动物营养学报 >

2026 , Vol. 38 >Issue 1: 780 - 790

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.060

研究论文

菌酶协同处理对高湿玉米青贮品质及贮藏蛋白质特性的影响

  • 黄钰 , 1 ,
  • 王磊 1 ,
  • 陈肖 1 ,
  • 李英齐 2 ,
  • 熊亚楠 1 ,
  • 王召明 3 ,
  • 郭玉平 4 ,
  • 高林 4 ,
  • 王玫 4 ,
  • 玉柱 , 1, *
展开
  • 1 中国农业大学草业科学与技术学院,北京 100193
  • 2 中国农业大学动物科学技术学院,畜禽营养与饲养全国重点实验室,北京 100193
  • 3 国家草业技术创新中心(筹),呼和浩特 010060
  • 4 朔州市骏宝宸农业科技股份有限公司,山阴 036900
* 玉柱,教授,博士生导师,E-mail:

黄钰(2004—),女,广西钦州人,本科生,研究方向为饲草加工与利用。E-mail:

收稿日期: 2025-05-30

  网络出版日期: 2026-01-13

基金资助

国家重点研发计划“政府间国际科技创新合作”重点专项(2022YFE0111000)

2023年国家草业技术创新中心(筹)重大创新平台建设专项“优质饲草生产与草产品加工关键技术研发及示范”(CCPTZX2023B07)

收起

Effects of Microbial-Enzyme Synergistic Treatment on Silage Quality and Storage Protein Characteristics of High-Moisture Corn

  • HUANG Yu , 1 ,
  • WANG Lei 1 ,
  • CHEN Xiao 1 ,
  • LI Yingqi 2 ,
  • XIONG Ya’nan 1 ,
  • WANG Zhaoming 3 ,
  • GUO Yuping 4 ,
  • GAO Lin 4 ,
  • WANG Mei 4 ,
  • YU Zhu , 1, *
Expand
  • 1 College of Grassland Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
  • 2 State Key Laboratory of Animal Nutrition and Feeding, College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
  • 3 National Grassland Technology Innovation Center (Preparatory), Hohhot 010060, China
  • 4 Junbaochen of Shuozhou City Agricultural Science and Technology Co., Ltd., Shanyin 036900, China
* professor, E-mail:

Received date: 2025-05-30

  Online published: 2026-01-13

Fold

摘要

本试验旨在研究菌酶协同处理对高湿玉米青贮品质及贮藏蛋白质特性的影响,为缓解高湿玉米中淀粉-蛋白质基质对反刍动物瘤胃消化的限制效应提供参考。试验以完熟期玉米籽粒为原料,设置对照组(CON组)、乳酸菌添加组(LB组)、木瓜蛋白酶添加组(PAP组)以及乳酸菌和木瓜蛋白酶联合添加组(LB+PAP组),其中乳酸菌[布氏乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)]添加量为1×106 CFU/g FM、木瓜蛋白酶添加量为600 U/g FM,每组3个重复,分别于发酵60和180 d后开袋取样,测定高湿玉米发酵品质、营养成分含量以及蛋白质成分和二级结构变化。结果表明:1)发酵180 d时,与CON组相比,LB+PAP组乳酸和丙酸含量显著提高(P<0.05)。2)各组发酵180 d时醇溶蛋白和谷蛋白含量均显著低于发酵60 d时(P<0.05),且LB+PAP组发酵180 d时醇溶蛋白和谷蛋白含量较低;同时,随着发酵时间的延长,中性洗涤不溶蛋白质、白蛋白和球蛋白含量显著降低(P<0.05),氨态氮含量显著提高(P<0.05)。此外,LB+PAP组氨态氮含量显著高于其他组(P<0.05)。3)傅里叶变换红外光谱分析发现,酰胺带Ⅰ吸光度随发酵时间的延长而降低,LB+PAP组在2个发酵时间点均具有最低的吸光度;同时,与CON组相比,LB+PAP组发酵60 d时β折叠占比显著降低(P<0.05),发酵60 d时β转角和发酵180 d时无规则卷曲占比显著提高(P<0.05)。综上所述,菌酶协同处理能够促进淀粉-蛋白质基质结构的降解,重构蛋白质二级网络结构,提高高湿玉米的青贮品质。

