动物营养学报 >

2026 , Vol. 38 >Issue 2: 1480 - 1491

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.117

研究论文

3种乳酸菌添加剂对柠条青贮品质及微生物群落结构的影响

  • 白宝超 , 1 ,
  • 郑少龙 2 ,
  • 刘叶飞 3 ,
  • 王明玖 4 ,
  • 格根图 1 ,
  • 贾玉山 1 ,
  • 王志军 , 1, *
展开
  • 1 内蒙古农业大学草业学院,农业农村部饲草栽培、加工与高效利用重点实验室,呼和浩特 010011
  • 2 奈曼旗新镇国有机械林场,通辽 028309
  • 3 鄂尔多斯林业和草原局,鄂尔多斯 017010
  • 4 草业国家技术创新中心,呼和浩特 010060
* 王志军,副教授,硕士生导师,E-mail:

白宝超(1995—),男,内蒙古赤峰人,博士研究生,从事饲草加工与利用研究。E-mail:

Office editor: 陈鑫

收稿日期: 2025-06-30

  网络出版日期: 2026-02-12

基金资助

草业国家技术创新中心(CCPTZX2023B0703)

收起

Effects of Three Lactic Acid Bacteria Additives on Quality and Microflora Structure of Caragana korshinskii Silage

  • BAI Baochao , 1 ,
  • ZHENG Shaolong 2 ,
  • LIU Yefei 3 ,
  • WANG Mingjiu 4 ,
  • GE Gentu 1 ,
  • JIA Yushan 1 ,
  • WANG Zhijun , 1, *
Expand
  • 1 Key Laboratory of Forage Cultivation, Processing and High Efficient Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, College of Grassland Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010011, China
  • 2 Naiman Banner Xinzhen State-Owned Mechanical Forestry, Tongliao 028309, China
  • 3 Ordos Forestry and Grassland Bureau, Ordos 017010, China
  • 4 National Technology Innovation Center for Prataculture, Hohhot 010060, China
* associate professor, E-mail:

Received date: 2025-06-30

  Online published: 2026-02-12

Fold

摘要

本试验旨在通过评价不同乳酸菌添加剂对柠条(Caragana korshinskii Kom.)青贮营养成分、发酵品质及微生物群落的影响,以改善其青贮品质。试验以平茬后第3年开花期柠条为原料,设置对照处理(CK)及分别添加戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus,P. pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici,P. acidilactici)和短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis,L. brevis)的试验处理,每个处理3个重复。青贮60 d后取样,测定其营养成分、发酵品质与微生物群落相关指标。结果表明:与CK处理相比,仅P. acidilactici处理显著改善了柠条青贮品质,主要表现为pH最低,乳酸含量较CK处理增加了42.62%,中性洗涤纤维含量降低了4.6%,同时有效保存了可溶性碳水化合物和粗蛋白质含量,这些变化均达显著水平(P<0.05)。基于高通量测序分析发现,与CK处理相比,P. acidilactici处理显著降低了Shannon指数(P<0.05),并提高了优势菌种面包黏液乳杆菌的相对丰度。相比于其他处理,P. acidilactici处理在丙酮酸代谢和戊糖磷酸途径上表现出更强的富集趋势。综上所述,结合营养成分、发酵品质和微生物群落结构等指标综合评价,添加P. acidilactici可最优地提升柠条青贮品质。

关键词： 柠条; 乳酸菌; 青贮品质; 微生物群落结构

本文引用格式

白宝超 , 郑少龙 , 刘叶飞 , 王明玖 , 格根图 , 贾玉山 , 王志军 . 3种乳酸菌添加剂对柠条青贮品质及微生物群落结构的影响[J]. 动物营养学报, 2026 , 38(2) : 1480 -1491 . DOI: 10.12418/CJAN2026.117

