动物营养学报 >

2026 , Vol. 38 >Issue 2: 1201 - 1211

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.096

研究论文

冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣对荷斯坦犊牛生长发育、发病率及肠道菌群的影响

  • 张纪元 , 1, 2, 3, 4 ,
  • 许生春 1, 2, 3, 4 ,
  • 汪智龙 1, 2, 3, 4 ,
  • 冶龙 1, 2, 3, 4 ,
  • 李秋月 1, 2, 3, 4 ,
  • 包淑婷 1, 2, 3, 4 ,
  • 刘新兵 1, 2, 3, 4 ,
  • 吕佳颖 1, 2, 3, 4 ,
  • 王迅 1, 2, 3, 4 ,
  • 杨英魁 1, 2, 3, 4 ,
  • 刘书杰 1, 2, 3, 4 ,
  • 王明亮 5 ,
  • 王书祥 , 1, 2, 3, 4, * ,
  • 柴沙驼 , 1, 2, 3, 4, *
展开
  • 1 青海大学,西宁 810016
  • 2 青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室,西宁 810016
  • 3 青海省牦牛工程技术研究中心,西宁 810016
  • 4 国家牦牛技术创新中心(筹),西宁 810016
  • 5 青海省西宁市湟中区西堡镇生态奶牛养殖基地,西宁 811600
* 王书祥,副研究员,硕士生导师,E-mail: ;
柴沙驼,研究员,硕士生导师,E-mail:

张纪元(1999—),男,河南漯河人,硕士研究生,研究方向为反刍动物营养与饲料科学。E-mail:

Office editor: 武海龙

收稿日期: 2025-07-09

  网络出版日期: 2026-02-12

基金资助

高原奶牛高产健康养殖与乳制品加工技术研究与示范(2023-Z-14)

国家奶牛产业技术体系(CARS-36)

西藏城郊牧场奶牛营养平衡饲养及牛奶品质提升关键技术应用与示范(LSKJ202319)

收起

Effects of Cordyceps militaris Mycelium Fermentation Culture Residue on Growth Performance, Disease Incidence Rates and Intestinal Microbiota of Holstein Calves

  • ZHANG Jiyuan , 1, 2, 3, 4 ,
  • XU Shengchun 1, 2, 3, 4 ,
  • WANG Zhilong 1, 2, 3, 4 ,
  • YE Long 1, 2, 3, 4 ,
  • LI Qiuyue 1, 2, 3, 4 ,
  • BAO Shuting 1, 2, 3, 4 ,
  • LIU Xinbing 1, 2, 3, 4 ,
  • LYU Jiaying 1, 2, 3, 4 ,
  • WANG Xun 1, 2, 3, 4 ,
  • YANG Yingkui 1, 2, 3, 4 ,
  • LIU Shujie 1, 2, 3, 4 ,
  • WANG Mingliang 5 ,
  • WANG Shuxiang , 1, 2, 3, 4, * ,
  • CHAI Shatuo , 1, 2, 3, 4, *
Expand
  • 1 Qinghai University, Xining 810016, China
  • 2 Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science for Plateau Grazing Livestock in Qinghai Province, Xining 810016, China
  • 3 Qinghai Provincial Yak Engineering and Technology Research Center, Xining 810016, China
  • 4 National Yak Technology Innovation Center (Preparation), Xining 810016, China
  • 5 Ecological Dairy Cattle Breeding Base in Xibu Town, Huangzhong District, Xining City, Qinghai Province, Xining 811600, China
* WANG Shuxiang, associate professor, E-mail: ;
CHAI Shatuo, professor, E-mail:

