动物营养学报 >

2026 , Vol. 38 >Issue 2: 1410 - 1430

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.112

研究论文

酱香型鲜白酒糟的液态菌酶协同发酵工艺优化及发酵酱香型鲜白酒糟在生长猪上的营养价值评定

  • 周紫筠 ,
  • 黎美宏 ,
  • 张焜 ,
  • 周艺璇 ,
  • 车炼强 ,
  • 虞洁 ,
  • 吴彩梅 , *
展开
  • 四川农业大学动物营养研究所,农业农村部动物抗病营养与饲料重点实验室,动物抗病营养四川省重点实验室,成都 611130
* 吴彩梅,副教授,硕士生导师,E-mail:

周紫筠(2000—),女,黑龙江鸡西人,硕士研究生,从事动物营养与饲料科学研究。E-mail:

Office editor: 陈燕

收稿日期: 2025-06-11

  网络出版日期: 2026-02-12

基金资助

四川省“十四五”川猪重大科技专项(2021ZDZX0011)

生猪岗位体系项目(CARS-35)

收起

Optimization of Liquid Bacterial-Enzymatic Synergistic Fermentation for Fresh Maotai-Flavor Baijiu Lees and Nutritional Value Evaluation of Fermented Fresh Maotai-Flavor Baijiu Lees for Growing Pigs

  • ZHOU Ziyun ,
  • LI Meihong ,
  • ZHANG Kun ,
  • ZHOU Yixuan ,
  • CHE Lianqiang ,
  • YU Jie ,
  • WU Caimei , *
Expand
  • Sichuan Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition, Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition and Feed of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Institute of Animal Nutrition, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
* associate professor, E-mail:

Received date: 2025-06-11

  Online published: 2026-02-12

Fold

摘要

本试验旨在优化酱香型鲜白酒糟的液态菌酶协同发酵工艺,评定发酵酱香型鲜白酒糟在生长猪上的营养价值,为酱香型鲜白酒糟在生长猪饲粮的利用提供参考。采用单因素试验,选取初始pH、发酵时间、水料比、菌酶添加量和发酵温度5个主要考察因素来考察发酵对半纤维素、总糖和总酸含量的影响;基于单因素试验结果,以半纤维素含量为响应值,采用响应面试验优化酱香型鲜白酒糟的发酵工艺参数。通过养分含量测定、扫描电镜观察、红外光谱分析和微生物16S测序分析液态菌酶发酵前后酱香型鲜白酒糟的品质变化,通过测定生长猪的氨基酸回肠消化率、养分全肠道消化率(TTD)、消化能和代谢能,评价其对生长猪的营养价值。结果表明:1)以半纤维素含量为响应值的最佳发酵工艺为初始pH 5.7,发酵时间28 h,水料比1.8,菌酶添加量0.3%,发酵温度43.7 ℃;2)与未发酵的酱香型鲜白酒糟相比,发酵酱香型鲜白酒糟的粗蛋白质含量显著升高了10.74%(P<0.05),粗纤维含量显著降低了21.02%(P<0.05);发酵酱香型鲜白酒糟表面粗糙且孔隙增加,纤维结构部分分解,蛋白质二级结构向α-螺旋结构转变,微生物组成主要以肠球菌属(62%)和梭状芽孢杆菌属(25%)为主;3)与未发酵的酱香型鲜白酒糟相比,发酵酱香型鲜白酒糟中除胱氨酸外的其余17种氨基酸的标准回肠消化率均显著提高(P<0.05);4)与添加未发酵的酱香型鲜白酒糟试验饲粮相比,添加发酵酱香型鲜白酒糟试验饲粮的粗蛋白质、粗纤维和粗灰分的TTD均显著提高(P<0.05),消化能和代谢能差异不显著(P>0.05)。综上所述,液态菌酶协同发酵有效改善了酱香型鲜白酒糟的营养品质和对生长猪的营养价值。

关键词： 酱香型鲜白酒糟; 菌酶协同; 液态发酵; 发酵工艺; 氨基酸回肠消化率; 全肠道消化率; 消化能; 代谢能

本文引用格式

周紫筠 , 黎美宏 , 张焜 , 周艺璇 , 车炼强 , 虞洁 , 吴彩梅 . 酱香型鲜白酒糟的液态菌酶协同发酵工艺优化及发酵酱香型鲜白酒糟在生长猪上的营养价值评定[J]. 动物营养学报, 2026 , 38(2) : 1410 -1430 . DOI: 10.12418/CJAN2026.112

Abstract

This study aimed to optimize the liquid bacterial-enzymatic synergistic fermentation process for fresh Maotai-flavor Baijiu lees and evaluate nutritional value of fermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees for growing pigs, thereby providing a reference for its utilization in diets of growing pigs. A single-factor experiment was first conducted to investigate effects of five key factors (initial pH, fermentation time, water-to-feed ratio, bacterial-enzyme additive amount, and fermentation temperature) on the contents of hemicellulose, total sugar, and total acid. Based on the single-factor results, the fermentation process parameters were further optimized using a response surface methodology with hemicellulose content as the response value. The quality changes of fresh Maotai-flavor Baijiu lees before and after fermentation were assessed by determining nutrient levels, scanning electron microscopy (SEM), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), and microbial 16S rRNA sequencing. The nutritional value for growing pigs was evaluated by determining the ileal digestibility of amino acids, total tract digestibility (TTD) of nutrients, digestible energy (DE), and metabolizable energy (ME). The results showed as follows: 1) the optimal fermentation process parameters determined with hemicellulose content as the response value were initial pH 5.7, fermentation time 28 h, water-to-material ratio 1.8, bacterial-enzyme additive amount 0.3%, and fermentation temperature 43.7 ℃. 2) Compared with unfermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees, the fermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees exhibited a significant increase of 10.74% in crude protein (CP) content (P<0.05) and a significant decrease of 21.02% in crude fiber (CF) content (P<0.05). SEM observation revealed a rougher surface with increased porosity and partial decomposition of the fibrous structure. FTIR analysis indicated a shift in protein secondary structure towards α-helix. Microbial community analysis showed that the fermented lees were predominantly composed of Enterococcus (62%) and Clostridium (25%). 3) The standard ileal digestibility of 17 amino acids, except for cystine, was significantly improved in the fermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees compared to the unfermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees (P<0.05). 4) Diets containing the fermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees showed significantly increased TTD of CP, CF, and ash (P<0.05), while no significant differences were found in DE and ME compared to diets containing unfermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees (P>0.05). In conclusion, liquid bacterial-enzymatic synergistic fermentation effectively improves the nutritional quality of fresh Maotai-flavor Baijiu lees and nutritional value of fermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees for growing pigs.

Key words： fresh Maotai-flavor Baijiu lees; bacterial-enzymatic synergy; liquid fermentation; fermentation process; ileal digestibility of amino acids; total tract digestibility; digestible energy; metabolizable energy

中国是白酒的生产与消费大国,每年产出的鲜白酒糟超过2 000万t,鲜白酒糟的粗纤维含量丰富,粗蛋白质含量适中且氨基酸组成均衡[1]。但由于单胃动物体内缺少消化非淀粉多糖的酶,致使其无法消化利用鲜白酒糟中丰富的非淀粉多糖,而非淀粉多糖在消化道中会增加食糜粘性,阻碍消化酶与食物中养分接触,导致动物对养分的消化利用率降低[2-3]。因此,若要将鲜白酒糟应用于猪的饲粮中,首先要先对其纤维物质进行降解处理。孙银珠[4]利用枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和酵母菌对酱香型酒糟进行固态混菌发酵处理后发现,粗蛋白质含量升高至26.83%、粗纤维含量降低至13.17%。在另一项研究中,同样利用枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌对清香型酒糟进行固态发酵,发酵后粗蛋白质含量达到24.97%[5]。酒糟或发酵酒糟饲料多用于反刍动物养殖中,研究发现,添加3%~6%酒糟的饲粮对牦牛的生长性能、表观消化率无负面影响[6];而添加15%酒糟的饲粮显著改变了肉牛肠道微生物组成,改善了肠道健康[7]。
液态发酵早期技术是通过提高发酵饲料含水量,利用原有乳酸菌和酵母菌生成乙酸,降低发酵基质pH,从而抑制环境中有害菌繁殖,实现减少抗生素使用的目的[8]。液态发酵的发酵方式分为2种,发酵全价配合饲料和仅发酵饲粮中谷物部分,前者操作方便但发酵过程中会损失饲料中动物必需的营养成分,实际生产应用中更多的倾向于后者。液态发酵不仅能抑制动物肠道有害菌增殖,且能提高动物的采食量和日增重,从而改善生长性能[9-11]。液态发酵技术在欧洲一些国家的畜牧业中应用较多,我国近几年也开始尝试研究[12],但目前关于酱香型鲜白酒糟的液态菌酶协同发酵工艺鲜有研究。基于此,本试验通过液态菌酶协同发酵探索改善酱香型鲜白酒糟营养价值的途径,为酱香型鲜白酒糟应用于生长猪饲粮提供参考。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本试验在四川农业大学实验室及教学科研基地进行,所有试验程序均经过动物保护委员会的审查和批准(SICAU-2022-10)。

