片球菌5127(Pediococcus acidilactici strain 5127,MT463430.1)相似性为99%。因此,初步判定菌株10为加氏乳杆菌,菌株82为敏捷乳杆菌,菌株A7为戊糖片球菌,菌株A62为乳酸片球菌。

2.2 乳酸菌生物学特性

2.2.1 生长曲线及pH曲线

复筛出的4株乳酸菌的生长曲线及pH曲线如图1所示。菌株10在4 h后进入对数生长期,在10 h时生长速度开始减慢,进入平台期;菌株82在4 h后进入对数生长期,在16 h时OD600值达到最高点,之后生长速度减慢,进入平台期;菌株A7在2 h后进入对数生长期,在14 h时生长速度开始减慢,进入平台期;菌株A62在2 h后进入对数生长期,在16 h时OD600值达到最高点,之后生长趋于平缓。
图1 4株乳酸菌的生长曲线及pH曲线

10、82、A7和A62表示菌株编号。下图同。

Fig.1 Growth curve and pH curve of 4 strains of lactic acid bacteria

10, 82, A7 and A62 represent the strain numbers. The same as below.

4株乳酸菌的产酸能力差异不大,其中菌株82、A7和A62发酵后最低pH分别为3.55、3.56和3.48;菌株10的产酸能力稍弱,最低pH为3.92。

2.2.2 菌株的酸耐受能力

4株乳酸菌的酸耐受能力如图2所示。4株乳酸菌的耐酸性良好,在pH为4时的存活率均高于50%,其中菌株A7和A62存活率接近80%;在pH为3时,4株菌的存活率均可达到50%以上;在pH为2时,菌株82的存活率大为降低,而其他3株菌的存活率在37%以上。
图2 4株乳酸菌的酸耐受能力

Fig.2 Acid tolerance of 4 strains of lactic acid bacteria

2.2.3 菌株的胆盐耐受能力

4株乳酸菌的胆盐耐受能力如图3所示。4株乳酸菌在胆盐浓度为0.1%时的生长状况良好,存活率均在80%以上,其中菌株10、A7和A62存活率在90%以上;菌株A7和A62对胆盐的耐受性较好,其中A62的胆盐耐受性最好,在0.5%胆盐浓度下的存活率仍可达60%以上;菌株10和82在高胆盐浓度时存活率明显下降,尤其是菌株82,在胆盐浓度为0.5%时其存活率仅有10%左右。
图3 4株乳酸菌的胆盐耐受能力

Fig.3 Bile salt tolerance of 4 strains of lactic acid bacteria

2.2.4 菌株的温度耐受能力

4株乳酸菌的温度耐受能力如图4所示。在65 ℃下处理1 min,除菌株82外,其他3株菌的存活率均可达到85%以上。但在65 ℃下处理5 min,4株乳酸菌的存活率出现了明显区别,其中菌株82的存活率最低,仅为0.12%左右;菌株A7和10的存活率分别为12%和4%左右;菌株A62的温度耐受性最好,其存活率仍可达到60%以上。
图4 4株乳酸菌的温度耐受能力

Fig.4 Temperature tolerance of 4 strains of lactic acid bacteria

2.2.5 菌株的胃肠液耐受能力

4株乳酸菌的胃液耐受能力如图5所示。在人工胃液中处理3 h,4株乳酸菌对人工胃液耐受性良好,菌株10、82、A7和A62的存活率分别为85.96%、72.63%、86.37%和72.15%。
图5 4株乳酸菌的胃液耐受能力

Fig.5 Gastric fluid tolerance of 4 strains of lactic acid bacteria

4株乳酸菌的肠液耐受能力如图6所示。肠液处理3 h对4株乳酸菌的存活率没有明显影响,各菌株的存活率均在90%以上;肠液处理6 h后,菌株10、82和A7的存活率分别为45.73%、43.16%和38.88%,菌株A62的存活率最高(78.29%)。由此可知,4株乳酸菌对胃肠液有较好的耐受性,可在胃肠道环境中存活。
图6 4株乳酸菌的肠液耐受能力

Fig.6 Intestinal fluid tolerance of 4 strains of lactic acid bacteria

2.2.6 菌株表面疏水性和自聚力

4株乳酸菌的表面疏水性和自聚力如图7所示。不同菌株的表面疏水性和自聚力不同,其中菌株82的表面疏水性在4株乳酸菌中最好,可以达到18.44%;其余3株乳酸菌的表面疏水性均在10%左右。菌株82和A62的自聚力较强,在30%以上;菌株A7和10的自聚力稍差,在20%左右。
图7 4株乳酸菌的表面疏水性和自聚力

