动物营养学报 >

2026 , Vol. 38 >Issue 2: 1504 - 1516

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.119

研究论文

高产类胡萝卜素胶红酵母菌株的诱变选育及其发酵条件优化

  • 魏浩然 , 1 ,
  • 期逍婷 1, 2 ,
  • 安静 1 ,
  • 张慧新 1 ,
  • 郑梦莉 1 ,
  • 周才华 1 ,
  • 黄艳玲 2 ,
  • 张铁鹰 , 1, *
展开
  • 1 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学全国重点实验室,北京 100193
  • 2 西南民族大学畜牧兽医学院,成都 610041
* 张铁鹰,研究员,硕士生导师,E-mail:

魏浩然(2000—),男,河北安新人,硕士研究生,从事动物营养、微生物发酵研究。E-mail:

Office editor: 武海龙

收稿日期: 2025-07-16

  网络出版日期: 2026-02-12

基金资助

畜禽营养与饲养全国重点实验(2004DA125184F2503)

收起

Mutagenesis Breeding of a High-Yield Carotenoid Rhodotorula mucilaginosa Strain and Optimization of Its Fermentation Conditions

  • WEI Haoran , 1 ,
  • QI Xiaoting 1, 2 ,
  • AN Jing 1 ,
  • ZHANG Huixin 1 ,
  • ZHENG Mengli 1 ,
  • ZHOU Caihua 1 ,
  • HUANG Yanling 2 ,
  • ZHANG Tieying , 1, *
Expand
  • 1 National Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
  • 2 College of Animal Science and Veterinary Medicine, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China
* professor, E-mail:

Received date: 2025-07-16

  Online published: 2026-02-12

Fold

摘要

本研究旨在筛选出高产类胡萝卜素胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)突变菌株,并对其发酵工艺进行优化,以提升类胡萝卜素的合成能力。选用紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)复合诱变的方法,对实验室保存的胶红酵母菌株进行诱变育种,并通过二苯胺(DPA)平板初筛及液体发酵复筛,获得高产类胡萝卜素突变菌株。采用单因素试验和响应面试验优化突变菌株发酵条件,包括葡萄糖浓度、有机氮源比例(蛋白胨∶酵母粉)、碳氮比、氯化钠浓度、接种量、发酵时间等工艺参数。结果表明:经过紫外线和硫酸二乙酯复合诱变,筛选出高产类胡萝卜素突变菌株CS-15,其类胡萝卜素产量为5.38 mg/L,是原始菌株的5.17倍。经过7次传代验证,突变菌株CS-15的遗传性状稳定。在优化后的发酵条件下(葡萄糖浓度58.97 g/L,有机氮源比例2∶1,碳氮比22.73,氯化钠浓度24.68 g/L,接种量5%,发酵时间96 h),突变菌株CS-15的类胡萝卜素产量达到24.09 mg/L,较原始发酵条件提高了4.8倍,较原始菌株提高了23.2倍。由此可见,突变菌株CS-15具有较好的工业化应用前景,为利用胶红酵母发酵生产类胡萝卜素提供一定的理论基础。

关键词： 类胡萝卜素; 胶红酵母; 诱变; 发酵条件优化

本文引用格式

魏浩然 , 期逍婷 , 安静 , 张慧新 , 郑梦莉 , 周才华 , 黄艳玲 , 张铁鹰 . 高产类胡萝卜素胶红酵母菌株的诱变选育及其发酵条件优化[J]. 动物营养学报, 2026 , 38(2) : 1504 -1516 . DOI: 10.12418/CJAN2026.119