1.2 试验材料

试验原料:酱香型鲜白酒糟,购自四川省泸州市某酿酒厂。
发酵剂:菌酶复合物,购自山东省青岛市某生物公司,该复合物中复合菌种包含乳酸菌(>1×109 CFU/g)、酵母菌(>1×109 CFU/g)和芽孢杆菌(>1×109 CFU/g),复合酶包含木聚糖酶(>500 U/g)、纤维素酶(>500 U/g)和蛋白酶(>5 000 U/g)。

1.3 仪器与设备

全自动凯氏定氮仪(K1100,海能未来技术集团股份有限公司),全自动纤维分析仪(ANKOM A2000i,ANKOM Technology Corporation,美国),全自动氧弹式量热仪(Parr 6400,Parr Instrument Company,美国),全自动氨基酸分析仪(L-8900,株式会社日立制作所,日本),高效液相色谱仪(e2695,Waters Corporation,美国),分光光度计(DU730,BeckMan Coulter Inc,美国),扫描电子显微镜(Sigma 360,Carl Zeiss AG,德国)和傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet iS10,Thermo Fisher Scientific Inc,美国)。

1.4 试验方法

1.4.1 发酵工艺参数优化

1.4.1.1 发酵工艺参数的单因素试验设计

以半纤维素、总糖和总酸含量为因变量,选取初始pH、发酵时间、水料比、菌酶添加量和发酵温度5个主要考察因素,每个因素分别设置5个水平,通过单因素试验对酱香型鲜白酒糟的发酵条件进行初步摸索和优化,每个水平设3个重复。以20 g酱香型鲜白酒糟为发酵底物,具体发酵工艺参数的单因素试验设计见表1,其中水料比为体积/质量比,菌酶添加量为质量百分比。
表1 发酵工艺参数的单因素试验设计

Table 1 Single-factor experiment design for fermentation process parameters

因素
Factors		 水平Levels
1 2 3 4 5
初始pH Initial pH 5.2 5.6 6.0 6.4 6.8
发酵时间Fermentation time/h 12 16 20 24 28
水料比Water-to-feed ratio 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6
菌酶添加量Bacterial-enzyme additive amount/% 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
发酵温度Fermentation temperature/℃ 25 30 35 40 45

1.4.1.2 发酵工艺参数的响应面试验设计

基于单因素试验结果,依据响应面法(response surface method,RSM)中的Box-Behnken中心组合试验设计原理,以发酵酱香型鲜白酒糟的半纤维素含量(%)为响应值,设计响应面试验对酱香型鲜白酒糟发酵工艺参数进行优化。试验拟合出的二次多项式方程如下:
Y=a0+a1A+a2B+a3C+a4D+a12AB+a13AC+a14AD+
a23BC+a24BD+a34CD+a11A2+a22B2+a33C2+a44D2。
式中:Y为因变量,代表半纤维素含量;A、B、C、D为自变量,分别代表初始pH、水料比、菌酶添加量和发酵温度;a0为设计中心点拟合响应值;a1、a2、a3、a4为线性系数;a12、a13、a14、a23、a24、a34为交叉系数;a11、a22、a33、a44是二次系数。
采用Design-Expert 12.0.0软件分析试验数据并计算预测响应值。取预测最优值进行试验以验证拟合模型的有效性。

1.4.2 发酵前后的品质研究

1.4.2.1 养分含量测定

待测样品中的总能采用全自动氧弹式量热仪测定,水分、粗蛋白质、粗脂肪等养分含量测定方法参考依据如表2所示。
表2 养分含量测定方法的参考依据

Table 2 Reference for determination methods of nutrient contents

项目Items 测定方法的参考依据Reference for the determination method
干物质DM 《饲料中水分的测定》(GB/T 6435—2014)
粗蛋白质CP 《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》(GB/T 6432—2018)
粗脂肪EE 《饲料中粗脂肪的测定》(GB/T 6433—2006)
粗纤维CF 《饲料中粗纤维的含量测定》(GB/T 6434—2022)
中性洗涤纤维NDF 《饲料中中性洗涤纤维(NDF)的测定》(GB/T 20806—2022)
酸性洗涤纤维ADF 《饲料中酸性洗涤纤维的测定》(NY/T 1459—2022)
粗灰分Ash 《饲料中粗灰分的测定》(GB/T 6438—2007)
钙Ca 《饲料中钙的测定》(GB/T 6436—2018)
总磷TP 《饲料中总磷的测定分光光度法》(GB/T 6437—2018)
17种水解氨基酸17 hydrolyzed AAs 《饲料中氨基酸的测定》(GB/T 18246—2019)
色氨酸Trp 《饲料中色氨酸的测定》(GB/T 15400—2018)

1.4.2.2 超微结构观察

将导电胶带粘贴固定到试样台上,取少量干燥的待测样品,将样品均匀散落于导电胶带上,利用洗耳球轻轻吹去浮在表面的样品,将其放置于扫描电镜下观察超微结构。

1.4.2.3 蛋白质结构分析

将待测样品于65 ℃烘干后粉碎过60目筛,取2 mg样品与200 mg溴化钾(光谱纯)红外线灯下研磨并混合均匀,研磨期间要防止样品洒落并且保持干燥,样品被溴化钾包裹后放入模具压片,制成薄而透明、质地均匀压片。将压片放进傅里叶变换红外光谱仪,在分辨率为4 cm-1,光谱范围为4 000~400 cm-1的条件下扫描,每张光谱累计扫描32次。所得谱图利用OMNIC 8.2软件进行去卷积增强图谱的分辨率,然后将数据带入Origin 8.5绘图软件,得到红外光谱图。

1.4.2.4 微生物组成分析

将发酵前后的酱香型鲜白酒糟取样后保存在-80 ℃冰箱,送至上海美吉生物医药科技有限公司进行微生物16S测序分析,每个样品3个重复,分析数据在美吉生物云平台(https://analysis.majorbio.com)进行α多样性(Ace、Chao1、Sobs、Shannon、Simpson和Coverage指数)、β多样性[主坐标分析(PCoA)]和微生物组成分析,用于评估发酵前后酱香型鲜白酒糟中不同物种的丰度和功能差异。

1.4.3 生长猪的氨基酸回肠消化率测定试验

1.4.3.1 试验设计与饲养管理

选取10头初始体重为(22.46±1.13) kg的“杜×长×大”三元杂交去势公猪,进行回肠末端T型瘘管安装手术,手术过程参照GB/T 40830—2021。采用5×5拉丁方设计,分别饲喂1种无氮饲粮和4种试验饲粮(包含酱香型鲜白酒糟饲粮和发酵酱香型鲜白酒糟饲粮以及2种本文未涉及的试验饲粮),本文中氨基酸回肠消化率测定试验用到的3种饲粮(无氮饲粮、酱香型鲜白酒糟饲粮和发酵酱香型鲜白酒糟饲粮)的组成及营养水平见表3。试验共5个周期,每个周期7 d,包括恢复期3 d,预试期3 d,正试期2 d。
表3 氨基酸回肠消化率测定试验所用饲粮组成及营养水平(干物质基础)