Received date: 2025-07-09

  Online published: 2026-02-12

Fold

摘要

本试验旨在研究冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣对荷斯坦犊牛生长发育、发病率及肠道菌群的影响。选取30头3日龄以内、被动免疫成功(血清免疫球蛋白G含量≥10 g/L)、体重(38.12±1.62) kg的健康荷斯坦初生犊牛,随机分为2组,每组15头牛。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中添加10 g/(d·头)的冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣。预试期7 d,正试期83 d。结果表明:2组之间的平均日增重差异不显著(P>0.05)。与对照组相比,试验组的腹泻和感冒发病率降低,感冒评分有降低趋势(P=0.058)。肠道微生物分析表明,2组之间Alpha多样性差异不显著(P>0.05),Beta多样性存在显著差异(P<0.05)。试验组在拟杆菌门(Bacteroidota)和厚壁菌门(Firmicutes)内部菌群结构发生重塑,丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)、萨特氏菌科(Sutterellaceae)、萨特氏菌属(Sutterella)、马赛拟杆菌(Bacteroides massiliensis)、臭杆菌属(Odoribacter)和巴恩斯拟杆菌(Bacteroides barnesiae)显著富集,并出现弯曲杆菌门(Campylobacterota)和脱硫杆菌门(Desulfobacterota)的特异性定植。网络分析显示,与对照组相比,试验组微生物互作网络节点和边数增加,复杂度和稳定性增强。功能预测结果表明,PWY-7210、PWY-7198、GLUCARGALACTSUPER-PWY和GALACTARDEG-PWY等与碳水化合物及半乳糖代谢相关的代谢通路显著上调(P<0.05)。综上所述,冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣可通过重塑肠道微生态结构、增强代谢功能和提高菌群稳定性,从而改善荷斯坦犊牛健康状况。

关键词： 冬虫夏草; 发酵培养物; 生长性能; 荷斯坦犊牛; 肠道菌群; 代谢通路

本文引用格式

张纪元 , 许生春 , 汪智龙 , 冶龙 , 李秋月 , 包淑婷 , 刘新兵 , 吕佳颖 , 王迅 , 杨英魁 , 刘书杰 , 王明亮 , 王书祥 , 柴沙驼 . 冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣对荷斯坦犊牛生长发育、发病率及肠道菌群的影响[J]. 动物营养学报, 2026 , 38(2) : 1201 -1211 . DOI: 10.12418/CJAN2026.096

Abstract

This experiment was conducted to study the effects of Cordyceps militaris mycelium fermentation culture residue on growth performance, disease incidence rates and intestinal microbiota of Holstein calves. Thirty healthy within 3-day-old Holstein newborn calves with successful passive immunity (serum immunoglobulin G content≥10 g/L) and body weight of (38.12±1.62) kg were randomly divided into 2 groups with 15 calves per group. The control group was fed a basal diet, and the experimental group was fed the basal diet supplemented with 10 g/(d·head) Cordyceps militaris mycelium fermentation culture residue. The pre-experimental period lasted for 7 days, and the experimental period lasted for 83 days. The results showed that there was no significant difference in average daily gain between 2 groups (P>0.05). Compared with the control group, the diarrhea and cold incidence rates of the experimental group were decreased, and the cold score was tended to decrease (P=0.058). The analysis of intestinal microbiota indicated that there was no significant difference in Alpha diversity between 2 groups (P>0.05), and the Beta diversity had significant difference (P<0.05). In the experimental group, the internal microbial community structure reshaped in Bacteroidota and Firmicutes, with significantly enriched in Erysipelotrichales, Sutterellaceae, Sutterella, Bacteroides massiliensis, Odoribacter and Bacteroides barnesiae, and with specific colonization of Campylobacterota and Desulfobacterota. The network analysis showed that compared with the control group, the numbers of nodes and edges of microbial interaction network were increased, and the complexity and stability were enhanced. The functional prediction results indicated that the metabolic pathways related to carbohydrate and galactose metabolism were significantly upregulated (P<0.05), such as PWY-7210, PWY-7198, GLUCARGALACTSUPER-PWY and GALACTARDEG-PWY. In conclusion, the Cordyceps militaris mycelium fermentation culture residue can improve the health status of Holstein calves through reshaping the intestinal microbiota structure, enhancing metabolic function, and improving microbial stability.