关键词： 高湿玉米; 厌氧发酵; 菌酶协同; 蛋白质特性

本文引用格式

黄钰 , 王磊 , 陈肖 , 李英齐 , 熊亚楠 , 王召明 , 郭玉平 , 高林 , 王玫 , 玉柱 . 菌酶协同处理对高湿玉米青贮品质及贮藏蛋白质特性的影响[J]. 动物营养学报, 2026 , 38(1) : 780 -790 . DOI: 10.12418/CJAN2026.060

Abstract

This experiment aimed to investigate the effects of microbial-enzyme synergistic treatment on silage quality and storage protein characteristics of high-moisture corn, providing a reference for alleviating the restrictive effect of starch-protein matrix on rumen digestion in ruminants. The experiment used fully mature corn kernels as raw materials and set up the control group (CON group), the lactic acid bacteria addition group (LB group), the papain addition group (PAP group), and the combined of lactic acid bacteria and papain addition group (LB+PAP group). Among them, the addition amount of lactic acid bacteria (Lentilactobacillus buchneri) was 1×106 CFU/g FM, and the addition amount of papain was 600 U/g FM. There were 3 replicates in each group. Samples were taken after 60 and 180 days of fermentation respectively to determine the fermentation quality, nutrient contents, protein components and secondary structure changes of high-moisture corn. The results showed as follows: 1) at 180 days of fermentation, compared with CON group, the contents of lactic acid and propionic acid in LB+PAP group were significantly increased (P<0.05). 2) The contents of zein and glutenin in each group at 180 days of fermentation were significantly lower than those at 60 days of fermentation (P<0.05), and the contents of zein and glutenin in LB+PAP group were lower at 180 days of fermentation. Meanwhile, with the extension of fermentation time, the contents of neutral detergent insoluble protein, albumin and globulin were significantly decreased (P<0.05), and the ammonia nitrogen content was significantly increased (P<0.05). In addition, the ammonia nitrogen content in LB+PAP group was significantly higher than that in the other groups (P<0.05). 3) Fourier transform infrared spectroscopy analysis revealed that the absorbance of amide band Ⅰ was decreased with the extension of fermentation time, and LB+PAP group had the lowest absorbance at both fermentation time points. Meanwhile, compared with CON group, the β sheet proportion in LB+PAP group was significantly reduced at 60 days of fermentation (P<0.05), and the proportions of β turn at 60 days of fermentation and random coil at 180 days of fermentation were significantly increased (P<0.05). In conclusion, the microbial-enzyme synergistic treatment can promote the degradation of the starch-protein matrix structure, reconstruct the secondary network structure of protein, and improve the silage quality of high-moisture corn.

Key words： high-moisture corn; anaerobic fermentation; microbial-enzyme synergy; protein characteristics