Table 3 Dietary composition and nutrient levels for AA ileal digestibility determination experiment (DM basis) %

项目
Items		 无氮饲粮
NFD		 酱香型鲜白酒糟饲粮
Fresh Maotai-flavor
Baijiu lees diet		 发酵酱香型鲜白酒糟饲粮
Fermented fresh Maotai-
flavor Baijiu lees diet
原料Ingredients
玉米淀粉Corn starch 78.90 58.90 58.90
酱香型鲜白酒糟
Fresh Maotai-flavor Baijiu lees		 24.50
发酵酱香型鲜白酒糟
Fermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees		 24.50
蔗糖Sucrose 10.00 10.00 10.00
豆油Soybean oil 3.00 3.00 3.00
羧甲基纤维素CMC 4.00
碳酸钙CaCO3 0.50 0.50 0.50
磷酸氢钙CaHPO4 2.20 2.20 2.20
三氧化二铬Cr2O3 0.30 0.30 0.30
氯化钠NaCl 0.40 0.40 0.40
维生素预混料Vitamin premix1) 0.05 0.05 0.05
矿物质预混料Mineral premix2) 0.15 0.15 0.15
碳酸钾K2CO3 0.40
氧化镁MgO 0.10
合计Total 100.00 100.00 100.00
营养水平Nutrient levels3)
粗蛋白质CP 0.28 4.05 4.08
钙Ca 0.53 0.81 0.70
总磷TP 0.45 0.41 0.41
赖氨酸Lys 0.01 0.04 0.04
蛋氨酸Met 0.00 0.02 0.02

1)维生素预混料为每千克饲粮提供 The vitamin premix provided the following per kg of diets:VA 15 000 IU,VD3 5 000 IU,VE 40 IU,VK3 5 mg,VB1 5 mg,VB2 12.5 mg,VB6 6 mg,VB12 0.06 mg,D-生物素 D-biotin 0.25 mg,D-泛酸 D-pantothenic acid 25 mg,烟酰胺 nicotinamide 50 mg,叶酸 folic acid 2.5 mg。

2)矿物质预混料为每千克饲粮提供 The mineral premix provided the following per kg of diets:Fe (FeSO4·H2O) 100.0 mg,Cu (CuSO4·5H2O) 6.0 mg,Zn (ZnSO4·H2O) 80.0 mg,Mn (MnSO4·H2O) 3.0 mg,I (KI) 0.14 mg,Se (Na2SeO3) 0.25 mg。

3)营养水平均为实测值。Nutrient levels were measured values.

术后将猪置于代谢笼(2.5 m×1.8 m×0.8 m)中单独饲养,手术后恢复期7 d。恢复期结束后开始试验,按其体重4%定量给料,将饲粮分成3等份每天08:00、14:00和18:00等量饲喂,自由饮水。采用2种以上消毒液对圈舍进行交叉消毒,2 d打扫1次圈舍,室内温度控制在26 ℃左右。
虽然酱香型鲜白酒糟饲粮和发酵酱香型鲜白酒糟饲粮与其他2种试验饲粮的动物试验同时进行,但本次试验相关数据独立分析,与其他饲粮互不干扰,不会对结果造成影响;此外,由于酱香型鲜白酒糟经过液态发酵处理后含水量较多,在饲喂过程中按照干物质含量计算饲喂量时,各组间添加了等比例的水,后文中生长猪的消化代谢试验情况相同。

1.4.3.2 样品采集

回肠食糜:收集期,每天饲喂后2 h开始收集回肠食糜。将密封袋用橡皮筋固定在猪回肠外置瘘管上,每隔20~30 min更换1次密封袋。将收集好的回肠食糜样品编号保存,及时放入-20 ℃冰箱。试验结束后,将食糜按照动物、期数、饲粮对应混合,放入真空冷冻干燥机冷冻干燥,干燥后粉碎过40目筛,放入-20 ℃冰箱保存待测。
试验饲粮:按照期数及时保存,放入真空冷冻干燥机冷冻干燥后粉碎过40目筛,放入-20 ℃冰箱保存待测。

1.4.3.3 测定指标

测定所有回肠食糜的粗蛋白质和18种氨基酸含量,以及试验饲粮的粗蛋白质、钙、总磷和18种氨基酸含量,具体测定方法同1.4.2.1。所有回肠食糜和试验饲粮的三氧化二铬(Cr2O3)含量采用比色法通过分光光度计测定。氨基酸表观回肠消化率(AID)、回肠内源氨基酸损失(BIAA)和氨基酸标准回肠消化率(SID)的计算公式如下:
氨基酸AID(%)=[1-(回肠食糜氨基酸含量/待测试验饲粮氨基酸含量)×(回肠食糜Cr2O3含量/待测试验饲粮Cr2O3含量)]×100;
BIAA=饲喂无氮饲粮时回肠食糜氨基酸含量×(无氮饲粮Cr2O3含量/饲喂无氮饲粮时回肠食糜Cr2O3含量);
氨基酸SID(%)=氨基酸AID+(BIAA/待测试验饲粮氨基酸含量)×100。

1.4.4 生长猪的消化代谢试验

1.4.4.1 试验设计与饲养管理

选取10头初始体重为(15.34±0.55) kg的健康“杜×长×大”三元杂交去势公猪,随机分配到5×5拉丁方试验,分别饲喂1种基础饲粮和4种试验饲粮(包含酱香型鲜白酒糟饲粮和发酵酱香型鲜白酒糟饲粮以及2种本文未涉及的试验饲粮)。酱香型鲜白酒糟饲粮和发酵酱香型鲜白酒糟饲粮是依照等能等氮原则分别用发酵前后的酱香型鲜白酒糟替代基础饲粮中15%的玉米进行配制,其营养水平根据11~25 kg仔猪营养需要量[NRC(2012)]确定。本文中消化代谢试验所用到的饲粮组成及营养水平见表4。试验共5个周期,每个周期7 d,包含恢复期3 d,预试期3 d,正试期2 d。
表4 消化代谢试验饲粮组成及营养水平(干物质基础)

Table 4 Dietary composition and nutrient levels for digestive and metabolism experiment (DM basis) %

项目
Items		 基础饲粮
Basic diet		 酱香型鲜白酒糟饲粮
Fresh Maotai-
flavor Baijiu lees diet		 发酵酱香型鲜白酒糟饲粮
Fermented fresh Maotai-
flavor Baijiu lees diet
原料Ingredients
玉米Corn 68.52 53.52 53.52
豆粕Soybean meal 27.88 27.88 27.88
酱香型鲜白酒糟
Fresh Maotai-flavor Baijiu lees		 15.00
发酵酱香型鲜白酒糟
Fermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees		 15.00
L-赖氨酸盐酸盐L-Lys·HCl 0.45 0.45 0.45
DL-蛋氨酸DL-Met 0.10 0.10 0.10
L-苏氨酸L-Thr 0.12 0.12 0.12
L-色氨酸L-Trp 0.05 0.05 0.05
氯化胆碱Choline chloride 0.15 0.15 0.15
碳酸钙CaCO3 0.45 0.45 0.45
磷酸氢钙CaHPO4 1.15 1.15 1.15
氯化钠NaCl 0.30 0.30 0.30
三氧化二铬Cr2O3 0.30 0.30 0.30
维生素预混料Vitamin premix1) 0.03 0.03 0.03
矿物质预混料Mineral premix2) 0.50 0.50 0.50
合计Total 100.00 100.00 100.00
营养水平Nutrient levels3)
粗蛋白质CP 17.93 20.73 21.21
钙Ca 0.63 0.74 0.82
总磷TP 0.42 0.51 0.54
赖氨酸Lys 1.45 1.35 1.31
蛋氨酸Met 0.15 0.16 0.17

1)维生素预混料为每千克饲粮提供 The vitamin premix provided the following per kg of diets:VA 15 000 IU,VD3 5 000 IU,VE 40 IU,VK3 5 mg,VB1 5 mg,VB2 12.5 mg,VB6 6 mg,VB12 0.06 mg,D-生物素 D-biotin 0.25 mg,D-泛酸 D-pantothenic acid 25 mg,烟酰胺 nicotinamide 50 mg,叶酸 folic acid 2.5 mg。

2)矿物质预混料为每千克饲粮提供 The mineral premix provided the following per kg of diets:Fe (FeSO4·H2O) 100.0 mg,Cu (CuSO4·5H2O) 6.0 mg,Zn (ZnSO4·H2O) 80.0 mg,Mn (MnSO4·H2O) 3.0 mg,I (KI) 0.14 mg,Se (Na2SeO3) 0.25 mg。

3)营养水平均为实测值。Nutrient levels were measured values.