Fig.7 Surface hydrophobicity and automatic aggregation ability of 4 strains of lactic acid bacteria

2.2.7 菌株与病原菌的共聚力

4株乳酸菌与病原菌的共聚力如图8所示。菌株A62与病原菌的共聚力最强,可达67.16%,其次为菌株82、A7和10。
图8 4株乳酸菌与病原菌的共聚力

Fig.8 Copolymerization ability of 4 strains of lactic acid bacteria with pathogenic bacteria

2.2.8 菌株抑菌物质鉴定

为研究4株乳酸菌抑菌物质的性质,分别对各菌株的发酵上清液进行了热处理、蛋白酶K处理和pH调整,结果发现(图9),65 ℃处理1 h(图中T标记的抑菌圈)对菌株的抑菌圈基本无影响;蛋白酶K处理(图中M标记的抑菌圈)对抑菌圈也基本无影响;而调整pH后的上清液(图中菌株编号带“'”的抑菌圈)基本无抑菌能力,与空白对照(C0)相同。
图9 乳酸菌上清液的抑菌圈(部分)

C0为空白对照,T表示65 ℃处理1 h,M表示蛋白酶K处理,菌株编号带“'”表示调整pH后。

Fig.9 Inhibition zone of supernatants of lactic acid bacteria (partial)

C0 is blank control, T indicates treatment at 65 ℃ for 1 h, M indicates protease K treatment, and strain number marked with “'” indicates after pH adjusted.

2.3 乳酸菌对小鼠生长和免疫功能的影响

2.3.1 小鼠体重

如图10所示,随着时间的延长,各组小鼠的体重均呈上升趋势。在预试期过后,即第2次(4 d)称重后小鼠的体重增长变缓;第3次(6 d)称重后,小鼠体重开始出现较快增长,直至灌胃乳酸菌结束,且灌胃4株乳酸菌菌液组小鼠体重增长均显著高于MRS培养基组(P<0.05)。如图11所示,在攻毒阶段灌胃病原菌后,MRS培养基组小鼠体重下降明显,而提前灌胃菌株A62菌液的小鼠体重下降较少,且与MRS组差异显著(P<0.05);其他菌液组小鼠体重下降有所缓解,但与MRS培养基组相比无显著差异(P>0.05)。
图10 灌胃乳酸菌后小鼠体重变化曲线和体重增长

数据柱标记不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母或无字母表示无显著差异(P>0.05)。下图同。

Fig.10 Body weight change curve and body weight gain of mice after intragastric administration of lactic acid bacteria

Value columns with different letters mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letters mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

图11 攻毒后小鼠体重变化

+表示病原菌攻毒,表2和图14同。

Fig.11 Changes in body weight of mice after challenge

+ indicates pathogenic bacteria challenge, the same as Table 2 and Fig.14.

2.3.2 小鼠饲料转化率

如图12所示,各组间小鼠饲料转化率无显著差异(P>0.05),灌胃乳酸菌的小鼠饲料转化率从数值上看略高于MRS培养基组。
图12 小鼠饲料转化率

Fig.12 Feed conversion rate of mice

2.3.3 小鼠脏器指数

由表2可知,灌胃乳酸菌对小鼠脏器指数有显著影响(P<0.05)。在给小鼠灌胃鼠伤寒沙门氏菌后,各组小鼠的肝脏指数与未灌胃病原菌组相比均显著提高(P<0.05);病原菌除对菌株10菌液组小鼠脾脏指数无显著影响(P>0.05)外,均显著提高灌胃其他3株乳酸菌菌液小鼠的脾脏指数(P<0.05)。同时,除睾丸指数外,与MRS培养基组相比,各乳酸菌菌液组小鼠脏器指数无显著差异(P>0.05)。
表2 小鼠脏器指数