Abstract

This study aimed to improve the silage quality of Caragana korshinskii Kom. by evaluating the effects of different lactic acid bacteria additives on its nutritional composition, fermentation quality, and microflora. The experiment used three-year-old regrowth Caragana korshinskii Kom. at the flowering stage as the raw material. Four treatments were established: a control treatment (CK) and experimental treatments supplemented with Pediococcus pentosaceus (P. pentosaceus), Pediococcus acidilactici (P. acidilactici), and Levilactobacillus brevis (L. brevis), respectively, with three replicates per treatment. After 60 days of ensiling, samples were taken to determine nutritional components, fermentation quality, and microflora-related indicators. The results showed that compared to the CK treatment, only the P. acidilactici treatment significantly improved the silage quality of Caragana korshinskii Kom. This was primarily manifested by the lowest pH value, a 42.62% increase in lactic acid content compared to CK treatment, and a 4.6% reduction in neutral detergent fiber content. Furthermore, it effectively preserved the contents of water-soluble carbohydrates and crude protein, with all these changes reaching significant levels (P<0.05). Based on high-throughput sequencing analysis, compared with the CK treatment, the P. acidilactici treatment significantly decreased the Shannon index (P<0.05) and increased the relative abundance of the dominant strain Lactobacillus sanfranciscensis. Compared with other treatments, the P. acidilactici treatment showed a stronger enrichment trend in pyruvate metabolism and the pentose phosphate pathway. In conclusion, based on a comprehensive evaluation of nutritional components, fermentation quality, and microflora structure, the addition of P. acidilactici optimally enhance the silage quality of Caragana korshinskii Kom.

Key words： Caragana korshinskii; lactic acid bacteria; silage quality; microflora structure

近年来,全球可耕地资源持续缩减与人类膳食结构升级导致肉蛋奶需求激增[1],使传统饲料供给体系承受空前压力。开发非常规饲草资源已成为保障畜牧业可持续发展的迫切需求。柠条(Caragana korshinskii Kom.)作为我国“三北”防护林体系的核心生态屏障树种,兼具显著的防风固沙效益与生物质资源潜力。柠条的强适应性和快速生长特性,为其大规模种植提供了支撑。但生态管理实践表明,生长周期超过3~5年的柠条灌丛,会通过化感作用抑制新枝萌发,同时降低林下生物多样性[2]。周期性平茬是必要的生态管理措施,由此每年会产生约400万 t废弃枝叶[3]。这些枝叶传统上多用作燃料,而近年来多项研究证实,其作为反刍动物饲料具有良好的应用潜力[4-5]。然而,柠条作为豆科植物,具有水溶性碳水化合物(WSC)含量低、粗蛋白质(CP)含量高及缓冲能力强的固有特性。这导致其青贮发酵底物不足,进而表现出pH下降缓慢、发酵质量差等关键问题[6],严重制约了其饲料化利用效率。
优质青贮饲料的核心在于通过乳酸菌(LAB)主导的厌氧发酵,将WSC高效转化为乳酸(LA)等有机酸,驱动pH快速降至4.2以下,从而抑制梭菌、肠杆菌等有害微生物活动,实现营养物质的长期保存[7]。自然附着于植物表面的LAB数量通常低于5 log10 (CFU/g FM),难以保障发酵进程的有效启动[8]。外源添加商业化菌剂虽被广泛采用,但其与特定原料的生态位适应性及功能协同性仍是决定青贮成败的关键[9]。值得注意的是,从原料自身分离的土著LAB菌株,因其天然的环境适应性和代谢特异性,往往表现出优于商品菌剂的定植能力与发酵效能[10-11]。这种“植物-微生物”共生体系的定向挖掘,对突破柠条资源青贮瓶颈具有特殊意义。然而,针对柠条这一特殊生态-经济型资源,其原生LAB菌库的系统研究与开发应用仍处于起步阶段。
当前关于柠条青贮的研究主要集中在商业菌剂对柠条青贮品质的影响,但将柠条本身附着的LAB通过分离筛选并应用到柠条青贮的研究相对较少。青贮过程本质上是微生物群落动态演替的生态过程。因此,为提高柠条青贮品质,深入了解柠条青贮中的微生物群落组成至关重要。本研究利用单分子实时测序技术,凭借超长读长(>10 kb)和环状一致性序列(CCS)校正功能[12],可在物种水平实现微生物群落的精确解析,已在意大利黑麦草[13]、天然牧草及柱花草[14]等青贮体系成功应用。然而,该技术在柠条青贮微生物群落研究中仍属空白,限制了对其发酵机制的深度认知。
本研究从柠条原料及青贮中分离出3株快速产酸并具有强生长能力的菌株[戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus, P. pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici, P. acidilactici)和短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis, L. brevis)]作为添加剂,旨在探讨植物本身附着的LAB对柠条青贮营养品质、发酵品质和微生物群落多样性的影响,对比不同LAB的应用效果,为柠条资源的饲料化转化及高效利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 青贮试验材料