玉米作为我国粮食安全战略的核心作物,在畜牧业中占据着重要地位,其饲用消费量占全国玉米总量的70%以上。数据显示,2024年我国玉米种植面积为44 740.7×103 hm2,总产量达到29 492.0万t[1]。近年来,随着我国畜禽养殖的规模化发展,以玉米为主的饲料粮供需矛盾日益凸显,预计2025年饲用玉米缺口将突破2 000万t[2]。因此,聚焦饲料加工环节、推动发展高效饲料加工技术成为破解资源约束的关键路径。高湿玉米是在玉米籽实含水量为25%~35%时脱粒粉碎,在厌氧环境下经发酵得到的青贮精饲料,与传统的压片玉米和玉米粉相比,具有成本低、操作方便、保存时间长及营养价值损失少等优点[3]。目前在美国、巴西等国家,以高湿玉米为主要精饲料等的饲粮广泛应用于牛、羊、猪和鸡等畜禽养殖中[4],显著提高了牛、羊对营养物质的消化率及奶牛的产奶量[5]。因此,探索高湿玉米这类新型能量饲料对于推动我国节粮型畜牧业发展具有重要作用。
饲料玉米淀粉提供的能量占玉米总能量的60%以上,高湿玉米胚乳中淀粉和蛋白质的结构直接影响其消化率和营养价值[6-7]。由于高湿玉米具有较高含量的可溶性粗蛋白质,其疏水性的蛋白质基质和淀粉结合后形成淀粉-蛋白质基质结构,构成淀粉颗粒与反刍动物瘤胃微生物间的物理化学屏障,影响了淀粉的消化性能,降低了反刍动物的营养消化率和饲料转化率[8]。添加酶制剂和菌剂可促进对蛋白质的水解。酶制剂和菌剂有机结合使蛋白酶与发酵中微生物的酶解体系形成良好的协同作用,可提高蛋白质底物的水解度和消化性,菌酶协同发酵在提高玉米蛋白粉消化率中已有良好表现[9]。
在高湿玉米饲料生产过程中,因其淀粉含量高、水分适宜微生物活动,可利用添加剂避免酵母菌、霉菌等微生物大量繁殖引起玉米霉变。现阶段,青贮添加剂一般采用苯甲酸、山梨酸钾等有机酸及其盐类、乳酸菌类发酵剂等[10]。相较于同型发酵乳酸菌,异型发酵乳酸菌在产生乳酸(lactic acid,LA)的同时能够产生乙酸(acetic acid,AA),从而快速降低pH,促进原有乳酸菌的启动,有利于抑制发酵过程中真菌的生长,维持饲料品质[11]。添加外源蛋白酶可提高原有蛋白酶水解活性,提高氨态氮(ammonia nitrogen,AN)和可溶性蛋白质含量,短时间内显著提高高湿玉米的营养价值和消化率[12]。
傅里叶变换红外光谱(FTIR)法是一种非破坏性测试方法,其通过测量物质官能团和极性键振动对特定波长红外光的吸收情况,来确定物质的化学成分和结构信息。与X射线-晶体衍射(XRD)法、圆二色谱(CD)法等蛋白质结构表征方法相比,FTIR法具有样品要求低、使用范围广等优点,能够做到保持样品完整性的同时进行检测[13],已被应用于研究玉米-豆粕型饲粮以及小麦、大豆等饲料的蛋白质分子结构[14-16]。FTIR主要功能区酰胺带Ⅰ包含的蛋白质二级结构信息,在研究蛋白质二级结构中发挥重要作用,通过分析高湿玉米青贮过程蛋白质分子结构,可预测其营养价值[17]。
基于此,本研究以高湿玉米的品质提升和优化利用为目标,系统探讨了短期、长期贮藏下不同处理对高湿玉米发酵品质、营养成分、贮藏蛋白质组分及蛋白质构象的影响,通过比较单一添加乳酸菌、酶以及菌酶协同作用对高湿玉米青贮品质的综合影响,以期为高湿玉米青贮工艺的精准调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用玉米种植地点为山西省朔州市右玉县,品种为瑞丰168,于完熟末期收获经脱粒、粉碎后得到高湿玉米原料。乳酸菌[布氏乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)]添加剂由中国农业大学牧草加工实验室筛选,木瓜蛋白酶购于上海麦克林生化科技股份有限公司。

1.2 试验设计

以破碎完成的玉米籽粒为原料,施用添加剂后装入3 L的青贮桶中,压实密度为1 000 kg/m3,设置对照组(CON组)、乳酸菌添加组(LB组)、木瓜蛋白酶添加组(PAP组)以及乳酸菌和木瓜蛋白酶联合添加组(LB+PAP组),其中乳酸菌添加量为1×106 CFU/g FM、木瓜蛋白酶添加量为600 U/g FM,每组3个重复,分别于发酵60和180 d后开袋取样分析。