将猪置于代谢笼(2.5 m×1.8 m×0.8 m)中单独饲养,每天按其体重的4%定量给料,每天分别在08:00和14:00等量饲喂,自由饮水。采用2种以上消毒液对圈舍进行交叉消毒,2 d打扫1次圈舍,室内温度控制在26 ℃左右。

1.4.4.3 样品采集

试验饲粮按期数混合,放入真空冷冻干燥机干燥,粉碎后过40目筛,编号保存于-20 ℃待测。
收集期饲喂2 h后开始收集粪便,粪样保存在-20 ℃冰箱中。待饲养试验结束后按期数混合所收集到的粪便,然后放入真空冷冻干燥机中冻干至干燥状态,回潮24 h至恒重,计算初水率。干燥好的粪样经粉碎后过40目筛,编号装袋于-20 ℃冰箱保存待测。
收集期开始前在集尿盘漏斗处粘贴6层纱布,将倒有50 mL 10%硫酸溶液的尿桶放在集尿盘漏斗处正下方收集每头猪的尿液。
每天在同一时间点收集尿液并使用量筒测量尿液体积,并计算每头猪尿液总体积。用6层纱布将收集的尿液进行第2次过滤,过滤后编号保存部分尿样于-20 ℃冰箱。试验结束后,将全部尿样按编号混合均匀,使用8层纱布进行第3次过滤,最终过滤好的尿样量取等量体积放入50 mL离心管中,冷冻保存待测。

1.4.4.4 测定指标

测定所有饲粮和粪便样品的水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分(Ash)、粗纤维、钙、总磷含量及总能,具体测定方法同1.4.2.1。Cr2O3含量采用比色法通过分光光度计测定。
尿能测定方法:1)将定量滤纸裁剪成重量为0.25 g的圆形纸片,裁好的纸片折叠成碗状,塞入铁坩埚;2)滴加尿样到滤纸上至滤纸完全湿润后放入65 ℃烘箱,烘干后再次滴加直至滤纸上累计有10~15 mL尿样;3)65 ℃烘干后用氧弹量热仪测定;4)同步做2个以上空白。
根据测定结果分别计算饲粮和待测原料养分的全肠道消化率(total tract digestibility, TTD)、消化能和代谢能,计算公式如下:
饲粮养分TTD(%)=[(食入饲粮的养分含量-粪中的养分含量)/食入饲粮的养分含量]×100;
饲粮消化能(MJ/kg)=(食入饲粮总能-粪能)/食入饲粮总量;
饲粮代谢能(MJ/kg)=(食入饲粮总能-粪能-尿能)/食入饲粮总量;
待测原料养分TTD(%)=100×[(试验饲粮养分TTD-基础饲粮养分TTD)/(待测原料
养分含量/试验饲粮养分含量)]+基础饲粮养分TTD。
待测原料消化能或代谢能(MJ/kg)=(试验饲粮消化能或代谢能-基础饲粮消化能或代谢能×A)/B。
式中:A为试验饲粮中基础饲粮所占比例;B为试验饲粮中待测原料所占比例,A+B=100。

1.5 数据统计与分析

通过Excel 2019整理数据,然后用SPSS 24.0软件进行统计分析,单因素试验数据采用单因素方差分析,用Duncan氏法进行多重比较;2组数据比较采用t检验。响应面试验采用Design-Expert 12.0.0软件进行回归模型构建和方差分析。试验结果用平均值和均值标准误(SEM)表示,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 发酵工艺参数优化及发酵后的品质变化

2.1.1 发酵工艺参数的单因素试验结果

以试验原料的半纤维素、总糖和总酸含量为对照,单因素试验结果如图1~5所示,酱香型鲜白酒糟发酵工艺参数中,以半纤维素、总糖和总酸含量为因变量,得到的适宜水料比为2.0、2.0和1.8,适宜发酵温度为40、35和30 ℃。以降低酱香型鲜白酒糟半纤维素和总糖含量为发酵条件时,得到的最佳发酵时间、水料比和菌酶添加量一致,分别为28 h、2.0和0.2%,最佳的初始pH和发酵温度不一致。以总酸含量为因变量时,得到的最佳发酵工艺为初始pH 5.2、发酵时间16 h、水料比1.8、菌酶添加量0.4%、发酵温度30 ℃,与其余2种因变量得到的最佳发酵工艺参数有所差异。
图1 初始pH对发酵酱香型鲜白酒糟半纤维素、总糖和总酸含量的影响

数据柱标记*表示差异显著(P<0.05),标记**(P<0.01)、***(P<0.001)、****(P<0.000 1)表示差异极显著。下图同。

Fig.1 Effects of initial pH on contents of hemicellulose, total sugar and total acid of fermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees

Data columns marked with * mean significant difference (P<0.05), and with ** (P<0.01), *** (P<0.001) and **** (P<0.000 1) mean extremely significant difference. The same as below.

图2 发酵时间对发酵酱香型鲜白酒糟半纤维素、总糖和总酸含量的影响

Fig.2 Effects of fermentation time on contents of hemicellulose, total sugar and total acid of fermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees

图3 水料比对发酵酱香型鲜白酒糟半纤维素、总糖和总酸含量的影响

Fig.3 Effects of water-to-feed ratio on contents of hemicellulose, total sugar and total acid of fermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees

图4 菌酶添加量对发酵酱香型鲜白酒糟半纤维素、总糖和总酸含量的影响

Fig.4 Effects of bacterial-enzyme additive amount on contents of hemicellulose, total sugar and total acid of fermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees

图5 发酵温度对发酵酱香型鲜白酒糟半纤维素、总糖和总酸含量的影响

Fig.5 Effects of fermentation temperature on contents of hemicellulose, total sugar and total acid of fermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees

2.1.2 发酵工艺参数的响应面试验结果

根据单因素试验结果,以半纤维素含量为响应值,采用响应面法中的Box-Behnken设计对4个因素(A为初始pH,B为水料比,C为菌酶添加量,D为发酵温度)进行优化,研究各变量的响应模式,确定最佳水平。选取的A、B、C、D变量水平范围为5.6~6.4、1.8~2.2、0.1%~0.3%和35~45 ℃。响应面试验设计以及其半纤维素含量观测值和预测值见表5。
表5 发酵酱香型鲜白酒糟响应面试验设计以及其半纤维素含量的观测值和预测值

Table 5 Design of the response surface experiment of fermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees, and observed and predicted values of hemicellulose content