本试验在内蒙古自治区赤峰市巴林左旗隆昌镇进行。该地区属中温带半干旱大陆性季风气候,年平均气温5.3 ℃,年降水量约400 mm,无霜期110~130 d。青贮原料于2024年6月12日取样,为平茬后第3年处于开花期的柠条(柠条锦鸡儿),植株高度在120~150 cm。取样时使用柠条平茬机实施平茬作业,留茬高度控制在10~15 cm。平茬后,立即采用锦鸡儿揉丝机(吉林省吉源锦鸡儿机械设备有限公司,型号:FS800-3)对整株进行揉丝处理,揉丝细度低于2~5 mm。

1.2 菌株的分离、筛选及鉴定

以柠条原料及柠条自然青贮样品为菌源,在无菌条件下称取样品5 g,加入45 mL灭菌生理盐水,梯度稀释后将菌液涂布于MRS培养基上,置于37 ℃倒置培养48 h,挑取白色和乳白色、圆形、边缘整齐、中间稍凸、湿润光滑、不透明的菌落进行革兰氏镜检和过氧化氢酶活性试验,凡是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的菌可初步定为LAB,随后进行葡萄糖产气试验,并用MRS肉汤对菌株进行耐酸性测试。将初步筛选的菌株接种于MRS液体培养基,于30 ℃恒温培养48 h,测定吸光度(OD)600 nm值以及pH。选择OD600 nm>2、pH<4.0的菌株进行菌株鉴定:将菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,将测序的16S rRNA序列提交至NCBI中进行同源性序列比对分析以确定菌株的类别。

1.3 青贮试验设计

本研究采用单因素试验设计,共设置4个处理,包括对照(CK)处理和3个自筛LAB添加剂处理,每个处理设3个重复。供试柠条原料的水分含量为44.35%,各处理均称取1.08 kg原料:CK处理添加0.42 kg无菌蒸馏水并搅拌均匀;其余3个添加剂处理参考包健[15]的方法制备自筛LAB菌液,结合青贮发酵成功所需最低LAB含量[≥5 log10 (CFU/g FM)][8],本研究设定LAB添加水平为5 log10 (CFU/g FM),菌液经无菌蒸馏水稀释后,采用手动喷雾器均匀喷洒于原料表面。所有处理均将青贮含水量调节至60%左右,随后分装于30 cm×40 cm无菌聚乙烯袋(每袋约500 g),经真空包装机密封后,于室温条件下贮存 60 d,开封后取样进行各项指标分析。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 菌株生长繁殖能力测定

将筛选的菌株制备成菌悬液后,按3%(v/v)接种量接入灭菌MRS液体培养基,于30 ℃恒温培养48 h。培养期间监测菌体生长状态并测定OD600 nm值[16]。其中0~24 h每3 h测定1次,48 h进行末次测定。根据OD600 nm值划分生长等级:OD600 nm<0.5,不生长;0.5≤OD600 nm<1.0,弱生长;1.0≤OD600 nm≤1.5,正常生长;OD600 nm>1.5,生长良好[17]。最终以培养时间为横坐标、OD600 nm值为纵坐标绘制LAB生长曲线。

1.4.2 菌株产酸能力测定

将筛选的菌株制备成菌悬液后,按3%(v/v)接种量接入灭菌MRS液体培养基,于30 ℃恒温培养48 h。培养期间测定pH。其中0~24 h每3 h测定1次,48 h进行末次测定。记录并绘制产酸速率曲线[18]。

1.4.3 营养成分含量及LAB数量测定

取10 g柠条原料样品,加入90 mL蒸馏水,使用均质拍打仪(上海力辰邦西仪器科技有限公司,型号:LC-PJ-400)匀速拍打2 min,过滤得到菌液。采用MRS培养基培养LAB,使用平板计数法对LAB数量进行计数[19]。柠条原料及青贮样品经105 ℃烘箱杀青15 min后,转入65 ℃烘箱烘干72 h至恒重,粉碎备用。采用105 ℃烘干法测定干物质(DM)的含量[20];采用GB/T 6432—2018中的方法测定粗蛋白质(CP)的含量;中性洗涤纤维(NDF)与酸性洗涤纤维(ADF)含量使用Ankom 2000型纤维分析仪测定[21];可溶性碳水化合物(WSC)含量采用蒽酮-硫酸比色法[22]测定。按Ferreira等[23]的方法测定体外干物质消化率(IVDMD)。