Key words： Cordyceps militaris; fermentation culture; growth performance; Holstein calves; intestinal microbiota; metabolic pathway

冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)是青藏高原特有的珍稀中药材,主要分布于青海、西藏、四川、云南等地3 500~5 000 m的高寒地区,独特的生态环境赋予其极高的药用价值,但因天然产量稀少、价格昂贵,从而限制了其在畜牧业中的推广应用[1]。研究表明,冬虫夏草及其相关真菌具有显著的抑菌、抗氧化、抗病毒和免疫调节活性,在促进动物健康与生产性能方面具有潜在应用价值[2]。随着微生物发酵技术的发展,人工培养已成为获取冬虫夏草活性成分的重要途径。其中,虫草欣康[主要成分为地顶孢霉(Acremonium terricola)培养物]富含虫草素(约0.43 g/kg)、虫草多糖(约44.6 g/kg)、甾醇(约0.60 g/kg)、腺苷(约0.35 g/kg)等多种活性成分,其组成和含量与天然冬虫夏草相似,部分指标甚至更优[3]。研究显示,饲粮中添加虫草欣康可显著降低羊肉脂肪和胆固醇含量,同时提高蛋白质和必需氨基酸含量[4];并能增强泌乳奶牛的机体抗氧化能力,提高血清甘油三酯、总蛋白、白蛋白含量及超氧化物歧化酶活性[5]。然而,另一种与冬虫夏草关系密切的真菌,即冬虫夏草的无性型——中国被毛孢(Hirsutella sinensis),虽同样富含多种活性成分,却在饲料领域的研究与应用极为有限[6]。现有研究多聚焦于中国被毛孢的药理作用(免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等)及中医药应用[7],对其在畜牧业中的开发利用尚缺乏系统探索。目前,中国被毛孢已实现人工发酵及工业化生产,菌丝体及其发酵产物被广泛应用于药品、保健品及功能性食品领域,用于提取虫草素、虫草酸和多糖等生物活性物质[8]。然而,在生产过程中仍会产生大量菌丝体发酵残渣,因未被充分利用而多被当作废弃物处理,造成资源浪费。因此,本研究旨在探究冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣作为饲料添加剂在荷斯坦犊牛生产中的应用潜力,通过在荷斯坦犊牛饲粮中添加冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣,研究其对荷斯坦犊牛生长发育、发病率及肠道菌群的影响,为开发基于冬虫夏草资源废弃物的绿色、高效饲料添加剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣购自青海某集团有限公司,主要功能活性成分为虫草酸[(28.17±3.28) mg/g]、虫草多糖[(48.16±1.32) mg/g]、虫草素[(17.06±3.86) mg/g]、海藻糖[(20.66±3.28) mg/g]。

1.2 试验设计

本研究已获得青海大学动物保护与利用委员会批准(批准编号:QHU20240251),所有奶牛的处理均符合动物试验伦理要求。犊牛在饲喂初乳后48 h内测定血清免疫球蛋白G(IgG)含量,选取30头被动免疫成功(血清IgG含量≥10 g/L)、体重(38.12±1.62) kg、健康的荷斯坦犊牛,采用随机分组设计,分为2组,每组15头牛。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中添加10 g/(d·头)的冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣。冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣的添加水平参考张永根等[9]和汲中元等[10]的研究结果确定。试验期共90 d,其中包括7 d的预试期和83 d的正试期。常乳营养水平见表1,基础饲粮组成及营养水平见表2。
表1 常乳营养水平

Table 1 Normal milk nutrient levels %

项目Items 含量Content
乳蛋白Milk protein 3.52
乳脂Milk fat 4.43
乳糖Lactose 4.56
总固形物Total solid 13.40

实测值 Measured values。

表2 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)

Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

项目Items 含量Content
原料Ingredients
玉米Corn 52.70
豆粕Soybean meal 19.00
膨化大豆Extruded soybean 8.00
棉籽粕Cottonseed meal 6.00
麸皮Wheat bran 7.00
干酒糟及其可溶物DDGS 3.00
石粉Limestone 1.30
食盐NaCl 0.50
磷酸氢钙CaHPO4 0.50
预混料Premix1) 2.00
合计Total 100.00
营养水平Nutrient levels2)
干物质(风干基础) DM (air-dry basis) 93.58
粗蛋白质CP 18.61
中性洗涤纤维NDF 28.86
酸性洗涤纤维ADF 16.92
粗灰分Ash 6.49
粗脂肪EE 3.38
钙Ca 1.05
磷P 0.54

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of the diet: VA 7 500 IU,VD 1 000 IU,VE 100 IU,Fe 90 mg,Cu 12.5 mg,Mn 30 mg,Zn 90 mg,Se 0.3 mg,I 1.0 mg,Co 0.5 mg。