Table 2 Organ indices of mice %

处理
Treatments		 肝脏指数
Liver index		 肾脏指数
Kidney index		 睾丸指数
Testis index		 脾脏指数
Spleen index
10 3.987±0.217c 1.431±0.081b 0.858±0.047bc 0.325±0.032c
82 4.151±0.187c 1.472±0.106ab 0.835±0.077bc 0.326±0.023c
A7 4.090±0.265c 1.503±0.084ab 0.825±0.098bc 0.348±0.041c
A62 4.057±0.211c 1.439±0.120b 0.821±0.031bc 0.341±0.016c
MRS 3.920±0.240c 1.511±0.111ab 0.858±0.072bc 0.346±0.052c
10+ 4.545±0.304b 1.516±0.134ab 0.805±0.065c 0.373±0.035bc
82+ 4.931±0.355a 1.508±0.105ab 0.869±0.067bc 0.465±0.062a
A7+ 4.491±0.304b 1.461±0.066ab 0.861±0.050bc 0.407±0.061b
A62 4.643±0.184ab 1.458±0.058ab 0.883±0.050b 0.423±0.090ab
MRS+ 4.817±0.296ab 1.568±0.095a 0.970±0.084a 0.421±0.038ab

同列数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05),不同字母表示差异显著(P<0.05)。

In the same column, values with the same letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.3.4 小鼠血浆免疫指标

如图13所示,与MRS培养基组相比,菌株10菌液组小鼠血浆IL-10含量有所提高,但差异不显著(P>0.05);各乳酸菌菌液组血浆TGF-β含量均有所提高,其中菌株10菌液组血浆TGF-β含量显著提高(P<0.05);对于促炎细胞因子,各乳酸菌菌液组血浆TNF-α含量均有所降低,其中菌株A7和A62菌液组血浆TNF-α含量显著降低(P<0.05)。
图13 小鼠攻毒前血浆免疫指标

Fig.13 Plasma immune indices of mice before challenge

如图14所示,在给小鼠灌胃鼠伤寒沙门氏菌后,与MRS培养基组相比,各乳酸菌菌液组小鼠血浆IL-10含量均有所提高,其中菌株A7菌液组血浆IL-10含量显著提高(P<0.05);菌株82、A7和A62菌液组血浆TGF-β含量有所提高,血浆TNF-α含量有所降低,但差异均不显著(P>0.05)。
图14 小鼠攻毒后血浆免疫指标

Fig.14 Plasma immune indices of mice after challenge

3 讨论

3.1 乳酸菌的分离、筛选和鉴定

本研究从鸡肠道内容物中初步分离筛选得到43株产酸细菌,通过抑菌试验进一步筛选得到4株能够抑制多种病原菌且抑菌能力较强的菌株,即菌株10、82、A7和A62。16S rRNA基因分子技术的应用使乳酸菌的鉴定更加准确便捷,是目前细菌分类和鉴定常使用的方法[17],通过16S rRNA基因序列比对鉴定4株菌分别为加氏乳杆菌、敏捷乳杆菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌。
抑菌能力是益生菌所具有的一个重要特征。研究表明,乳酸菌可产生乳酸、乙酸等有机酸,显著降低环境中pH和氧化还原电位的值,使环境保持酸性,对致病菌如痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、弯曲杆菌和葡萄球菌等有拮抗作用[18]。Soleimani等[19]研究发现,植物乳杆菌ATCC 8014能够抑制分离于乳腺炎中的金黄色葡萄球菌,具有防治牛乳腺炎的作用。李斐然[20]研究发现,牦牛源戊糖片球菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抑制作用。于翠芳等[21]从发酵食品中分离出7株乳酸菌,其中4株对金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用。本试验结果表明,菌株A7和A62对金黄色葡萄球菌的抑制效果较好,抑菌圈直径分别可达20.4和21.5 mm。郭奇苑等[22]从15日龄健康犊牛的肠道黏膜和食糜中分离得到4株乳酸菌,对大肠杆菌的抑制圈直径可达16~21 mm。本试验测得对大肠杆菌抑制能力较强的菌株为A7和A62,抑菌圈直径分别为17.71和17.86 mm;同时,试验发现菌株82对沙门氏菌的抑制效果最好,抑菌圈直径可达21.7 mm。