序号
No.		 因素Factors 半纤维素Hemicellulose/%
初始pH
Initial pH
(A)		 水料比
Water-to-
feed ratio (B)		 菌酶添加量
Bacterial-enzyme
additive amount
(C)/%		 发酵温度
Fermentation
temperature
(D)/℃		 观测值
Observed
value		 预测值
Predicted
value
1 6.0(0) 2.2(1) 0.2(0) 35(-1) 9.26 9.18
2 6.4(1) 1.8(-1) 0.2(0) 40(0) 9.31 9.21
3 6.4(1) 2.0(0) 0.1(-1) 40(0) 9.72 9.67
4 6.4(1) 2.0(0) 0.3(1) 40(0) 8.95 8.86
5 6.4(1) 2.0(0) 0.2(0) 35(-1) 9.23 9.33
6 6.0(0) 2.2(1) 0.3(1) 40(0) 8.75 8.71
7 6.0(0) 1.8(-1) 0.1(-1) 40(0) 9.45 9.41
8 6.0(0) 2.0(0) 0.1(-1) 45(1) 9.43 9.40
9 6.4(1) 2.2(1) 0.2(0) 40(0) 9.28 9.32
10 5.6(-1) 2.2(1) 0.2(0) 40(0) 8.95 8.90
11 5.6(-1) 2.0(0) 0.1(-1) 40(0) 9.38 9.25
12 6.0(0) 2.2(1) 0.2(0) 45(1) 9.06 9.05
13 6.0(0) 2.0(0) 0.2(0) 40(0) 9.10 9.06
14 6.0(0) 2.0(0) 0.2(0) 40(0) 8.90 9.06
15 6.0(0) 2.0(0) 0.3(1) 45(1) 8.55 8.59
16 5.6(-1) 1.8(-1) 0.2(0) 40(0) 8.86 8.79
17 6.0(0) 2.0(0) 0.2(0) 40(0) 9.18 9.06
18 6.0(0) 2.0(0) 0.2(0) 40(0) 8.91 9.06
19 5.6(-1) 2.0(0) 0.3(1) 40(0) 8.36 8.44
20 6.0(0) 1.8(-1) 0.2(0) 35(-1) 9.01 9.07
21 6.0(0) 2.0(0) 0.1(-1) 35(-1) 9.40 9.53
22 6.0(0) 1.8(-1) 0.3(1) 40(0) 8.50 8.60
23 6.0(0) 1.8(-1) 0.2(0) 45(1) 8.89 8.94
24 6.4(1) 2.0(0) 0.2(0) 45(1) 9.28 9.20
25 6.0(0) 2.2(1) 0.1(-1) 40(0) 9.37 9.52
26 6.0(0) 2.0(0) 0.3(1) 35(-1) 8.77 8.72
27 6.0(0) 2.0(0) 0.2(0) 40(0) 9.12 9.06
28 5.6(-1) 2.0(0) 0.2(0) 35(-1) 9.01 8.91
29 5.6(-1) 2.0(0) 0.2(0) 45(1) 8.70 8.78

设计矩阵中的每个因素设置3个梯度:-1为低水平,0为中心水平,1为高水平。

Three gradients were set for each factor in the design matrix: -1 for low level, 0 for central level, and 1 for high level.

通过对试验结果进行多元回归分析,拟合出以发酵酱香型鲜白酒糟的半纤维素含量(Y)为因变量的多元二次方程:Y=9.04+0.209 7A+0.053 6B-0.405 9C-0.065 8D-0.028 9AB+0.062 9AC+0.090 3AD+0.080 1BC-0.019 6BD-0.063 5CD+0.045 6A2+0.004 1B2-0.003 2C2-0.007 3D2(其中,A为初始pH,B为水料比,C为菌酶添加量,D为发酵温度),4个因素对响应值的影响顺序为:菌酶接种量>初始pH>发酵温度>水料比。
半纤维素含量拟合模型的方差分析结果如表6所示,该拟合模型极显著(P<0.000 1),失拟项不显著(P=0.971 7);模型的决定系数(R2)=0.961 3,表明拟合程度较好;调整决定系数(Adj R2)=0.922 6,表明回归方程拟合结果与实际情况较符合,模型可用于理论预测。方差分析的结果说明,A、C和D对半纤维素含量均有显著影响(P<0.05),4种发酵因素的所有交互项和二次项对半纤维素含量均无显著影响(P>0.05)。发酵酱香型鲜白酒糟半纤维素含量的残差拟合图见图6,残差点大部分分布在一条直线上,部分散落于直线附近,代表模型拟合程度较高。
表6 发酵酱香型鲜白酒糟半纤维素含量拟合模型的方差分析

Table 6 Variance analysis of the fitting model for hemicellulose content of fermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees

方差来源
Variance sources		 平方和
Sum of squares		 自由度
df		 均方差
Mean square		 F值
F-value		 P值
P-value		 显著性
Significance
模型Model 2.700 0 14 0.193 0 24.840 0 <0.000 1 显著
A 0.527 5 1 0.527 5 67.900 0 <0.000 1 显著
B 0.034 5 1 0.034 5 4.440 0 0.053 6 不显著
C 1.980 0 1 1.980 0 254.440 0 <0.000 1 显著
D 0.052 0 1 0.052 0 6.690 0 0.021 5 显著
AB 0.003 3 1 0.003 3 0.431 2 0.522 1 不显著
AC 0.015 8 1 0.015 8 2.040 0 0.175 3 不显著
AD 0.032 6 1 0.032 6 4.200 0 0.059 7 不显著
BC 0.025 7 1 0.025 7 3.300 0 0.090 5 不显著
BD 0.001 5 1 0.001 5 0.198 5 0.662 7 不显著
CD 0.016 1 1 0.016 1 2.070 0 0.171 8 不显著
A2 0.013 5 1 0.013 5 1.730 0 0.209 2 不显著
B2 0.000 1 1 0.000 1 0.014 2 0.906 7 不显著
C2 0.000 1 1 0.000 1 0.008 6 0.927 4 不显著
D2 0.000 3 1 0.000 3 0.045 0 0.835 1 不显著
残差Residual 0.108 8 14 0.007 8
失拟项Lack of fit 0.040 1 10 0.004 0 0.233 5 0.971 7 不显著
纯误差Pure error 0.068 7 4 0.017 2
总和Sum 2.810 0 28
决定系数R2 0.961 3
调整决定系数Adj R2 0.922 6

A:初始pH initial pH;B:水料比 water-to-feed radio;C:菌酶添加量 bacterial-enzyme additive amount;D:发酵温度 fermentation temperature。

图6 发酵酱香型鲜白酒糟半纤维素含量的残差拟合图

Fig.6 Residual fitting plot of fermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees

发酵酱香型鲜白酒糟的4种试验因素的所有交互项对半纤维素含量均无显著影响,但交互因素间半纤维素含量变化有一定趋势。由图7-a可知,水料比固定时,半纤维素含量随初始pH降低而降低;由图7-b可知,初始pH固定时,半纤维素含量随菌酶添加量提高而降低;由图7-c可知,初始pH固定时,半纤维素含量随发酵温度提高而降低;由图7-d可知,水料比固定时,半纤维素含量随菌酶添加量提高而降低;由图7-e可知,发酵温度固定时,半纤维素含量随水料比提高而提高;由图7-f可知,发酵温度固定时,半纤维素含量随菌酶添加量提高而降低。
图7 初始pH(A)、水料比(B)、菌酶添加量(C)和发酵温度(D)对半纤维素含量的响应面3D图

Fig.7 3D plots of response surfaces of initial pH (A), water-to-feed ratio (B), bacterial-enzyme additive amount (C) and fermentation temperature (D) to hemicellulose content

经Design Expert 12.0.0软件的优化,酱香型鲜白酒糟的最佳发酵工艺为初始pH 5.679,水料比1.837,菌酶添加量0.293%,发酵温度43.735 ℃;在此优化条件下半纤维素含量预测值达到最小为8.214%。因半纤维素和总糖的含量在发酵时间28 h时均极显著降低,发酵时间选定28 h。考虑试验实际可操作性,修正最佳发酵工艺为初始pH 5.7,发酵时间28 h,水料比1.8,菌酶添加量0.3%,发酵温度43.7 ℃,后续试验所用到的发酵酱香型鲜白酒糟均是在此发酵工艺条件下制备。

2.1.3 养分含量变化

由表7和表8可知,菌酶协同液态发酵的处理方式对酱香型鲜白酒糟的常规养分和除胱氨酸外17种氨基酸含量均具有显著影响(P<0.05),与未发酵的酱香型鲜白酒糟相比,发酵酱香型鲜白酒糟粗蛋白质和粗脂肪含量分别显著提高了10.74%和10.22%(P<0.05),粗纤维含量显著降低了21.02%(P<0.05);与未发酵的酱香型鲜白酒糟相比,发酵酱香型鲜白酒糟中,除胱氨酸外的17种氨基酸以及总氨基酸含量均显著提高(P<0.05)。
表7 发酵前后酱香型鲜白酒糟的常规养分含量变化(干物质基础)