1.3 测定指标及方法

取150 g高湿玉米样品于65 ℃烘箱内烘干48 h后粉碎,制成烘干样,采用GB/T 20194—2018中方法测定淀粉含量;采用GB/T 6435—2014中方法测定干物质(dry matter,DM)含量;采用GB/T 6432—2018中方法测定粗蛋白质(crude protein,CP)含量;采用AOAC法(方法981.10)[18]测定粗脂肪(ether extract,EE)含量;采用范氏(Van Soest)洗涤纤维法[19]测定中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)和中性洗涤不溶蛋白质(neutral detergent insoluble protein,NDIP)含量;采用Osborne[20]的方法提取并采用凯氏定氮法(GB/T 6432—2018)测定白蛋白(albumin,ALB)、醇溶蛋白(zein)、球蛋白(globulin,GLB)和谷蛋白(glutenin,GLU)含量。
取25 g高湿玉米样品和225 mL无菌水加入具塞三角瓶,于4 ℃摇床中浸提12 h,取出后用4层纱布过滤得到浸提液,使用pH计测定其pH;采用高效液相色谱法[21]测定乳酸、乙酸和丙酸(propanoic acid,PA)含量;采用分光光度计比色法[22]测定氨态氮含量。
采用FTIR仪扫描高湿玉米冻干粉样,波数为400~4 000 cm-1,分辨率为4 cm-1,累计扫描32次,使用Omnic 9软件对所得光谱进行基线校正和自动平滑,通过Peakfit 4.1软件对酰胺带Ⅰ进行去卷积,根据去卷积光谱中各个二级结构特征峰的面积计算玉米样品蛋白质α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲占比。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2021软件对所测数据进行整理,采用Origin 2022软件绘制相关数据图。采用SPSS 26.0统计软件的ANOVA过程进行单因素方差分析,以P<0.05作为显著性判断标准,当添加剂和发酵时间互作效应显著时,只分析添加剂和发酵时间互作下指标的差异显著性;当互作效应不显著时,分别分析不同添加剂或不同发酵时间处理下指标的差异显著性。

2 结果

2.1 高湿玉米原料营养成分含量

高湿玉米原料营养成分含量见表1。
表1 高湿玉米原料营养成分含量

Table 1 Nutrient contents in high-moisture corn raw materials % DM

项目Items 含量Content
粗蛋白质CP 8.64±0.43
中性洗涤不溶蛋白质NDIP 4.98±0.50
淀粉Starch 70.39±2.13
中性洗涤纤维NDF 8.30±0.71
酸性洗涤纤维ADF 1.95±0.13
白蛋白ALB 0.87±0.01
醇溶蛋白Zein 4.57±0.12
球蛋白GLB 0.63±0.01
谷蛋白GLU 2.43±0.05

2.2 不同发酵时间和添加剂处理下高湿玉米发酵品质和营养成分含量

由表2可知,发酵时间与添加剂对高湿玉米pH以及乳酸、乙酸和丙酸含量均有显著互作效应(P<0.05)。随着发酵时间的延长,高湿玉米pH以及乳酸和丙酸含量提高,乙酸含量降低。发酵60 d时,各添加剂处理组乳酸和丙酸含量与CON组相比无显著差异(P>0.05),LB+PAP组乙酸含量显著高于CON组(P<0.05);发酵180 d时,LB+PAP组乳酸和丙酸含量最高,乙酸含量较低。
表2 不同发酵时间和添加剂处理下高湿玉米发酵品质

Table 2 Fermentation quality of high-moisture corn under different fermentation time and additive treatments

项目
Items		 pH 乳酸
LA/% DM		 乙酸
AA/% DM		 丙酸
PA/% DM
发酵时间Fermentation time/d 组别Groups
60 CON 3.92bc 1.61c 0.46bc 0.79c
LB 3.93bc 1.64c 0.45bc 0.83c
PAP 3.89c 1.69c 0.51ab 1.02c
LB+PAP 3.89c 1.69c 0.55a 1.13c
180 CON 3.93bc 2.08bc 0.38cd 3.60b
LB 3.95ab 2.54ab 0.34d 4.00b
PAP 4.00a 2.37b 0.38cd 5.07a
LB+PAP 3.94bc 2.94a 0.34d 5.53a
均值标准误SEM 0.008 0.103 0.016 0.396
平均值Mean
发酵时间Fermentation time/d 60 3.91 1.66 0.49 0.94
180 3.95 2.49 0.36 4.55
组别Groups CON 3.93 1.85 0.42 2.20
LB 3.94 2.09 0.40 2.41
PAP 3.94 2.03 0.45 3.04
LB+PAP 3.92 2.32 0.45 3.33
P值P-value
发酵时间Fermentation time <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
添加剂Additive 0.113 0.006 0.023 <0.001
发酵时间×添加剂Fermentation time×additive 0.002 0.019 0.003 <0.001

同列数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05),不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same column, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

由表3可知,发酵时间和添加剂以及二者的互作效应对高湿玉米淀粉、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量均无显著影响(P>0.05)。
表3 不同发酵时间和添加剂处理下高湿玉米营养成分含量

Table 3 Nutrient contents in high-moisture corn under different fermentation time and additive treatments % DM