3.2 乳酸菌生物学特性

菌株的生长曲线反映了细菌数量、生长状况和代谢情况等多种指标[23]。菌株的pH曲线在一定程度上可以反映菌株的产酸能力,酸度越大即产酸能力越强,环境的pH也会随之降低[24]。乳酸菌发酵产酸是其具备抑菌能力的关键。本试验结果显示,4株乳酸菌产酸能力最强的是菌株A62,其次是菌株82,且它们的抑菌能力也较强。研究发现,加氏乳杆菌IMAUFB017的生长曲线在4 h后进入对数生长期,在14 h时进入稳定期;而经过优化后的菌株在2 h时进入对数生长期,12 h后进入稳定期,同时优化后的菌株在培养12 h后产酸能力pH约为4.1[25]。孙禹等[26]对来源于海兰褐蛋鸡盲肠中的乳酸菌进行生理测定,结果显示,敏捷乳杆菌在4~10 h为对数生长期,繁殖迅速。何江波[27]对来源于黑藏羊和白绒山羊瘤胃中的乳酸菌进行测定,结果表明8株戊糖片球菌在4 h后进入对数生长期,16 h后进入平稳期,pH最终均低于4.0。本试验发现,菌株10在4 h时进入对数生长期,在12 h时OD600值达到了6.66,并在12 h后进入生长稳定期,pH最终为3.92;菌株82在4 h时进入对数生长期,在16 h时到达最高点,OD600值为6.50,并在16 h后生长曲线出现小幅度下降后趋于平稳,pH最终为3.56;菌株A7和A62都在2 h时进入对数生长期,分别在14和16 h时达到生长最高点,OD600值分别为6.26和6.74,pH最终分别为3.56和3.48。菌株生长曲线在变化过程中出现下降趋势主要是因为在培养过程中菌体消耗培养基中的营养物质,同时细菌发酵产生的代谢产物积累,抑制了菌体的生长,使其繁殖速度减慢,还可能导致细菌自溶,从而使生长曲线下行。由菌株的生长曲线可以看出菌株的对数生长期,这对菌株接种和发酵时间的确定有重要参考意义。
乳酸菌进入动物体内需经过畜禽的胃肠道,胃肠道内有着大量的消化酶,大部分生物胃内的pH为3.5左右,而乳酸菌的有效活菌数和菌株活性是其在体内发挥作用的前提。乳酸菌若要到达肠道并定植发挥作用,必须能够耐受机体的防御机制,其中胃酸的杀伤力最强,其次是胆汁酸,因此菌株在胃酸、胆汁酸、胃液、肠液以及胆盐中的耐受性和存活率是其成为益生菌的必要条件,能够通过低pH胃液和高胆盐并存活下来,这要求乳酸菌具有较强的耐受胃酸和胆汁的能力[28]。本研究中,4株乳酸菌在pH为2.0的环境中均可以生长,菌株82的存活率可以达到17.66%,且其他3株乳酸菌的耐受效果更好,存活率可以达到30%以上;菌株A62对低pH耐受最好,在pH为3.0时的存活率可达60%以上。同时,各菌株在人工胃液中处理3 h后存活率均可达到70%以上,在人工肠液中处理3 h后存活率均可达到90%以上,且在人工肠液中处理6 h后存活率均可达到38%以上。其中,菌株A7对人工胃液的耐受性最好,存活率可达86.37%;菌株A62对人工肠液的耐受性最好,肠液处理6 h后存活率达78.29%。此外,不同浓度的胆盐处理时,在胆盐浓度为0.1%时4株菌均生长良好,存活率均在80%以上;在胆盐浓度为0.5%时,菌株A62的存活率在60%以上,菌株A7的存活率在50%以上,菌株10和82的存活率明显下降,分别为19.37%和11.77%,但仍可存活。由此可知,菌株A7和A62对胆盐的耐受性较好,其中A62的胆盐耐受性最好。
在菌株实际应用于规模化养殖时,菌株对高温的耐受能力是影响菌株使用的重要因素。张媛媛等[29]对犬源乳酸片球菌GLP236的研究发现,其具有较好的耐高温特性。本试验发现,在65 ℃下处理1 min,菌株A62的存活率为90%左右;在65 ℃下处理5 min,存活率仍可以达到60%以上,表明乳酸片球菌A62具有较好的高温耐受能力。
研究表明,菌株的自聚力和表面疏水性与菌株的黏附力有关[30]。菌株的自聚力是指菌株在液体中凝结成团的能力,其可以增加菌株在肠道内的定植几率。菌株的黏附力可增强菌株与病原菌的聚合能力,减轻肠道中病原菌对机体的伤害,同时增加菌株在肠道中定植的几率,有利于维护肠道健康。Ehrmann等[31]研究表明,乳杆菌的表面疏水性与其黏附能力高度相关,表面疏水性越高的细菌其黏附力越强,反之,细菌的黏附力较低。本研究结果表明,菌株的表面疏水性以菌株82最好,菌株的自聚力以及与病原菌的共聚力均以菌株82和A62较强。