Abstract

This study aimed to screen high-yield carotenoid mutant strains of Rhodotorula mucilaginosa, and optimized their fermentation process, to enhance carotenoid synthetic ability. A combined mutagenesis method using ultraviolet (UV) and diethyl sulfate (DES) was applied to the mutagenesis breeding of Rhodotorula mucilaginosa strain preserved in the laboratory, and the high-yield carotenoid mutant strains were preliminarily screened through diphenylamine (DPA) plates and secondary screened through liquid fermentation. The single-factor and response surface experiments were employed to optimize fermentation conditions for mutant strains, including glucose concentration, organic nitrogen source ratio (peptone∶yeast powder), carbon to nitrogen ratio, sodium chloride concentration, inoculation amount and fermentation time. The results showed that a high-yield carotenoid mutant strain CS-15 was screened by ultraviolet and diethyl sulfate combined mutagenesis, with a carotenoid yield of 5.38 mg/L, which was 5.17 times higher than that of the original strain. The mutant strain CS-15 exhibited stable genetic traits over seven successive generations verification. Under the optimized fermentation conditions (glucose concentration 58.97 g/L, organic nitrogen source ratio 2∶1, carbon to nitrogen ratio 22.73, sodium chloride concentration 24.68 g/L, inoculation amount 5%, fermentation time 96 h), the carotenoid yield of mutant strain CS-15 reached 24.09 mg/L, which was 4.8 times higher than that of the original fermentation conditions, and 23.2 times higher than that of the original strain. In conclusion, the mutant strain CS-15 has good prospects for industrial application, and providing a theoretical foundation for the fermentative production of carotenoid using Rhodotorula mucilaginosa.

Key words： carotenoid; Rhodotorula mucilaginosa; mutagenesis; fermentation condition optimization

类胡萝卜素是萜烯基团类化合物,呈红色或橙黄色,是重要的天然色素,在畜禽养殖领域具有重要应用价值[1]。畜禽饲粮中添加类胡萝卜素可改善产品品质,如加深蛋黄颜色、保持肉质鲜红、提升牛奶中维生素A含量[2]。同时,类胡萝卜素因卓越的抗氧化特性,被广泛应用于功能营养品、生物医药及动物饲料等领域[3]。
在类胡萝卜素工业化生产中,发酵法因其显著的成本优势与卓越的安全性,在生物制造领域备受青睐[4-5]。这一技术不仅极大地降低了生产成本,还有效规避了化学合成路线中常见的安全性与环境隐患,因此成为工业界与学术界共同关注的焦点。目前,三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)已建立相对成熟的生产体系,但仍存在发酵过程工艺复杂、周期长、成本高、菌株优良性状易衰退等缺点[6]。胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)增殖速度快,生长过程中对营养要求不高,可利用的营养素范围极广[7],培养设备与条件通用性强,已成为新的研究热点[8]。
高产类胡萝卜素胶红酵母菌株的选育体系主要围绕菌种选育与发酵工艺优化2方面展开。在菌种选育层面,基因编辑技术虽能实现定向改造,但自然选育与诱变选育因具备更高的生物安全性而成为有机食品生产的优选策略。自然选育通过筛选野生型胶红酵母的自发突变体,完全遵循生物自然进化规律,避免了外源基因污染风险;而诱变选育则采用物理手段[9]、化学试剂[10]或重离子辐射[11]等可控方式诱导基因随机突变,配合高通量筛选技术,精准获取高产突变菌株。
菌种性能的充分表达还需依托发酵工艺的优化,基础培养基中碳、氮的种类与配比直接影响菌体代谢流向,微量元素的精准调控则能激活关键酶系活性;此外,通过动态调控接种量、发酵时间和pH等参数,使其精准匹配菌体生长阶段,可减少副产物积累并显著提升产量与工艺稳定性[12],为工业化生产提供高效可靠方案。因此,本研究采用紫外线(ultraviolet,UV)和硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)诱变相结合的方式诱变胶红酵母ATCC 9449,以二苯胺(diphenylamine,DPA)为压力筛选物,筛选获得遗传稳定的高产类胡萝卜素胶红酵母菌株,并通过单因素试验结合响应面试验对发酵条件进行优化,为胶红酵母生产类胡萝卜素提供理论基础和实践指导。

1 材料与方法

1.1 试验菌种、试剂及仪器

出发菌株为胶红酵母ATCC 9449,由本实验室保存。
葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉均为生化试剂,购于北京索莱宝科技有限公司;磷酸二氢钾、七水硫酸镁、DES、DPA均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司。
主要仪器包括恒温培养箱(北京天林恒泰科技有限公司)、全温振荡培养箱(苏州培英实验设备有限公司)、台式高速离心机(湖南湘仪动力测试仪器有限公司)、VIS-7220N可见分光光度计(北京北分瑞利分析仪器集团有限责任公司)、紫外诱变箱(北京赛百奥科技有限公司)、立式压力蒸汽灭菌锅(北京同德创业科技有限公司)、PHS-3C酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)、洁净超净台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)和电子天平(上海精密仪器仪表有限公司)。