1.4.4 发酵品质测定

取5 g解封青贮样品,按1∶9(w/v)比例加入45 mL蒸馏水,经均质拍打仪(上海力辰邦西仪器科技有限公司,型号:LC-PJ-400)匀速处理2 min后过滤获得浸提液,均质拍打仪速度设置为6次/s。使用酸度计测定pH(PB-30,Sartorius Basic pH计,德国);将浸提液在离心机中以16 100×g离心15 min,取上清液,用0.22 μm滤膜过滤,利用Agilent 1100型高效液相色谱仪(Agilent Technologies,美国)测定乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)及丁酸(BA)含量;氨态氮(NH3-N)含量通过苯酚-次氯酸比色法[24]测定。

1.4.5 微生物群落多样性测定

将各处理的柠条青贮样品混匀后,采用E.Z.N.A.® Soil DNA Kit DNA抽提试剂盒(Omega Bio-Tek,美国)提取总DNA,对全长16S rRNA进行PCR扩增,引物为27F(5'-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3')和1492R (5'-RGYTACCTTGTTACGACTT-3')。采用PCR仪(T100 Thermal Cycler PCR仪,Bio-Rad,美国)进行扩增反应,扩增程序如下:95 ℃预变性3 min,27个循环(95 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s),然后72 ℃稳定延伸10 min,最后在4 ℃进行保存。扩增产物经PacBio Sequel平台测序。使用Flash(版本1.2.11)对原始数据进行双端序列拼接,使用Uparse算法以97%的阈值一致性对操作分类单元(OTU)进行聚类,继而在QIIME2环境中应用DADA2方法对质控数据进行降噪处理获得最优序列,最终完成微生物群落多样性分析。基于QIIME2软件平台开展微生物群落α与β多样性分析,并生成主成分分析(PCA)散点图。选取相对丰度>1%的微生物进行物种水平解析,同时利用16S rRNA数据通过PICRUSt工具预测代谢基因功能[25],最终借助《京都基因与基因组百科全书》(KEGG)完成代谢途径注释。

1.5 数据统计与分析

原始数据经Excel 2021预处理后,采用SAS 9.4软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),应用Duncan氏法进行多重比较。结果数据以平均值±标准差表示,统计显著性判定阈值为P<0.05。系统发育进化树采用MEGA(10.2.4)软件分析绘制。

2 结果与分析

2.1 自筛LAB的鉴定及生理生化分析

根据LAB的筛选条件,共筛选了3株OD600 nm>2、pH<4.0的菌株。菌株L1、L2和L3在MRS固态培养基中的菌落形态照片如图1所示。16S rRNA测序结果经BLAST分析,菌株L1与L. brevis高度相似,菌株L2与P. acidilactici高度相似,菌株L3与P. pentosaceus高度相似(图2)。菌株L1、L2和L3的核苷酸序列已在GenBank中注册,登录号分别为PX232666、PX232667和PX232668。
图1 自筛LAB的菌落形态

图片从左到右依次为菌株L1、L2和L3。

Fig.1 Colony morphology of self-screened LAB

The images from left to right are strains L1, L2, and L3.

图2 自筛LAB系统发育树

Uncultured Bacillus sp.:未培养芽孢杆菌属;Levilactobacillus brevis:短促生乳杆菌;Pediococcus acidilactici:乳酸片球菌;Pediococcus pentosaceus:戊糖片球菌。

Fig.2 Phylogenetic tree of self-screening LAB

表1展示了在本研究中分离的3株细菌的形态和生理特性。3株菌均呈革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性。菌株L1为杆状,是葡萄糖产气阳性菌株,而菌株L2和L3是葡萄糖产气阴性菌株,表明菌株L1是异型发酵菌,而菌株L2和L3是同型发酵菌。此外,在MRS液体培养基中,3株菌均能在pH为3.5~7.0的厌氧条件下正常生长,其中菌株L2在pH为3.0时生长较弱。
表1 自筛LAB的生理生化特性