项目
Items		 淀粉
Starch		 中性洗涤纤维
NDF		 酸性洗涤纤维
ADF
发酵时间Fermentation time/d 组别Groups
60 CON 67.94 6.63 1.79
LB 68.36 7.50 1.86
PAP 71.00 7.73 1.92
LB+PAP 69.05 7.53 2.19
180 CON 70.38 8.06 2.43
LB 68.75 7.82 2.38
PAP 69.67 6.90 2.16
LB+PAP 70.25 6.93 2.16
均值标准误SEM 0.349 0.163 0.116
平均值Mean
发酵时间Fermentation time/d 60 69.09 7.35 1.94
180 69.76 7.43 2.28
组别Groups CON 69.16 7.34 2.11
LB 68.55 7.66 2.12
PAP 70.33 7.32 2.04
LB+PAP 69.65 7.23 2.17
P值P-value
发酵时间Fermentation time 0.328 0.795 0.195
添加剂Additive 0.318 0.783 0.986
发酵时间×添加剂Fermentation time×additive 0.279 0.081 0.791

2.3 不同发酵时间和添加剂处理下高湿玉米蛋白质成分含量

由表4可知,发酵时间与添加剂对高湿玉米粗蛋白质、醇溶蛋白和谷蛋白含量有显著互作效应(P<0.05);LB+PAP组发酵180 d时醇溶蛋白和谷蛋白含量较低,均显著低于CON组发酵60 d时(P<0.05)。发酵时间对高湿玉米氨态氮、中性洗涤不溶蛋白质、白蛋白和球蛋白含量有显著影响(P<0.05),其中发酵180 d时氨态氮含量显著高于发酵60 d时(P<0.05),发酵180 d时中性洗涤不溶蛋白质、白蛋白和球蛋白含量显著低于发酵60 d时(P<0.05)。添加剂对高湿玉米氨态氮和中性洗涤不溶蛋白质含量有显著影响(P<0.05),其中LB+PAP组氨态氮含量显著高于CON组(P<0.05),PAP组中性洗涤不溶蛋白质含量显著低于CON组(P<0.05)。
表4 不同发酵时间和添加剂处理下高湿玉米蛋白质成分含量

Table 4 Protein component contents in high-moisture corn under different fermentation time and additive treatments

项目
Items		 氨态氮
AN/%
TN		 粗蛋白质
CP/%
DM		 中性洗涤
不溶蛋白质
NDIP/% DM		 白蛋白
ALB/%
DM		 醇溶蛋白
Zein/%
DM		 球蛋白
GLB/%
DM		 谷蛋白
GLU/%
DM
发酵时间Fermentation time/d 组别Groups
60 CON 2.94 8.63ab 2.56 0.79 4.11a 0.55 2.14ab
LB 2.48 8.86a 2.35 0.78 4.05a 0.53 2.27a
PAP 3.43 8.93a 1.14 0.81 4.09a 0.55 2.03b
LB+PAP 4.42 8.31c 2.07 0.78 3.87a 0.51 1.81c
180 CON 4.81 8.14c 2.09 0.46 3.24b 0.29 1.46d
LB 4.93 8.57ab 1.11 0.48 3.44b 0.29 1.47d
PAP 4.53 8.31c 1.19 0.47 3.20b 0.29 1.42d
LB+PAP 5.91 8.49ab 1.40 0.46 3.22b 0.29 1.32d
均值标准误SEM 0.248 0.062 0.151 0.034 0.083 0.026 0.073
平均值Mean
发酵时间
Fermentation time/d		 60 3.32b 8.68 2.03a 0.79a 4.03 0.53a 2.06
180 5.04a 8.38 1.45b 0.47b 3.27 0.29b 1.42
组别Groups CON 3.88b 8.39 2.33a 0.63 3.67 0.42 1.80
LB 3.70b 8.71 1.73ab 0.63 3.75 0.41 1.87
PAP 3.98b 8.62 1.17b 0.64 3.65 0.42 1.72
LB+PAP 5.16a 8.40 1.74ab 0.62 3.54 0.40 1.56
P值P-value
发酵时间Fermentation time <0.001 0.001 0.026 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
添加剂Additive 0.004 0.014 0.027 0.221 0.015 0.353 <0.001
发酵时间×添加剂
Fermentation time×additive		 0.327 0.006 0.322 0.102 0.040 0.094 0.002