1.2 培养基配方

葡萄糖是促进红酵母属菌体生长和类胡萝卜素合成的有效碳源[7,13];复合有机氮源优于无机氮源或其他有机氮源,更利于类胡萝卜素的积累[14]。因此,本研究选定葡萄糖作为碳源,蛋白胨和酵母粉作为复合氮源,以进行后续的发酵条件优化试验。
YPD培养基:葡萄糖2.0%、蛋白胨2.0%、酵母提取物1.0%,115 ℃高压灭菌30 min。固体培养基在此基础上补加2.0%琼脂粉。
发酵培养基:葡萄糖5.0%、酵母提取物0.606%、磷酸二氢钾0.1%、七水硫酸镁0.15%,121 ℃高压灭菌30 min。
DPA固体筛选培养基:葡萄糖5.0%、酵母提取物0.606%、磷酸二氢钾0.1%、七水硫酸镁0.15%、琼脂2.0%,115 ℃高压灭菌30 min。

1.3 培养方法

1.3.1 种子培养

从已活化的胶红酵母YPD培养基上,挑取1株长势较好的单菌落,接种到含有25 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中,培养至对数生长期,吸光度(OD)值约为0.6。

1.3.2 发酵培养

培养至对数生长期的胶红酵母种子液,以10%的接种量接种到含有25 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中,在28 ℃、180 r/min的条件下,置于摇床中发酵培养96 h。

1.4 DPA浓度的确定

制备DPA固体筛选培养基,高压灭菌后冷却至50 ℃左右,再依次加入不同浓度的DPA溶液,最终DPA浓度分别为0、5、10、15、20、40、60、80、100、120 μmol/L,每个浓度做3个平行,细胞浓度稀释到10 CFU/μL再涂布于DPA固体筛选培养基上[15],置于恒温培养箱中28 ℃培养72 h,待长出菌落后,观察菌落情况,选择浓度适宜的DPA固体筛选培养基作为DPA抗性平板。

1.5 菌株诱变及高产突变菌株筛选试验

1.5.1 UV诱变

取培养至对数生长期的菌悬液10 mL于灭菌培养皿中,将培养皿置于紫外诱变箱的磁力搅拌器上,分别照射0、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180 s,诱变后的菌液经梯度稀释,取100 μL菌液涂布于DPA抗性平板上[16],在培养箱中暗培养72 h。每个处理设置3个平行。

1.5.2 DES诱变

取培养至对数生长期的菌悬液10 mL于离心管中,分别加入0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的DES磷酸盐缓冲溶液,放于摇床上振荡处理15 min,诱变处理结束后再加入2.5 mL 25%的硫代硫酸钠终止反应[17]。最后吸取1 mL诱变处理液于离心管中,在8 000×g下离心10 min后,用生理盐水洗涤稀释涂布于DPA抗性平板上,每个梯度取100 μL涂板。每个处理设置3个平行。

1.5.3 复合诱变

选择70%~80%的致死率,确定适宜的UV处理时间和DES诱变处理浓度,将2种诱变得到的突变菌株进行交叉诱变。致死率计算公式如下:
致死率(%)=[(出发菌株的菌悬液活菌数-诱变后菌株的菌悬液活菌数)/出发菌株的菌悬液活菌数]×100。

1.5.4 突变菌株筛选

吸取经诱变后的菌悬液100 μL涂布于DPA抗性平板上。在28 ℃条件下培养72 h,在DPA抗性平板上挑选出颜色深而大的单菌落,接入种子培养基中,培养至对数生长期。以10%的接种量接入含有25 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中,每个菌株做3个平行,以出发菌株作为对照,以28 ℃、180 r/min在摇床上培养96 h。挑选类胡萝卜素产量最高的1株菌株。

1.6 发酵条件单因素试验

选择葡萄糖浓度、有机氮源比例、碳氮比、氯化钠浓度、接种量、发酵时间这6个因素,研究其对胶红酵母突变菌株类胡萝卜素产量的影响。

1.6.1 葡萄糖浓度

在原始配方的发酵培养基基础上,保持其他组分不变,葡萄糖浓度分别为10、20、30、40、50、60、70 g/L。以10%的接种量接种,振荡培养96 h。每个处理3个重复。