Table 1 Physiological and biochemical properties of self-screening LAB

项目
Items		 菌株Strain
L1 L2 L3
形状Shape 杆状 球状 球状
革兰氏染色Gram staining + + +
葡萄糖产气Gas production from glucose + - -
过氧化氢酶活性Catalase activity - - -
发酵类型Fermentation type 异型 同型 同型





pH		 3.0 - w -
3.5 ++ ++ ++
4.0 ++ ++ ++
4.5 ++ ++ ++
6.0 ++ ++ ++
7.0 ++ ++ ++

+:阳性 positive;-:阴性 negative;w:弱生长 weak growth;++:生长良好 good growth。

图3展示了3株乳酸菌的生长速率动态。菌株P. pentosaceus在接种后的0~3 h处于生长延迟阶段,其MRS液体培养基的OD600 nm值变化微弱;随后进入对数生长期(3~12 h),并在12 h后OD600 nm值趋于稳定。相较之下,菌株P. acidilactici和L. brevis的生长延迟期较长,为0~6 h,于6~15 h进入对数生长期,并在15~24 h经历稳定生长期,最终在24 h后OD600 nm值基本稳定。值得注意的是,3株菌株在培养15 h后的OD600 nm值均超过2.0。
图3 LAB生长速率曲线

L. brevis:短促生乳杆菌 Levilactobacillus brevis;P. acidilactici:乳酸片球菌 Pediococcus acidilactici;P. pentosaceus:戊糖片球菌 Pediococcus pentosaceus。图4同 the same as Fig.4。

Fig.3 Growth rate curve of LAB

如图4所示,3株LAB均表现出显著的产酸能力。培养初期(0~12 h),菌株代谢活跃,导致MRS液体培养基的pH从初始的5.50迅速降至4.00;在随后的12~24 h,代谢活动逐渐减弱,pH下降趋势减缓;培养24 h后,pH趋于平稳,最终稳定在4.0以下。
图4 LAB产酸速率曲线

Fig.4 Produce acid rate curve of LAB

2.2 柠条原料的营养成分

表2呈现了柠条原料的营养组成及其表面附着的LAB数量。柠条DM占鲜重的比例为55.65%。基于DM基础,柠条中CP、NDF、ADF和WSC的含量分别为12.27%、71.35%、57.16%和4.16%。此外,原料表面附着的LAB数量为4.27 log10 (CFU/g FM)。
表2 柠条原料的营养成分和LAB数量

Table 2 Nutritional composition and LAB count of Caragana korshinskii raw material

项目
Item		 干物质
DM/% FM		 粗蛋白质
CP/% DM		 中性洗
涤纤维
NDF/% DM		 酸性洗
涤纤维
ADF/% DM		 可溶性碳
水化合物
WSC/% DM		 乳酸菌数量
LAB count/
[log10 (CFU/g)]
含量/数量
Content/count		 55.65±0.63 12.27±0.45 71.35±3.16 57.16±4.23 4.16±0.52 4.27±0.49

2.3 LAB添加剂对柠条青贮营养成分的影响

如表3所示,与CK处理相比,P. acidilactici处理能有效保留柠条中的CP含量(P<0.05),显著降低NDF含量(P<0.05)(降幅4.6%),同时显著提高IVDMD(P<0.05)(增幅13.05%);P. pentosaceus处理的WSC含量显著高于CK处理(P<0.05),但CP含量显著降低(P<0.05);L. brevis处理的各项营养成分指标与CK处理相比均无显著差异(P>0.05)。此外,自筛LAB添加剂对柠条青贮的DM和ADF含量均无显著影响(P>0.05)。
表3 LAB添加剂对柠条青贮营养成分的影响

Table 3 Effects of ALB additives on nutrient composition of Caragana korshinskii silage

项目
Items		 处理Treatments P值
P-value
CK L. brevis P. acidilactici P. pentosaceus
干物质DM/% FM 38.32±0.26 38.43±0.18 38.33±0.21 38.09±0.16 0.916
干物质体外消化率IVDMD/% 19.62±1.12b 18.98±1.26b 22.18±1.05a 19.75±0.97b 0.018
粗蛋白质CP/% DM 10.90±0.09b 10.69±0.07b 11.70±0.04a 10.17±0.09c <0.001
中性洗涤纤维NDF/% DM 67.61±2.38a 66.20±1.56ab 64.46±1.32b 67.54±3.16a 0.010
酸性洗涤纤维ADF/% DM 56.58±1.23 55.50±2.09 56.65±1.68 57.09±3.64 0.292
可溶性碳水化合物WSC/% DM 0.55±0.02b 0.56±0.04b 0.66±0.06a 0.68±0.10a 0.002

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with different lowercase letter superscripts indicated significant difference (P<0.05). The same as below.