2)实测值 Measured values。

1.3 饲养管理

动物饲养试验于2025年2月6日至2025年5月1日在青海省西宁市湟中区西堡镇生态奶牛养殖基地进行,采用犊牛岛单栏饲养模式。犊牛出生后立即饲喂初乳,随后进入常乳饲喂阶段,并依据日龄实施阶段性饲喂方案,每日饲喂2次(09:00和16:00)。1~3日龄每日饲喂常乳8 L/头;4~7日龄每日饲喂常乳9 L/头;8~30日龄每日饲喂常乳9 L/头,并补饲开食料0.5 kg/头;31~50日龄每日饲喂常乳10 L/头,并补饲开食料1.0 kg/头;51~52日龄每日饲喂常乳8 L/头,并补饲开食料1.0 kg/头;53~54日龄每日饲喂常乳6 L/头,并补饲开食料1.2 kg/头;55~58日龄每日饲喂常乳4 L/头,并补饲开食料1.3 kg/头;59~67日龄每日饲喂常乳1 L/头,并补饲开食料1.5 kg/头;68~90日龄停止饲喂常乳,并补饲开食料1.8 kg/头。

1.4 测定指标

1.4.1 常乳和饲粮营养水平

常乳的乳蛋白、乳脂、乳糖、总固形物含量分别参照GB 5009.5—2016、GB 5413.3—2010、GB 5413.5—2010、GB 5009.3—2016的方法测定。
饲粮的干物质、粗蛋白质、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗灰分、粗脂肪、钙、磷含量分别参照GB/T 6435—2014、GB/T 6432—2018、GB/T 20806—2006、GB/T 20805—2006、GB/T 6438—2018、GB/T 6433—2006、GB/T 6436—2018、GB/T 6437—2018的方法测定。

1.4.2 血清IgG含量

饲喂初乳48 h后,对犊牛进行颈静脉采血,经离心机离心后用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(江苏酶免实业有限公司)测定血清IgG含量,选取血清IgG含量≥10 g/L的犊牛开展试验。

1.4.3 生长性能

试验开始和结束时,用体重秤称取犊牛的体重,记录初始体重和终末体重,并计算平均日增重。

1.4.4 发病率

试验期间,每2 d观察1次犊牛的感冒和腹泻情况,犊牛感冒的严重程度依据临床评分系统进行判定[11]。该系统根据犊牛的精神状态、眼部与耳部表征、姿势以及呼吸情况,将其划分为4个等级:健康或轻微异常(0~2.4分)、轻度不适(2.5~4.9分)、中度患病(5.0~7.4分)和严重患病(7.5~10.0分)。
参照Wen等[12]的方法,对犊牛粪便进行评分:0分为成形固状,1分为软稠但不成形,2分为松散轻度腹泻,3分为水样稀便。犊牛粪便评分连续2 d及以上≥2分时,即判定为腹泻。记录试验期间犊牛的腹泻头数与相应腹泻天数,并按下式计算腹泻发病率:
腹泻发病率(%)=[腹泻头数×腹泻天数/(试验头数×试验天数)]×100。

1.4.5 肠道菌群

用粪便采样器随机选取12头犊牛(对照组6头,试验组6头)在直肠进行采样,每头牛采集3 g粪便,用无菌粪便采样器采集后立即用液氮冷冻保存,随后送至北京诺禾致源生物有限公司进行微生物的测序。使用DNA提取试剂盒(D5625-02,美国BioTek公司)从粪便样本中提取肠道微生物的总基因组DNA。使用2%琼脂凝胶电泳评估DNA的完整性。使用通用正向引物(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')和反向引物(5'-GGACTACNNGGGGTATCTAAT-3')扩增细菌16S rRNA基因的V3~V4区域,在统一测序深度后,对样本内微生物群落多样性进行分析,计算Observed_features指数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数,用于评估群落的物种丰富度和多样性。组间Alpha多样性差异采用Wilcoxon秩和检验进行统计分析,使用非度量多维尺度分析(NMDS)对Bray-Curtis距离矩阵进行降维。组间差异的显著性通过使用多重响应排列程序(MRPP)方法进行检验,MRPP方法基于Bray-Curtis距离计算,采用线性判别分析效应大小(LEfSe)分析方法,在属水平对微生物群落进行差异分析。首先通过Kruskal-Wallis检验筛选显著差异特征,随后采用线性判别分析(LDA)评估差异特征的效应量,LDA得分>3作为显著差异菌的筛选标准。在门水平对肠道微生物群落进行共现网络分析,基于Spearman相关系数计算不同微生物之间的相关性,筛选|r|>0.8且P<0.05的相关关系构建网络。使用Cytoscape软件对网络进行可视化,并计算网络拓扑参数,包括节点数、边数、模块度和群落数量等,基于扩增子序列变异(ASV)序列及其丰度信息,采用PICRUSt2软件对肠道微生物群落潜在功能进行预测。通过推断基因家族丰度并映射至KEGG功能通路数据库,获得各样本功能通路的相对丰度。组间功能差异采用Wilcoxon秩和检验进行比较,并进行多重检验校正,调整后P值(FDR)<0.05且|log2差异倍数(FC)|≥1认为差异具有统计学意义。