3.3 乳酸菌对小鼠生长和免疫功能的影响

研究发现,在肉鸡的饮水中添加双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌可以提高肉鸡平均日采食量和平均日增重,使其体重增加[32]。在仔猪饲粮中添加乳酸片球菌FT28和嗜酸性乳杆菌NCDC15可以提高仔猪饲料转化率,增加仔猪体重[33]。周建东等[34]发现,饲粮中添加戊糖片球菌能显著提高肉鸡体重、平均日增重、粗蛋白质消化率和脾脏指数,降低料重比。Lele等[35]研究表明,奶牛饲粮中添加戊糖片球菌够促进其生长,提高采食量和产奶量。本试验结果显示,在灌胃乳酸菌后,各菌液组小鼠体重均呈上升的趋势,且与MRS培养基组相比,4株菌株菌液组小鼠体重增长均显著提高,其中灌胃菌株10菌液对小鼠体重增长的促进作用较明显,且灌胃乳酸菌能减少病原菌攻毒导致的小鼠体重下降。同时,灌胃乳酸菌小鼠的饲料转化率均高于MRS培养基组。
试验动物的内脏器官重量和脏器指数的差异在一定程度上可以显示动物体内组织的变化。脏器指数降低可能表示脏器萎缩退化,而脏器指数提高可能与脏器水肿、充血及增生肥大等变化有关[36]。在正常的饲喂条件下,小鼠体重增加,各脏器重量也会增加,但脏器指数会随着体重的增加而降低[37]。本研究发现,在灌胃病原菌后,小鼠体重明显下降,各脏器指数明显增大,这一方面可能是因小鼠攻毒后其采食量减少,体重降低;另一方面,小鼠的肝脏、肾脏、脾脏和睾丸等脏器出现水肿、充血、炎症等,造成小鼠脏器指数提高。而灌胃乳酸菌的小鼠脏器指数与灌胃MRS培养基的小鼠相比差异不显著,表明4株乳酸菌对小鼠脏器系数无显著影响。
研究发现,乳酸菌具有免疫活性,不仅能增强黏膜免疫功能,对系统免疫功能也有调节作用[38]。乳酸菌能够维系肠道内的菌群平衡,通过刺激产生的抗菌物质能抑制有害细菌在肠道的生长,增强免疫功能[39]。TNF-α被认为是炎症反应中的重要炎性介质,TNF-α含量过高会引起全身性的炎症反应,对肝脏、肺脏和脾脏等器官产生损害作用[40]。近年来研究发现,TGF-β对细胞的生长、分化和免疫功能起着重要的调节作用。IL-10是抑炎细胞因子,也是抗炎活性研究中重要的抗炎和免疫抑制因子[41]。研究发现,牦牛肠黏膜上分离出来的屎肠球菌G2可以降低肠道内促炎细胞因子TNF-α的mRNA表达,提高小鼠肠道的免疫能力[42]。敏捷乳杆菌与唾液乳杆菌联用可以缓解脂多糖诱导引起的促炎细胞因子TNF-α和白细胞介素-6(IL-6)的上调,增强机体的免疫能力[43]。Khan等[44]研究发现,敏捷乳杆菌具有提高机体抗氧化能力及抗炎的作用。Hanna等[45]研究发现,加氏乳杆菌阻止了幽门螺旋杆菌感染的巨噬细胞中促炎因子TNF-α和IL-6的产生,从而抑制机体炎症反应的发生。本试验结果显示,对小鼠灌胃14 d并经病原菌攻毒后,小鼠血浆细胞因子含量有所差异,菌株82、A7和A62均上调了血浆抑炎细胞因子IL-10和TGF-β含量,下调了促炎细胞因子TNF-α含量;其中菌株A7对抑炎因子IL-10的上调作用以及对促炎细胞因子TNF-α的下调作用均最明显,其次为菌株A62。结果表明,4株乳酸菌中菌株82、A7和A62有增强小鼠免疫功能的作用,且戊糖片球菌A7对增强小鼠免疫能力效果最好,乳酸片球菌A62增强小鼠免疫能力的效果较好。

4 结论

本试验从鸡肠道内容物中分离筛选出4株对多种病原菌有抑菌能力的乳酸菌菌株,经16S rRNA基因测序鉴定分别为加氏乳杆菌、敏捷乳杆菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌;其中,戊糖片球菌A7和乳酸片球菌A62具有良好的生物学特性和免疫增强功能,可作为鸡源益生菌的候选菌株。

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