2.4 LAB添加剂对柠条青贮发酵品质的影响

表4展示了自筛LAB添加剂对柠条青贮发酵品质的影响。P. pentosaceus处理的pH显著高于L. brevis处理和P. acidilactici处理(P<0.05),L. brevis和P. acidilactici处理的pH与CK处理相比无显著差异(P>0.05),P. acidilactici处理的pH最低。P. acidilactici处理的LA含量显著高于其他3组(P<0.05),CK处理和L. brevis处理的LA含量无显著差异(P>0.05),但显著高于P. pentosaceus处理(P<0.05)。CK处理的AA含量显著高于其他3组(P<0.05)。各处理均未检测出BA的产生。在青贮60 d后,只有P. pentosaceus处理检测到了较低的NH3-N含量。结合柠条的营养成分和发酵品质,P. acidilactici处理的青贮效果最好。
表4 乳酸菌添加剂对柠条青贮发酵品质的影响

Table 4 Effects of LAB additives on fermentation quality of Caragana korshinskii silage

项目
Items		 处理Treatments P值
P-value
CK L. brevis P. acidilactici P. pentosaceus
pH 3.86±0.07ab 3.81±0.06b 3.75±0.04b 3.97±0.08a 0.016
乳酸LA/(g/kg DM) 16.38±0.42b 17.13±0.84b 23.37±1.37a 13.12±0.26c <0.001
乙酸AA/(g/kg DM) 3.83±0.24a 2.50±0.11c 3.25±0.19b 1.55±0.20d <0.001
丙酸PA/(g/kg DM) 3.25±0.31a 2.28±0.29b 2.53±0.30b 2.27±0.24b 0.016
丁酸BA/(g/kg DM) ND ND ND ND
氨态氮NH3-N/(g/kg DM) ND ND ND 0.30±0.25 <0.001

ND表示未检测到。

ND mean not detected.

2.5 LAB添加剂对柠条青贮微生物群落多样性的影响

如图5所示,本试验对柠条青贮的全长16S rRNA基因进行了SMRT测序,并对微生物群落进行了α多样性分析。P. acidilactici和L. brevis处理中青贮的Shannon指数显著低于CK处理(P<0.05),其中L. brevis处理具有最低的Shannon指数(图5-A);P. pentosaceus处理的Shannon指数与CK处理无显著差异(P>0.05)。柠条青贮微生物群落β多样性PCA如图5-B所示,第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)的贡献率分别为48.6%和35.1%%,L. brevis和P. acidilactici处理未见明显分离,CK和P. pentosaceus处理明显分离于其他各处理。
图5 柠条青贮的微生物群落α和β多样性分析

A:柠条青贮微生物群落的α多样性;B:柠条青贮微生物群落的β多样性。CK:空白对照;L. brevis:添加短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis)处理;P. acidilactici:添加乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)处理;P. pentosaceus:添加戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)处理. 不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

Fig.5 Analysis of microflora α and β diversity of Caragana korshinskii silage

A: α diversity of Caragana korshinskii silage microflora; B: β diversity of Caragana korshinskii silage microflora. CK: blank control; L. brevis: treatment supplemented with Levilactobacillus brevis; P. acidilactici: treatment supplemented with Pediococcus acidilactici; P. pentosaceus: treatment supplemented with Pediococcus pentosaceus. Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05). The same as below.

2.6 LAB添加剂对柠条青贮微生物群落结构的影响

柠条青贮中微生物种水平上的分布如图6所示。青贮后各处理的优势菌均为LAB,且LAB相对丰度均达到95%以上。其中CK处理和P. pentosaceus处理中的LAB组成较为多元化,CK处理的LAB优势种为面包黏液乳杆菌(Limosilactobacillus_panis)和泡菜促生乳杆菌(Levilactobacillus_senmaizukei);P. pentosaceus处理中LAB的优势种为香肠伴生乳杆菌(Companilactobacillus_farciminis)和未分类的次乳杆菌属(unclassified_g_Secundilactobacillus);L. brevis处理和P. acidilactici处理的LAB组成较为相似,优势菌均为面包黏液乳杆菌和类高加索酸奶迟缓乳杆菌(Lentilactobacillus_parakefiri)。
图6 不同处理条件下柠条青贮中的微生物群落