Table 7 Changes in common nutrient content of fresh Maotai-flavor Baijiu lees before and after fermentation (DM basis) %

项目
Items		 未发酵
Unfermented		 发酵
Fermented		 变化率
Rate of change		 均值标准误
SEM		 P值
P-value
粗蛋白质CP 22.48 24.90 10.74 0.061 <0.001
粗脂肪EE 18.65 20.55 10.22 0.283 <0.001
粗纤维CF 11.88 9.38 -21.02 0.562 0.011
中性洗涤纤维NDF 35.85 30.33 -15.41 0.481 <0.001
酸性洗涤纤维ADF 25.30 21.78 -13.90 0.410 0.001
粗灰分Ash 6.05 8.83 46.09 0.051 <0.001
钙Ca 1.42 2.30 61.74 0.113 <0.001
磷P 0.40 0.47 18.33 0.021 0.012
表8 发酵前后酱香型鲜白酒糟氨基酸含量变化(干物质基础)

Table 8 Changes in AA contents of fresh Maotai-flavor Baijiu lees before and after fermentation (DM basis) %

项目
Items		 未发酵
Unfermented		 发酵
Fermented		 均值标准误
SEM		 P值
P-value
精氨酸Arg 0.49 0.55 0.011 0.006
组氨酸His 0.31 0.35 0.012 0.001
异亮氨酸Ile 0.63 0.72 0.012 0.004
亮氨酸Leu 1.73 2.04 0.040 0.001
赖氨酸Lys 0.28 0.31 0.011 0.030
蛋氨酸Met 0.32 0.35 0.010 0.036
苯丙氨酸Phe 0.80 0.92 0.021 0.002
苏氨酸Thr 0.59 0.66 0.013 0.003
色氨酸Trp 0.16 0.27 0.014 0.001
缬氨酸Val 0.79 0.90 0.012 0.001
丙氨酸Ala 1.34 1.60 0.033 0.002
天冬氨酸Asp 1.09 1.25 0.020 0.001
胱氨酸Cys 0.16 - - -
谷氨酸Glu 4.77 5.25 0.082 0.004
甘氨酸Gly 0.69 0.77 0.011 0.004
脯氨酸Pro 3.66 4.03 0.052 0.003
丝氨酸Ser 0.75 0.82 0.021 0.017
酪氨酸Tyr 0.69 0.74 0.020 0.038
总氨基酸TAA 19.25 21.51 0.340 0.003

-:未测出 Not detected。

2.1.4 超微结构、蛋白质结构和微生物组成变化

图8-a、图8-c为未发酵的酱香型鲜白酒糟的扫描电镜图,能看出较明显的丝状纤维结构,表面较为平滑,而发酵后(图8-b、图8-d)表面粗糙且孔隙增加。图9是发酵前后酱香型鲜白酒糟的红外光谱图,发酵酱香型鲜白酒糟在1 650和2 930 cm-1处吸收峰有明显增强,说明发酵酱香型鲜白酒糟的蛋白质二级结构发生定向转变。
图8 发酵前后酱香型鲜白酒糟扫描电镜图

a、c:未发酵 unfermented;b、d:发酵 fermented。

Fig.8 SEM images of fresh Maotai-flavor Baijiu lees before and after fermentation (1 000×)

图9 发酵前后酱香型鲜白酒糟红外光谱图

Fig.9 Infrared spectrum diagram of fresh Maotai-flavor Baijiu lees before and after fermentation

α多样性分析反映单个样品物种丰度及物种多样性,由表9可知,发酵酱香型鲜白酒糟微生物Ace、Chao1、Sobs指数显著低于未发酵(P<0.05),说明发酵后微生物的物种丰富度降低;发酵前后酱香型鲜白酒糟微生物Shannon、Simpon指数差异不显著(P>0.05),可见发酵对物种均匀度和多样性影响不大;Coverage指数大于99.9%,说明分析结果能够反映样本中微生物组成的真实情况。图10的β多样性分析显示,主成分1(PC1)解释了93.97%的群落变异,表明样本间最主要的差异集中在一维;未发酵的酱香型鲜白酒糟微生物样本在PC1上得分几乎相同,呈竖直分布,说明其微生物组成在主要变异轴上高度一致;发酵后微生物在PC1上形成独立聚集区,与未发酵的明显分离,提示二者核心菌群存在决定性差异。
表9 发酵前后酱香型鲜白酒糟的微生物α多样性分析

Table 9 Analysis of microbial α diversity of fresh Maotai-flavor Baijiu lees before and after fermentation

项目
Items		 未发酵
Unfermented		 发酵
Fermented		 均值标准误
SEM		 P值
P-value
Ace指数Ace index 311.94 81.14 9.750 <0.001
Chao1指数Chao1 index 311.23 79.62 10.161 <0.001
Sobs指数Sobs index 301.00 77.33 14.182 <0.001
Shannon指数Shannon index 2.25 2.33 0.343 0.832
Simpson指数Simpson index 0.44 0.24 0.082 0.122
Coverage指数Coverage index 1.00 1.00 0.000 0.171
图10 发酵前后酱香型鲜白酒糟微生物主坐标分析图

Fig.10 PCoA diagram for microbial of fresh Maotai-flavor Baijiu lees before and after fermentation

图11为发酵前后酱香型鲜白酒糟的微生物组成分析circos图,未发酵酱香型鲜白酒糟的微生物组成主要分布为醋酸杆菌属(76%)和其他杂菌,发酵后的微生物组成以肠球菌属(62%)和梭状芽孢杆菌属(25%)为主。图12为发酵前后的微生物功能预测热图,酱香型鲜白酒糟在磷酸转运系统与淀粉和蔗糖代谢通路的相关性在经过发酵处理后由负相关转变为正相关。
图11 发酵前后酱香型鲜白酒糟微生物组成circos图

H3、H1、H2:发酵酱香型鲜白酒糟 fermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees;G2、G1、G3:未发酵酱香型鲜白酒糟 unfermented fresh Maotai-flavor Baijiu lees;Acetobacter:醋酸杆菌属;Enterococcus:肠球菌属;Clostridium:梭状芽孢杆菌属;Lysinibacillus:赖氨酸芽孢杆菌属;Acinetobacter:不动杆菌属;Paenibacillus:类芽孢杆菌属;Heyndrickxia:凝结芽孢杆菌属;Bacillus:芽孢杆菌属;unclassified_f_Enterobacteriaceae:未分类肠杆菌科;Pseudomonas:假单胞菌属;Lactobacillus:乳杆菌属;norank_o_Chloroplast:未排序叶绿体;Bifidobacterium:双歧杆菌属;Weissella:魏斯氏菌属;Burkholderia-Caballeronia-Paraburkho:伯克霍尔德菌属-卡巴列罗菌属-副伯克霍尔德菌属;Blautia:布劳特氏菌属;Lactiplantibacillus:植物乳杆菌属;unclassified_o_Enterobacterales:未分类肠杆菌目;Romboutsia:罗姆布茨菌属;Fusicatenibacter:梭链杆菌属;Aquabacterium:水杆菌属;others:其他。下图同The same as below。

Fig.11 Circos diagram of microbial composition of fresh Maotai-flavor Baijiu lees before and after fermentation