2.4 不同发酵时间和添加剂处理下高湿玉米蛋白质二级结构变化

如图1和图2所示,与原料相比,经过添加剂处理后高湿玉米蛋白质酰胺带Ⅰ(1 600~1 700 cm-1)峰吸光度减弱;同时,随着发酵时间延长和添加剂处理,峰高的吸光度不断降低。
图1 不同发酵时间和添加剂处理下高湿玉米蛋白质酰胺带Ⅰ光谱

M表示原料,CON60、LB60、PAP60和LB+PAP60分别表示发酵60 d时CON组、LB组、PAP组和LB+PAP组,CON180、LB180、PAP180和LB+PAP180分别表示发酵180 d时CON组、LB组、PAP组和LB+PAP组。下图同。

Fig.1 Protein amide band Ⅰ spectra of high-moisture corn under different fermentation time and additive treatments

M represented raw material, CON60, LB60, PAP60 and LB+PAP60 represented CON group, LB group, PAP group and LB+PAP group at 60 days of fermentation, and CON180, LB180, PAP180 and LB+PAP180 represented CON group, LB group, PAP group and LB+PAP group at 180 days of fermentation, respectively. The same as below.

图2 不同发酵时间和添加剂处理下高湿玉米蛋白质酰胺带Ⅰ去卷积结果

Fig.2 Deconvolution results of protein amide band Ⅰ of high-moisture corn under different fermentation time and additive treatments

如图3所示,发酵时间和添加剂处理对高湿玉米蛋白质α螺旋占比无显著影响(P>0.05)。发酵60 d时,LB+PAP组β折叠占比显著低于CON组(P<0.05),β转角占比显著高于CON组(P<0.05);发酵180 d时,LB+PAP组无规则卷曲占比显著高于CON组(P<0.05)。
图3 不同发酵时间和添加剂处理下高湿玉米蛋白质二级结构占比

数据柱标记不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Fig.3 Proportions of protein secondary structures of high-moisture corn under different fermentation time and additive treatments

Data columns marked with different letters indicated significant difference (P<0.05).

3 讨论

3.1 发酵时间和添加剂对高湿玉米发酵品质和营养成分含量的影响

乳酸菌是高湿玉米厌氧发酵的主导微生物,可将玉米原料中的可溶性糖转化为乳酸,降低发酵环境的pH,形成酸性环境。pH<4.2的酸性环境在保证乳酸菌代谢活动正常进行的同时,不仅能够抑制有害细菌如腐败性厌氧细菌、霉菌等的生长,还能有效减少氨气等有毒气体的产生。有机酸总量及其构成是评价发酵品质的指标,品质优良的青贮饲料通常不含丁酸而含有较多的乳酸和少量的乙酸[23]。本试验中,菌酶协同处理(LB+PAP组)发酵180 d后高湿玉米pH小于4.2,乙酸含量较低,同时乳酸含量最高,表明长期发酵下菌酶协同可以提高高湿玉米的发酵品质。不过,发酵时间和添加剂以及二者的互作效应对高湿玉米营养成分含量无显著影响。