Fig. 6 Microflora of Caragana korshinskii silage under different treatment conditions

2.7 柠条青贮附着微生物群落功能分析

基于各处理的16S rRNA数据,PICRUSt用于预测代谢的基因。KEGG也被用于将基因分配到代谢途径(图7)。在本试验重点分析了代谢途径(1级通路水平),微生物群落功能主要富集在碳水化合物代谢和氨基酸代谢通路中(2级通路水平),尽管各处理的微生物均以LAB为优势菌,但不同种类的LAB在不同通路中呈现了不同的丰度,尤其是在糖酵解/糖原异生、丙酮酸代谢、磷酸戊糖途径、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及赖氨酸生物合成通路(3级通路水平)。
图7 不同处理条件下柠条青贮中附着LAB的PICRUSt2功能预测分析

Fig. 7 Predictive analysis of PICRUSt2 function of attached LAB of Caragana korshinskii silage under different treatment conditions

3 讨论

3.1 柠条原料特性

青贮饲料的营养价值主要由牧草原料的营养品质决定。其中,DM含量是影响青贮品质的关键因素之一[26]。研究表明,当青贮原料的DM含量超过30%时,能有效抑制梭菌等有害细菌的发酵[27]。本研究在制作青贮饲料时,添加无菌蒸馏水后青贮原料的DM含量控制在40%,符合青贮要求。NDF和ADF含量是评价青贮饲料纤维品质的核心指标[28]。NDF含量过高会降低家畜DM采食量,而ADF含量过高则降低DM消化率[29]。柠条原料的NDF和ADF含量均处于较高水平,这与其多年生枝条木质化进程有关。WSC是LAB发酵的主要底物,其含量通常与青贮成功率呈正相关,一般认为原料中WSC的含量超过5% DM,可以确保青贮发酵的成功[30]。本研究中,柠条原料的WSC含量为4.16% DM,可能不利于发酵,因此有必要添加外源制剂以保证青贮成功发酵。此外,原料附生LAB对启动并维持青贮发酵至关重要,其初始数量超过5 log10 (CFU/g FM)是确保发酵成功的关键。本研究中检测到的原料表面LAB数量为4.27 log10 (CFU/g FM),不足以有效启动发酵进程,因此需要添加LAB制剂辅助发酵。

3.2 3种LAB的产酸和生长速率特性

LAB作为青贮添加剂的潜力评估中,其生长速率和产酸速率是关键指标[15]。通常,pH下降速度越快,表明LAB产酸能力越强。本研究中,3株菌(P. pentosaceus、P. acidilactici、L. brevis)在48 h内均使培养液pH降至4.0以下,证实其具备较强的产酸能力。3株菌均在培养3~12 h呈现高代谢活性,12~24 h代谢活性减弱,24 h后趋于停滞。具体而言,菌株P. pentosaceus在6 h前的代谢活性高于P. acidilactici和L. brevis,但12 h后则低于后两者。生长曲线(OD值600 nm)呈现相同趋势:P. pentosaceus在12 h前的OD值600 nm高于P. acidilactici和L. brevis,之后则低于二者。OD值反映生物量积累,值越大表明增殖能力越强。尽管P. pentosaceus后期OD值600 nm相对较低,但3株菌最终OD值600 nm均大于2,均表现出良好的生长繁殖能力。