1.6.2 有机氮源比例

在原始配方的发酵培养基的基础上,保持其他组分不变,有机氮源比例(蛋白胨∶酵母粉)分别为2∶1、1∶1、1∶0、0∶1。以10%的接种量接种,振荡培养96 h。每个处理3个重复。

1.6.3 碳氮比

确定葡萄糖浓度和有机氮源比例后,设置碳氮比分别为5∶1、10∶1、25∶1、50∶1、75∶1、100∶1。以10%的接种量接种,振荡培养96 h。每个处理3个重复。

1.6.4 氯化钠浓度

确定葡萄糖浓度、有机氮源比例和碳氮比后,设置氯化钠浓度分别为0、5、10、15、20、25 g/L。以10%的接种量接种,振荡培养96 h。每个处理3个重复。

1.6.5 接种量

确定葡萄糖浓度、有机氮源比例和碳氮比后,设置接种量分别为5%、10%、15%、20%、25%,分别接种到液体培养基中,振荡培养96 h。每个处理3个重复。

1.6.6 发酵时间

在原始配方的发酵培养基的基础上,以10%的接种量接种,初始pH 4.5,28 ℃、180 r/min分别振荡培养72、96、120 h。每个处理3个重复。

1.7 响应面试验设计

在单因素试验的基础上,选取对胶红酵母突变菌株类胡萝卜素产量影响较大的3个因素,每个因素3个水平,以不接种的培养液为对照,根据Box-Benhnken模型的中心组合试验设计原理,以类胡萝卜素产量为指标,采用响应面法优化发酵条件。

1.8 类胡萝卜素的提取及测定

生物量测定:取胶红酵母突变菌株发酵液2 mL,用去离子水洗涤、离心2次后,将沉淀物置于65 ℃烘箱内,烘干至恒重,测定其生物量。计算公式如下:
菌体干质量(g)=菌体同离心管重(g)-干燥离心管重(g);
生物量(g/L)=菌体干质量(g)/发酵液体积(L)。
类胡萝卜素含量和产量测定:酸热法[18]处理酵母细胞,取胶红酵母突变菌株发酵液2 mL,用去离子水洗涤、离心2次后,加入3 mol/L的盐酸溶液1.5 mL,在室温下浸泡60 min后将其放入沸水中3 min,再放入冰水中快速冷却8 min,8 000×g离心10 min,去掉上清液后加入2 mL丙酮,摇匀,8 000×g离心10 min,上清液即为色素提取液。以上重复2次,至菌体颜色变白。色素提取液用分光光度计在487 nm下测定吸光度值。计算公式如下:
类胡萝卜素含量(μg/g)=(A×D×V)/(0.16×m);
类胡萝卜素产量(mg/L)=生物量(g/L)×类胡萝卜素含量(μg/g)/1 000。
式中:A为类胡萝卜素在487 nm波长处的吸光度;D为待测样品的稀释倍数;V为提取所用的溶剂体积(mL);0.16为类胡萝卜素的摩尔消光系数;m为菌体质量(g)。

1.9 数据统计与分析

试验数据统计经Excel 2021初步处理,采用GraphPad Prism 8.0作图。采用SAS 9.4软件中一般线性模型程序进行单因素方差分析(one-way ANOVA),以最小显著差异法比较各组间的差异显著性,P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 适宜DPA浓度筛选

如图1所示,当DPA浓度为5~60 μmol/L时,菌落生长情况与未添加DPA时(0 μmol/L)基本一致;但当DPA浓度为40 μmol/L时菌落颜色开始变浅,当DPA浓度为60 μmol/L时菌落已变成白色,说明当DPA浓度为60 μmol/L时类胡萝卜素合成被完全抑制;当DPA浓度在80~120 μmol/L时,生长出来的菌落明显开始变小,且菌落全部变成白色,生长缓慢。综合考虑,本试验选择适宜DPA浓度为40 μmol/L。
图1 DPA抗性平板浓度筛选