1.5 数据统计分析

试验原始数据运用SPSS 27.0.1软件进行正态齐性检验和方差分析,符合正态分布和方差齐性的数据用独立样本t检验进行分析,不符合的数据采用非参数检验。数据用平均值和均值标准误(SEM)表示,P<0.05为差异显著,0.05<P<0.10为有差异显著趋势,P>0.05为差异不显著。

2 结果

2.1 冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣对荷斯坦犊牛生长性能的影响

由表3可知,2组之间的初始体重、终末体重和平均日增重差异不显著(P>0.05)。
表3 冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣对荷斯坦犊牛生长性能的影响

Table 3 Effects of Cordyceps militaris mycelium fermentation culture residue on growth performance of Holstein calves

项目
Items		 对照组
Control group		 试验组
Experimental group		 SEM P值
P-value
初始体重IBW/kg 38.37 37.87 0.296 0.401
终末体重FBW/kg 107.50 110.70 2.308 0.498
平均日增重ADG/(kg/d) 0.77 0.81 0.051 0.443

2.2 冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣对荷斯坦犊牛发病率的影响

由表4可知,腹泻发病率方面,试验组为26.67%,低于对照组的33.33%;感冒发病率方面,试验组为26.67%,低于对照组的40.00%。感冒评分方面,试验组有低于对照组的趋势(P=0.058)。
表4 冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣对荷斯坦犊牛发病率的影响

Table 4 Effects of Cordyceps militaris mycelium fermentation culture residue on disease incidence rates of Holstein calves

项目
Items		 对照组
Control group		 试验组
Experimental group		 SEM P值
P-value
腹泻发病率Diarrhea incidence rate/% 33.33 26.67
感冒发病率Cold incidence rate/% 40.00 26.67
感冒评分Cold score 6.03 5.55 0.220 0.058

2.3 冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣对荷斯坦犊牛肠道菌群的影响

2.3.1 对照组和试验组Alpha多样性和Beta多样性分析

由图1可知,试验组与对照组的Chao1指数、Simpson指数、Shannon指数及Observed_features指数均无显著差异(P>0.05)。基于Bray-Curtis距离的NMDS结果显示,试验组与对照组样本在群落结构上呈现明显分离趋势。MRPP分析结果表明,2组微生物群落结构差异具有统计学意义(P=0.027)。进一步分析ASV组成发现,试验组独有的ASV数目较对照组有所减少。
图1 对照组和试验组Alpha多样性和Beta多样性分析

数据柱标无字母表示差异不显著(P>0.05)。Value columns with no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

Fig.1 Alpha diversity and Beta diversity analyze between control group and experimental group

A:Chao1指数;B:Simpson指数;C:Shannon指数;D:Observed_features指数;E:基于Bray-Curtis距离的NMDS分析;F:差异ASV韦恩图。A: Chao1 index; B: Simpson index; C: Shannon index; D: Observed_features index; E: NMDS analysis based on Bray-Curtis distance; F: Venn diagram of differences in ASV。