图12 发酵前后酱香型鲜白酒糟微生物功能预测热图

Propanoate metabolism:丙酸代谢;2-Oxocarboxylic acid metabolism:氧代羧酸代谢;Peptidoglycan biosynthesis:肽聚糖生物合成;Methane metabolism:甲烷代谢;Fructose and mannose metabolism:果糖与甘露糖代谢;Homologous recombination:同源重组;Pentose phosphate pathway:磷酸戊糖途径;Carbon fixation pathways in prokaryotes:原核生物碳固定途径;Alanine, aspartate and glutamate metabolism:丙氨酸、天冬氨酸与谷氨酸代谢;Glycine, serine and threonine metabolism:甘氨酸、丝氨酸与苏氨酸代谢;Porphyrin and chlorophyll metabolism:卟啉与叶绿素代谢;Phosphotransferase system(PTS):磷酸转移酶系统;Aminoacyl-tRNA biosynthesis:氨酰-tRNA生物合成;Cysteine and methionine metabolism:半胱氨酸与蛋氨酸代谢;Pyrimidine metabolism:嘧啶代谢;Amino sugar and nucleotide sugar metabolism:氨基糖与核苷酸糖代谢;Starch and sucrose metabolism:淀粉与蔗糖代谢;Pyruvate metabolism:丙酮酸代谢;Oxidative phosphorylation:氧化磷酸化;Glycolysis/Gluconeogenesis:糖酵解/糖异生;Quorum sensing:群体感应;Purine metabolism:嘌呤代谢;Ribosome:核糖体;Two-component system:双组分系统;ABC transporters:ABC转运蛋白;Carbon metabolism:碳代谢;Biosynthesis of amino acids:氨基酸生物合成;Microbial metabolism in diverse environments:多样环境中的微生物代谢;Biosynthesis of secondary metabolites:次级代谢产物生物合成;Metabolic pathways:代谢途径。

Fig.12 Functional prediction heatmap for microbial of fresh Maotai-flavor Baijiu lees before and after fermentation

2.2 在生长猪上的氨基酸回肠消化率

由表10可知,与未发酵的酱香型鲜白酒糟相比,发酵酱香型鲜白酒糟的粗蛋白质、胱氨酸和甘氨酸的AID均有升高,但是差异不显著(P>0.05);其余16种氨基酸的AID均显著升高(P<0.05)。与未发酵的酱香型鲜白酒糟相比,发酵酱香型鲜白酒糟的粗蛋白质和胱氨酸的SID均有升高,但是差异不显著(P>0.05);其余17种氨基酸的SID均显著升高(P<0.05)。
表10 发酵前后酱香型鲜白酒糟在生长猪上的氨基酸回肠消化率(干物质基础)

Table 10 AA ileal digestibility of fresh Maotai-flavor Baijiu lees before and after fermentation in growing pigs (DM basis) %

项目
Items		 表观回肠消化率AID 标准回肠消化率SID
未发酵
Unfermented		 发酵
Fermented		 均值标准误
SEM		 P值
P-value		 未发酵
Unfermented		 发酵
Fermented		 均值标准误
SEM		 P值
P-value
粗蛋白质CP 40.88 47.54 5.981 0.290 62.84 69.34 5.981 0.301
精氨酸Arg 31.22 53.90 5.261 0.002 80.74 104.99 5.261 0.004
组氨酸His 55.47 69.09 2.562 <0.001 74.32 88.80 2.562 <0.001
异亮氨酸Ile 59.83 75.56 2.371 <0.001 73.33 87.97 2.371 <0.001
亮氨酸Leu 75.01 84.48 1.530 <0.001 83.15 92.37 1.530 <0.001
赖氨酸Lys 29.51 41.25 7.990 0.003 55.57 83.20 7.990 0.006
蛋氨酸Met 62.95 75.96 3.592 0.005 72.42 83.07 3.592 0.014
苯丙氨酸Phe 69.33 80.37 1.840 <0.001 79.06 89.51 1.840 <0.001
苏氨酸Thr 39.56 63.48 5.411 0.001 65.13 92.42 5.411 0.001
色氨酸Trp 55.39 88.19 4.812 <0.001 72.75 98.44 4.812 <0.001
缬氨酸Val 66.52 75.08 2.360 0.005 78.79 90.07 2.360 0.001
丙氨酸Ala 72.97 82.37 1.762 <0.001 85.6 96.18 1.762 <0.001
天冬氨酸Asp 57.85 71.92 3.042 0.001 80.64 93.30 3.042 0.002
胱氨酸Cys 61.83 66.50 4.221 0.295 73.13 79.84 4.221 0.157
谷氨酸Glu 78.81 86.03 2.012 0.005 85.45 92.29 2.012 0.007
甘氨酸Gly 37.13 51.84 10.190 0.180 108.79 142.09 10.190 0.008
脯氨酸Pro 79.31 86.75 2.472 0.013 85.64 92.50 2.472 0.020
丝氨酸Ser 56.72 70.98 3.241 0.001 78.78 95.85 3.241 <0.001
酪氨酸Tyr 65.02 78.04 2.014 <0.001 76.92 89.16 2.014 <0.001

2.3 在生长猪上的养分TTD、消化能和代谢能

由表11可知,与添加未发酵的酱香型鲜白酒糟试验饲粮相比,生长猪对添加发酵酱香型鲜白酒糟试验饲粮的干物质、粗蛋白质、粗纤维和粗灰分的TTD均显著升高(P<0.05),但是中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维消化率的TTD、消化能和代谢能的差异不显著(P≥0.05);与未发酵的酱香型鲜白酒糟相比,生长猪对发酵酱香型鲜白酒糟的养分TTD、消化能和代谢能均无显著变化(P≥0.05)。
表11 发酵前后酱香型鲜白酒糟及其对应试验饲粮在生长猪上的养分全肠道消化率、消化能和代谢能(干物质基础)

Table 11 Nutrient TTD, DG and ME of fresh Maotai-flavor Baijiu lees before and after fermentation and the corresponding experimental diets in growing pigs (DM basis) %

项目
Items		 未发酵
Unfermented		 发酵
Fermented		 均值标准误
SEM		 P值
P-value
饲粮Diets
干物质全肠道消化率DM TTD 80.75 84.19 1.421 0.036
粗蛋白质全肠道消化率CP TTD 75.06 82.65 2.771 0.021
粗脂肪全肠道消化率EE TTD 85.61 88.57 1.352 0.053
粗纤维全肠道消化率CF TTD 21 38.53 3.71 0.001
中性洗涤纤维全肠道消化率NDF TTD 51.02 57.89 3.214 0.059
酸性洗涤纤维全肠道消化率ADF TTD 24.53 27.44 4.392 0.522
粗灰分全肠道消化率Ash TTD 48.28 62.64 2.234 <0.001
消化能DE/(MJ/kg) 14.52 14.99 0.292 0.14
代谢能ME/(MJ/kg) 14.4 14.86 0.281 0.129
酱香型鲜白酒糟Fresh Maotai-flavor Baijiu lees
干物质全肠道消化率DM TTD 92.2 93.48 0.59 0.05
粗蛋白质全肠道消化率CP TTD 90.22 91.94 1.081 0.141
粗脂肪全肠道消化率EE TTD 94.31 95.36 0.543 0.081
粗纤维全肠道消化率CF TTD 73.03 76.45 2.951 0.281
中性洗涤纤维全肠道消化率NDF TTD 82.54 84.96 1.31 0.09
酸性洗涤纤维全肠道消化率ADF TTD 63.79 68.21 3.292 0.21
粗灰分全肠道消化率Ash TTD 76.1 78.93 1.351 0.06
消化能DE/(MJ/kg) 8.92 11.18 1.67 0.201
代谢能ME/(MJ/kg) 8.56 10.85 1.632 0.191