3.3 LAB添加剂对柠条青贮品质的影响

LAB可抑制青贮中有害微生物对营养物质的消耗,从而减少DM损失[31]。本研究中,4个处理的DM含量无显著差异,推测原因是各处理优势菌群均为LAB,青贮60 d后的微生物群落组成证实了此点。pH是评价青贮成功与否的核心指标,所有处理的pH均降至3.9以下,表明发酵成功完成。史金红[32]的研究指出,柠条原料因其WSC含量较低且缓冲能力较高,导致青贮难度较大。然而,本研究中所有处理的青贮pH均降至4.0以下,该结果与高龙飞[33]及林语梵[34]对柠条青贮的报道结果一致。LA与AA含量被认为是影响青贮pH的关键因素:接种P. acidilactici的处理表现出最高的LA含量,而接种P. pentosaceus的处理LA含量最低,进一步支持了乳酸积累对pH下降的主导作用。此外,揉丝预处理增大了柠条的比表面积,显著促进了细胞内容物的释放,从而为LAB增殖及LA的生成创造了更有利的条件。但过低pH可能引发饲喂家畜酸中毒,故饲喂时需注意粗饲料比例并酌情添加小苏打。CK处理的PA含量最高,可能是青贮初期LAB数量不足,其他微生物利用基质生成所致。BA主要由梭菌产生,会降低反刍动物采食量,属不良产物[35]。本试验所有处理均未检出BA,可能与较高的DM含量抑制梭菌发酵有关。豆科植物青贮期间常发生蛋白质水解,主要由蛋白水解酶引起[36]。各处理CP损失均低于6%,可能是低pH环境抑制了蛋白酶活性。本研究中发现,P. acidilactici处理的NDF含量最低,Zhang等[4]在利用P. acidilactici对柠条进行青贮时发现,P. acidilactici的添加破坏了细胞壁多糖复杂结构的酯键,释放了更多的阿魏酸,从而导致了NDF具有较高的降解率,提高了IVDMD。综合营养成分与发酵品质,在本研究中接种P. acidilactici的处理表现出最佳的青贮效果。课题组前期的研究已证实,自主筛选的植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)及其商业制剂均能有效改善柠条青贮品质[9]。本次研究中,P. acidilactici 在整体青贮表现上与植物乳杆菌相当,且在LA积累方面优于植物乳杆菌处理。该结果为进一步筛选适用于柠条青贮的LAB制剂提供了新材料,也为替代商业植物乳杆菌产品提供了潜在可行方案。

3.4 LAB添加剂对柠条青贮微生物群落结构的影响

Shannon指数反映微生物群落多样性,值越低则多样性越低。本试验中,P. pentosaceus处理的Shannon指数显著高于P. acidilactici和L. brevis处理,从青贮品质来看,菌株P. pentosaceus的相比于菌株P. acidilactici和L. brevis的青贮效果更差,甚至低于CK处理,这可能源于P. pentosaceus处理较高的微生物群落多样性导致多种LAB竞争底物,降低发酵效率。Bai等[37]研究指出,优势菌丰度高时微生物群落多样性降低,发酵质量更优。
添加的柠条土著菌株(P. pentosaceus、P. acidilactici、L. brevis)在青贮60 d后均未被检出。Shan等[38]的研究发现,从发酵玉米粉中分离的面包黏液乳杆菌所产生的细菌素Lactocin C-M2在培养基中可有效抑制P. pentosaceus、植物乳杆菌、短乳杆菌和发酵黏液乳杆菌的生长和增殖。本试验所有处理在青贮末期均检测到不同丰度的面包黏液乳杆菌,推测其产生的细菌素拮抗了添加菌株的增殖。尽管后期未检出添加菌,但各处理青贮品质存在显著差异,Bao等[11]认为自筛LAB添加剂在青贮前期起关键作用,因此需进一步研究前期微生物群落以解析菌剂作用机理。而各处理优势菌(如泡菜促生乳杆菌、香肠伴生乳杆菌、类高加索酸奶迟缓乳杆菌)可能不受该细菌素抑制。
微生物群落差异导致代谢功能变化。青贮中LAB主要通过糖酵解将WSC转化为丙酮酸,进而还原为乳酸实现酸化;磷酸戊糖途径分流碳流,生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和前体物质,协同保障发酵效率[39]。三级代谢通路分析显示,P. acidilactici处理的丙酮酸代谢和磷酸戊糖途径代谢显著高于其余3组,解释了其最优的青贮效果。此外,在以玉米秸秆为主的肉牛饲粮中添加柠条可补充赖氨酸(必需氨基酸),而P. acidilactici处理的赖氨酸生物合成途径富集程度更高,进一步突显菌株P. acidilactici作为柠条青贮添加剂的优势。

4 结论

本研究结果表明,在柠条青贮中添加P. acidilactici可显著提升青贮品质。主要体现为:降低微生物群落多样性、减少NDF含量、提高LA含量,并更好地保存WSC与CP。相比之下,添加P. pentosaceus或L. brevis对柠条青贮品质的改善效果不佳,甚至低于未添加任何添加剂的CK处理。

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