3.2 发酵时间和添加剂对高湿玉米蛋白质成分含量的影响

玉米贮藏蛋白质的氨基酸残基如羧基、氨基、羟基等,通过氢键、静电吸引力和疏水作用与淀粉紧密结合,形成致密的淀粉-蛋白质复合物[24]。同时,蛋白质附着或包埋在淀粉颗粒表面,会在淀粉颗粒与微生物间形成物理化学屏障,从而阻碍淀粉颗粒与微生物的接触,降低淀粉的消化率[25]。除此之外,蛋白质还以非催化的方式与淀粉酶结合,降低淀粉酶与淀粉表面酶结合位点的结合效率,从而减少淀粉的消化[26]。
玉米胚乳蛋白质具有白蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白4种贮藏蛋白质。其中,醇溶蛋白和谷蛋白是蛋白质基质的主要成分,醇溶蛋白以球形单体形式分散在谷蛋白网络中,形成蛋白质基质[27]。醇溶蛋白占总蛋白质的70%,其蛋白质分子内具有较多疏水性氨基酸,疏水性强;谷蛋白占总蛋白质的22%~33%,主要由共价和非共价相互作用形成的强相互作用链接网络构成。研究发现,小麦淀粉体外消化率与总蛋白质含量无显著相关关系,而与单一蛋白质含量有关。在4种贮藏蛋白质中白蛋白起抑制α-淀粉酶与淀粉颗粒结合的作用,谷蛋白和醇溶蛋白则通过与淀粉颗粒结合形成屏障及提高淀粉糊化温度的方式降低淀粉的体外消化率[28]。在小麦粉中去除蛋白质,可显著增强淀粉的膨胀性能,提高淀粉消化率[29]。张霞等[30]研究也发现,醇溶蛋白含量也与玉米淀粉在山羊瘤胃中的消化率呈显著负相关。蛋白质三、四级结构中的氢键、疏水相互作用以及蛋白质一级结构中的二硫键对蛋白质形成稳定构象起重要作用,与蛋白质的消化效果密切相关。本试验采用木瓜蛋白酶处理水解蛋白质,其是一种半胱氨酸蛋白酶,也被称为巯基蛋白酶[31]。木瓜蛋白酶作用于蛋白质的二硫键,使游离巯基占比上升,蛋白质结构松散,便于与微生物产生的蛋白酶结合。本研究中,菌酶协同处理显著降低高湿玉米醇溶蛋白和谷蛋白含量,醇溶蛋白和谷蛋白含量的降低会促进淀粉蛋白质结构的破坏,与预期结果相符。

3.3 发酵时间和添加剂对高湿玉米蛋白质二级结构的影响

FTIR中蛋白质主要有酰胺带Ⅰ(1 600~1 700 cm-1)和酰胺带Ⅱ(1 500~1 600 cm-1)2个功能区。其中,酰胺带Ⅰ的吸收峰强度与蛋白质含量显著相关[32]。酰胺带Ⅰ主要由80%的C=O和20%的C—N伸缩振动组成,对与肽键有关的氢键敏感,由于蛋白质二级结构与氢键联系紧密,因此酰胺带Ⅰ适用于研究蛋白质二级结构的变化[33]。高湿玉米蛋白质各二级结构的占比与蛋白质结构密切相关。
在蛋白质二级结构中,β折叠含有大量氢键,属于刚性结构,可形成致密氢键网络,是影响蛋白质结构稳定性的主要因素。β折叠在饲料中的占比越低,饲料的蛋白质利用效率越高[34-35]。无规则卷曲和β转角是蛋白质无序结构的代表,无规则卷曲具有较少的氢键和较多的酶主要功能结合位点,在饲料中的占比越大,蛋白酶和淀粉酶的催化效率越高,饲料的消化性能越好[17]。研究表明,高湿玉米达到反刍动物瘤胃最大消化率需青贮发酵10个月[36],Ferraretto等[37]试验结果证明添加蛋白酶可加速这一过程。本试验中,与CON组相比,菌酶协同处理组(LB+PAP组)高湿玉米发酵60 d时β折叠占比显著下降,β转角占比显著上升,α螺旋和无规则卷曲占比无显著变化,表明菌酶协同处理经过短期发酵(60 d)即可显著改变高湿玉米蛋白质结构组成,由稳定的β折叠结构转向β转角,使高湿玉米蛋白质结构趋向松散;同时,经过长期发酵(180 d)后无规则卷曲结构占比显著提高,蛋白质结构趋向无序,暴露酶结合位点,这有利于蛋白质-淀粉与消化酶的充分接触,进一步提高饲料的消化率。

4 结论

本研究发现,单一添加布氏乳杆菌或木瓜蛋白酶即可提高高湿玉米青贮品质,而两者协同使用效果更佳。菌酶协同处理能提高发酵效率,在长期厌氧发酵(180 d)条件下,该处理方式能有效破坏结构性蛋白质屏障,释放更多可利用氮。FTIR分析进一步揭示,菌酶协同处理能促进蛋白质二级结构向β转角和无规则卷曲转化,有利于解离淀粉-蛋白质复合物,从而提升饲料的淀粉降解率。综合考量发酵品质、贮藏蛋白质特性及结构表征等多方面结果,推荐在高湿玉米青贮饲料生产过程中采用菌酶协同发酵策略。

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