3 讨论

3.1 发酵工艺参数优化及发酵后的品质变化

酱香型鲜白酒糟的粗蛋白质含量适中、氨基酸比例平衡,而且产量大、价格低廉,非常适合作为畜牧业饲粮原料使用。但因为酱香型鲜白酒糟水分含量较高,不易储存;又因其粗纤维含量常常较高,而不易被单胃动物消化和利用[13],降低其粗纤维含量是投入畜牧业生产利用的重要前提。本试验结果表明,利用乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌混合木聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶的复合菌酶制剂对酱香型鲜白酒糟进行液态发酵,能有效降解其半纤维素并提高粗蛋白质含量。木糖是半纤维素的主要成分,Patel等[14]试验结果显示,芽孢杆菌能消耗葡萄糖和木糖并将其转化为乳酸盐;另一项试验结果同样表明了芽孢杆菌具有降解多糖的作用,Konkol等[15]发现,芽孢杆菌可以产生纤维素分解酶和木糖分解酶,利用芽孢杆菌发酵后的菜籽粕粗纤维含量显著降低。本试验单因素试验结果与上述研究结果相符,发酵酱香型鲜白酒糟的总糖含量降低、总酸含量升高,推测是部分多糖被枯草芽孢杆菌分解产生乳酸,使发酵后总酸含量升高。乳酸杆菌是常用于饲料原料发酵的菌种,同时也属于动物肠道中不可或缺的有益菌群。乳酸杆菌在发酵过程中最明显的作用是能够有效控制发酵条件,其快速繁殖后产生大量乳酸使得发酵环境的pH降低,抑制大部分杂菌繁殖,从而改善液体发酵的环境卫生[16]。本试验中,经响应面试验方差分析,4个因素对响应值的影响顺序为菌酶接种量>初始pH>发酵温度>水料比;水料比固定时,半纤维素含量随初始pH降低而降低。研究发现,pH从5.0提高到6.0时乳酸发酵量减少,乳酸杆菌活性受到抑制[17],降低pH有利于乳酸杆菌等微生物对半纤维素等多糖分解,这与本试验结果一致。在4个因素中,菌酶添加量对半纤维素含量的影响是最大的,与其他通过间接调节菌酶活性来影响发酵过程的因素不同,菌酶添加量对发酵体系的作用最为直接,但是菌酶添加量并非越高越好,过量接种会造成菌体过度密集,反而抑制底物营养的有效消耗及降解产物的释放,导致发酵效率下降。
与未发酵的酱香型鲜白酒糟相比,发酵酱香型鲜白酒糟粗蛋白质和粗脂肪含量分别显著提高了10.74%和10.22%,粗纤维含量显著降低了21.02%;与未发酵的酱香型鲜白酒糟相比,发酵酱香型鲜白酒糟中,除胱氨酸外的17种氨基酸以及总氨基酸含量均显著提高,发酵酱香型鲜白酒糟的营养品质明显改善。有研究结果显示,利用产朊假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌对黄酒糟进行发酵,使得其粗蛋白质提高了14.5%[18],与本试验结果相符。结合酱香型鲜白酒糟的微生物组成分析发现,发酵后梭状芽孢杆菌属成为主要微生物之一,其作为厌氧自生固氮菌,在发酵过程中可能利用环境中氮元素[19]。
发酵后的酱香型鲜白酒糟表面粗糙、颗粒变小,可能与微生物的代谢产物或添加的蛋白酶有关[20]。酱香型鲜白酒糟的纤维结构变化尤为明显,可能是由于发酵过程中纤维素分解酶和木糖分解酶对纤维物质进行降解,导致其表面纤维结构发生变化[21]。傅里叶红外光谱技术(FIRT)是将傅里叶变换和红外光谱相结合的方法,多用于测定化学物质官能团、纯度以及蛋白质二级结构等,具有灵敏度高、操作简单和检测灵敏的特点[22]。本试验中,从红外光谱图可以观察到,谱图中的主要吸收峰值集中在波数为1 600~1 700 cm-1的酰胺Ⅰ带,酰胺Ⅰ带是蛋白质二级结构的标志带,发酵后酱香型鲜白酒糟的吸收峰在1 650 cm-1处增强,此处为蛋白质二级结构α-螺旋结构和谷氨酰胺的C=O键伸缩振动的特征峰[23-24];2 930 cm-1处吸收峰有明显增强,该处为C-H键伸缩振动的特征峰,其峰值增强可能是由于发酵过程中多糖被降解,多糖的长链断裂导致更多的CH2和CH3暴露[25],结合扫描电镜图分析,发酵后酱香型鲜白酒糟的蛋白质二级结构向α-螺旋转变,部分纤维结构被分解。
本试验中,微生物组成circos图显示,未发酵的酱香型鲜白酒糟中占比最多的微生物为醋酸杆菌属,发酵后主要是肠球菌属和梭状芽孢杆菌属;发酵酱香型鲜白酒糟对比未发酵的微生物丰富度降低;根据酱香型鲜白酒糟的微生物功能预测热图分析,磷酸转移酶系统在发酵后酱香型鲜白酒糟的微生物分析中呈正相关,结合微生物组成circos图分析,磷酸转移酶系统的基因可能是来源于芽孢杆菌属[26]。磷酸转移酶系统具有非常广泛的调节功能,参与氮、碳代谢[27]。淀粉和蔗糖代谢通路在发酵后的酱香型鲜白酒糟中呈正相关,这意味着发酵后酱香型鲜白酒糟可利用的能量将增多,营养品质得到改善。

3.2 在生长猪上的氨基酸回肠消化率

本试验中,与未发酵的酱香型鲜白酒糟相比,发酵酱香型鲜白酒糟除胱氨酸和甘氨酸外其余16种氨基酸AID均显著升高,除胱氨酸外其余17种氨基酸SID均显著升高,对生长猪的营养价值明显改善。氨基酸消化率的提升可能有2种原因,一是,在菌酶协同作用下,大分子蛋白质被分解,使其转化为更易消化和吸收的小肽[28],Galli等[29]试验结果显示,添加外源蛋白酶显著提高了生长阶段猪的氨基酸SID;二是,通过降解半纤维素缓解其在消化过程中的拮抗作用,半纤维素中阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖、甘露聚糖是非淀粉多糖的主要组成部分,单胃动物体内缺少消化非淀粉多糖的酶,而非淀粉多糖在消化道中会增加食糜黏性,阻碍消化酶与食物中养分接触,食糜快速通过消化道,导致动物对养分的消化利用率降低[2-3]。Upadhaya等[30]试验发现,添加β-甘露聚糖酶饲粮的赖氨酸、精氨酸、组氨酸、缬氨酸和甘氨酸的回肠消化率均显著高于对照。

3.3 在生长猪上的养分TTD、消化能和代谢能

本试验中,与添加未发酵的酱香型鲜白酒糟试验饲粮相比,添加发酵酱香型鲜白酒糟试验饲粮的干物质、粗蛋白质、粗纤维和粗灰分的TTD均显著升高,对生长猪的营养价值明显改善。由于酱香型鲜白酒糟原料中粗蛋白质含量相对较高,发酵过程中蛋白酶和菌株代谢产物通过对其蛋白质结构的影响提升试验饲粮的粗蛋白质的TTD,有研究发现枯草芽孢杆菌能通过改变豆粕的蛋白质结构提升豆粕酸溶蛋白质的含量[31];Shi等[32]利用枯草芽孢杆菌发酵豆粕,结果显示发酵豆粕饲粮的粗蛋白质消化率升高,与本试验结果一致。本试验中,与添加未发酵的酱香型鲜白酒糟试验饲粮相比,发酵酱香型鲜白酒糟试验饲粮中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的TTD、消化能和代谢能的差异均不显著。有研究表明,消化能和代谢能与中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的含量呈负相关,与粗蛋白质含量呈正相关[33]。本试验中,尽管发酵显著提高了酱香型鲜白酒糟试验饲粮的粗蛋白质的TTD,这对能量价值有正向效应;但中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的TTD的停滞,抵消了这部分积极影响。这可能是由于非淀粉多糖若不被有效消化,会阻碍单胃动物对饲粮的养分消化和吸收,若提高饲粮的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的TTD,可显著提高生长猪的全肠道养分及能量的消化率[34-35]。本试验中,由于发酵酱香型鲜白酒糟中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的TTD没有显著提高,消化能和代谢能在统计学上无显著性差异。

4 结论

综上所述,通过液态菌酶协同发酵的处理方式能显著提高酱香型鲜白酒糟的粗蛋白质含量并显著降低其粗纤维含量,以半纤维素含量为响应值的最佳发酵工艺为初始pH 5.7,发酵时间28 h,水料比1.8,菌酶添加量0.3%,发酵温度43.7 ℃;与添加未发酵的酱香型鲜白酒糟饲粮相比,在生长猪对添加发酵后酱香型鲜白酒糟饲粮中除胱氨酸和甘氨酸外的其余16种氨基酸的回肠消化率以及粗蛋白质和粗纤维的TTD均显著提高。因此,液态菌酶协同发酵有效改善了酱香型鲜白酒糟的营养品质和对生长猪的营养价值。

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