2.3.2 对照组和试验组差异微生物分析和微生物网路分析

由图2-A可知,差异微生物分析结果显示,试验组中丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)、萨特氏菌科(Sutterellaceae)、萨特氏菌属(Sutterella)、马赛拟杆菌(Bacteroides massiliensis)、臭杆菌属(Odoribacter)和巴恩斯拟杆菌(Bacteroides barnesiae)显著富集(LDA得分>3,P<0.05),而对照组中螺旋体门(Spirochaetota)、螺旋体纲(Spirochaetia)、螺旋体目(Spirochaetales)、螺旋体科(Spirochaetaceae)、密螺旋体属(Treponema)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)显著富集(LDA得分>3,P<0.05)。
图2 对照组和试验组的差异微生物分析

A:LDA分布柱形图(LDA得分>3,P<0.05)。B:门水平差异ASV曼哈顿图。差异丰度分析使用DESeq2进行。FDR<0.05且|log2FC|≥1的ASV被认为具有显著差异。图中实心上三角表示试验组与对照组相比显著上调的ASV,空心倒三角表示试验组与对照组相比显著下调的ASV。A: LDA distribution bar chart (LDA score>3, P<0.05). B: phylum-level differential ASV Manhattan plot. Differential abundance analysis was performed using DESeq2. ASV with FDR<0.05 and |log2FC|≥1 was considered significantly different. In the plot, the solid upward triangles represented ASV significantly up-regulated in the experimental group compared with the control group, while the open downward triangles represented ASV significantly down-regulated in the experimental group compared with the control group.

Spirochaetota:螺旋体门;Spirochaetia:螺旋体纲;Spirochaetales:螺旋体目;Erysipelotrichales:毒丝菌目;Spirochaetaceae:螺旋体科;Sutterellaceae:苏特雷菌科;Treponema:密螺旋体属;Sutterella:苏特雷菌属;Odoribacter:恶臭杆菌属;Clostridium butyricum:丁酸梭菌;Bacteroides massiliensis:马赛拟杆菌;Bacteroides barnesiae:巴恩斯拟杆菌。

Fig.2 Differential microbial analysis between control group and experimental group

由图2-B可知,门水平差异ASV分析显示,差异主要集中于拟杆菌门(Bacteroidota)和厚壁菌门(Firmicutes)内部。拟杆菌门中4个ASV显著上调、6个ASV显著下调;厚壁菌门中2个ASV显著上调、12个ASV显著下调;变形菌门(Proteobacteria)中仅1个ASV显著下调。
由图3-A和图3-B可知,基于核心菌门的共现网络分析显示,试验组的网络节点数(186个)和边数(191条)高于对照组(节点数81个,边数76条),网络复杂度增加。相关性结构中,对照组以正相关关系为主(71.05%),而试验组中负相关关系比例上升。从参与网络构建的菌门组成来看,对照组中螺旋体门在相关性网络中所占比例较高,而试验组中则独有弯曲杆菌门(Campylobacterota)和脱硫杆菌门(Desulfobacterota)参与相关性网络的构建。
图3 对照组和试验组微生物网络分析

A:对照组门水平微生物网络图(节点:81;边:76;正相关:71.05%;负相关:28.95%;模块度:0.884;群落数量:28)。B:试验组门水平微生物网络图(节点:186;边:191;正相关:55.88%;负相关:44.12%;模块度:0.627;群落数量:15)。A: microbial network diagram at phylum level of the control group (nodes: 81; edges: 76; positive correlation: 71.05%; negative correlation: 28.95%; modularity: 0.884; number of communities: 28); B: microbial network diagram at phylum level of the experimental group (nodes: 186; edges: 191; positive correlation: 55.88%; negative correlation: 44.12%; modularity: 0.627; number of communities: 15).

Firmicutes:厚壁菌门;Bacteroidota:拟杆菌门;Spirochaetota:螺旋体门;Proteobacteria:变形菌门;Campylobacterota:弯曲杆菌门;Desulfobacterota:脱硫杆菌门。

Fig.3 Microbial network analysis of control group and experimental group

2.3.3 PICRUSt2微生物功能预测

由图4-A和图4-B可知,相较于对照组,试验组显著上调的代谢通路达4条,无显著下调代谢通路。进一步富集分析表明,试验组中PWY-7210、PWY-7198、GLUCARGALACTSUPER-PWY及GALACTARDEG-PWY代谢通路显著富集。其中,PWY-7210与PWY-7198代谢通路主要参与复杂碳水化合物的分解代谢,GLUCARGALACTSUPER-PWY和GALACTARDEG-PWY代谢通路则涉及半乳糖与糖醛酸代谢过程。
图4 对照组和试验组微生物功能预测

A:功能通路功能差异富集火山图;以P<0.05且|log2FC|>1为显著差异筛选阈值,其中红色实心圆点代表试验组相较于对照组显著上调的功能通路。B:差异富集功能通路。

Fig.4 Microbial function prediction of control group and experimental group

A: Functional pathways differential enrichment volcano plot; the significant difference screening threshold of P<0.05 and |log2FC|>1, the red solid dots represent the functional pathways significantly up-regulated in the experimental group compared with the control group. B: differentially enriched functional pathways.

3 讨论

3.1 冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣对荷斯坦犊牛生长性能的影响

现有研究表明,虫草类饲料添加剂在畜禽生产中具有显著的促生长作用。在小尾寒羊断奶羔羊饲粮中添加虫草培养物可显著提高其平均日增重[13];在蛋鸭饲粮中补充地顶孢霉培养物可提高其产蛋率并改善蛋品质[14];在奶牛饲粮中添加地顶孢霉培养物不仅能提高其产奶量及乳脂和乳糖含量,还可降低乳中体细胞数[15]。这些结果共同表明,虫草类饲料添加剂在改善动物生长性能和优化畜产品品质方面具有潜在应用价值。
然而,部分研究亦显示其作用效果存在不一致性。例如,在北京油鸡饲粮中添加地顶孢霉培养物并未显著提高其平均日增重和胴体品质[16]。本研究结果与之相似,试验组与对照组犊牛的平均日增重差异不显著。该结果可能与犊牛独特的生理发育阶段有关。相较于猪、禽及成年反刍动物,犊牛的消化系统尚未完全发育;当基础饲粮已满足其生长所需营养时,额外添加冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣的促生长作用可能难以进一步体现。

3.2 冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣对荷斯坦犊牛发病率的影响

本试验结果表明,冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣在降低犊牛感冒和腹泻发病率、减轻感冒症状方面具有积极作用。从作用机制看,冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣富含多种生物活性成分,这些成分协同作用,可从多个层面降低犊牛疾病发生风险[17]。在免疫调节方面,其中的多糖和活性肽等成分能够激活巨噬细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞,促进白细胞介素、干扰素等细胞因子的分泌,进而增强机体的非特异性免疫和特异性免疫应答能力[18]。犊牛对感冒病毒及肠道致病菌的防御能力得到提升,从而有效降低感冒和腹泻发病率。此外,这些活性成分对肠道微生物群的组成与结构亦具有显著调节作用。本试验结果显示,补充冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣后,试验组与对照组的肠道菌群结构存在差异。微生物网络分析结果表明,试验组的节点与边数量均高于对照组,菌群间的协同与拮抗关系更为复杂,微生物互作更为活跃。这表明试验组菌群的生态稳定性与抗扰动能力更强。通过维持肠道菌群平衡,可进一步增强肠道屏障功能,减少病原体侵袭,从而降低腹泻发生率。

3.3 冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣对荷斯坦犊牛肠道微生物多样性与菌群结构的影响

肠道微生物多样性分析结果揭示了冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣对荷斯坦犊牛肠道菌群的调控机制。Alpha多样性指数(Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数及observed_features指数)分析显示,试验组与对照组之间无显著差异,表明添加冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣后,犊牛肠道微生物群落的物种丰富度与均匀度维持稳定。这一结果表明,作为饲料添加剂,冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣对肠道微生物生态位的影响较为温和,未显著改变核心微生物类群的共存模式及生态系统承载能力。然而,Beta多样性分析揭示了更深层的群落结构变化,基于Bray-Curtis距离的NMDS结果显示,试验组与对照组的微生物群落结构存在显著差异,这一结果与李洋等[19]研究结果一致,证实冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣可重塑肠道菌群组成。结合微生物网络分析进一步发现,这种结构变化主要体现在优势菌门(如拟杆菌门、厚壁菌门)及功能类群的相对丰度改变。冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣中富含的多糖、活性肽等生物活性成分,通过提供特异性营养底物,选择性促进有益菌群的增殖;同时,可能通过代谢产物介导的种间互作,抑制潜在有害菌的生长,进而改变微生物群落内的协同与拮抗关系。

3.4 冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣介导的肠道微生物差异富集与互作网络重塑

本研究表明,冬虫夏草菌丝体发酵剩余培养物可重塑犊牛肠道微生物群落结构,尤其引起拟杆菌门与厚壁菌门内部成员的重排。这种微生态重构并非通过改变主要菌门的总体丰度实现,而是体现在属与ASV水平的结构优化上,提示该发酵物具有选择性调控肠道核心菌群的潜力。试验组富集的臭杆菌属、马赛拟杆菌和巴恩斯拟杆菌多为短链脂肪酸(SCFA)产生菌,尤其是丁酸生成菌。丁酸作为结肠上皮细胞的主要能量来源,可增强屏障功能、缓解炎症反应并维持黏膜免疫稳态[20]。这说明该发酵产物可能通过提升产丁酸菌活性,改善宿主肠道健康。
试验组中萨特氏菌科、萨特氏菌属显著富集,但变形菌门总体相对丰度并无显著变化。Hiippala等[21]研究发现,萨特氏菌属的成员是广泛存在的共生体,对与微生物群失调和变形菌门相对丰度无显著影响。结合腹泻发病率下降的结果推测,轻度的变形菌门波动可能属于生态稳态下的中性调节,而非致病信号。此外,试验组中检测到弯曲杆菌门和脱硫杆菌门的特异性定植,提示菌群功能多样性得到拓展;前者相对丰度极低,未表现出潜在风险类群的致病特征[22];后者可通过硫酸盐还原代谢产生低浓度硫化氢(H2S),该分子在生理范围内可作为信号介质调节肠蠕动与屏障功能[23]。这些发现说明,冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣的益生效应不仅体现在菌群组成层面,还涉及代谢信号网络的协同调控。
网络分析结果进一步揭示了微生态的组织化趋势。试验组菌群互作网络的节点与边数明显增加,表明更多菌门参与共生协作。与此同时,正、负相关关系的比例调整显示菌群竞争与拮抗增强,社区结构趋于整合。网络模块度下降及连接度提高共同反映系统的稳态增强与冗余减少,说明冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣促进了肠道菌群的生态稳定性。

3.5 基于PICRUSt2的肠道微生物功能预测

代谢通路分析结果显示,添加菌丝体发酵培养物残渣后,犊牛肠道微生物共有4条代谢通路显著上调,且无代谢通路显著下调。其中,PWY-7210、PWY-7198、GALACTARDEG-PWY和GLUCARGALACTSUPER-PWY代谢通路显著富集。这一结果与菌群结构及其互作网络的变化相互印证,揭示了虫夏草菌丝体发酵培养物残渣的潜在益生机制。
PWY-7210与PWY-7198代谢通路主要参与碳水化合物分解过程[24],其上调与试验组中拟杆菌门的内部富集及产丁酸菌属相对丰度的增加相一致,表明发酵残渣可激活相关代谢通路,促进短链脂肪酸(SCFAs)生成。此外,GLUCARGALACTSUPER-PWY和GALACTARDEG-PWY代谢通路涉及半乳糖及糖醛酸代谢[25],其显著上调反映了虫夏草菌丝体发酵培养物残渣中特定糖类组分被肠道微生物有效代谢利用。代谢通路富集变化与菌群结构调整呈协同关系。脱硫杆菌门的富集可能增强硫代谢能力,其产生的硫化氢可能参与PWY-7198代谢通路中的多糖降解反应;同时,弯曲杆菌门的定植或有助于优化厌氧代谢通路,提升微生物群落整体代谢网络的整合性。试验组未观察到代谢通路的显著下调,表明虫夏草菌丝体发酵培养物残渣主要对肠道微生物代谢产生正向调控作用。上调的代谢通路与犊牛腹泻发病率降低密切相关:短链脂肪酸的合成可增强肠道屏障功能,而糖醛酸代谢的活跃有助于促进黏蛋白合成,两者协同维持肠道稳态并提升健康水平。

4 结论

冬虫夏草菌丝体发酵培养物残渣能改善荷斯坦犊牛肠道微生态和代谢功能,提升犊牛健康水平。

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