Fig.1 DPA resistant plate concentration screening

2.2 菌株诱变及高产突变菌株筛选

如图2所示,UV处理时间为100 s时致死率为72%,DES诱变处理浓度为0.8%时致死率为74%,均处在最佳致死率范围(70%~80%)。因此,选择UV处理时间为100 s,DES诱变处理浓度为0.8%。
图2 UV和DES诱变致死率曲线

Fig.2 Lethality rate curves under UV and DES mutagenesis

经UV和DES复合诱变后,初筛获得300余株突变菌株,通过DPA抗性平板传代7次,最终筛选到20株表型及形态稳定的突变菌株(表1)。与出发菌株ATCC 9449相比,突变菌株CS-15的胞内类胡萝卜素含量提升4.78倍至1 537.72 μg/g,类胡萝卜素产量提升4.17倍至5.38 mg/L。
表1 胶红酵母突变菌株类胡萝卜素含量和产量

Table 1 Carotenoid content and yield of Rhodotorula mucilaginosa mutant strain

项目
Items		 生物量
Biomass/(g/L)		 类胡萝卜素含量
Carotenoid content/(μg/g)		 类胡萝卜素产量
Carotenoid yield/(mg/L)
出发菌株Original strain
ATCC 9449 3.90±0.08 265.80±13.59 1.04±0.07
突变菌株Mutant strains
D-26 3.23±0.19 794.63±80.85 2.55±0.13
D-71 4.37±0.06 256.33±20.56 1.12±0.08
D-88 3.10±0.11 929.44±98.84 2.88±0.28
D-92 2.93±0.10 1 009.00±32.78 2.96±0.19
D-103 4.65±0.12 541.28±37.29 2.51±0.11
D-132 3.58±0.13 661.11±8.70 2.37±0.09
D-174 2.80±0.07 973.81±25.42 2.73±0.03
US-4 2.68±0.13 1 070.12±80.43 2.86±0.12
US-5 4.35±0.00 321.84±3.52 1.40±0.02
US-6 2.67±0.02 399.31±12.60 1.06±0.03
C-19 2.60±0.11 1 090.53±72.04 2.84±0.25
C-33 4.38±0.10 298.60±15.16 1.31±0.10
C-38 2.85±0.11 920.37±45.46 2.62±0.05
CS-3 4.97±0.18 302.26±15.67 1.50±0.07
CS-7 3.78±0.18 531.01±22.29 2.01±0.18
CS-15 3.50±0.04 1 537.72±19.61 5.38±0.02
U-9 2.23±0.11 1 183.28±73.78 2.71±0.09
R-4 4.82±0.12 664.99±11.88 3.20±0.13
R-15 3.27±0.09 353.55±10.41 1.15±0.02
R-27 3.32±0.20 655.23±80.65 2.16±0.16
如图3所示,出发菌株ATCC 9449经UV和DES复合诱变后,获得的突变菌株CS-15在DPA抗性平板上颜色较红、菌落较大,DPA对突变菌株CS-15的抑制作用有所减弱。经过7次传代后,突变菌株CS-15在DPA抗性平板上遗传稳定,类胡萝卜素产量在5.28~5.38 mg/L,表型及形态未发生明显改变。
图3 胶红酵母突变菌株CS-15的DPA抗性平板筛选及传代

ATCC 9449为出发菌株,CS-15为突变菌株,G1、G3、G5、G7分别为第1代、第3代、第5代、第7代。

Fig.3 DPA resistant tablet screening and subculturing of Rhodotorula mucilaginosa mutant strain CS-15

ATCC 9449 was the parent strain, CS-15 was the mutant strain, and G1, G3, G5, G7 were the 1st, 3rd, 5th and 7th generations, respectively.

2.3 发酵条件单因素试验

如图4所示,随着葡萄糖浓度升高,生物量显著增加(P<0.05);随着葡萄糖浓度升高,类胡萝卜素产量先升高后降低,在葡萄糖浓度为60 g/L时达峰值,显著高于葡萄糖浓度为10~50 g/L时(P<0.05)。因此,选择适宜葡萄糖浓度为60 g/L。
图4 葡萄糖浓度对胶红酵母突变菌株CS-15产类胡萝卜素的影响

数据柱标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

Fig.4 Effects of glucose concentration on carotenoid production of Rhodotorula mucilaginosa mutant strain CS-15

Value columns with the same small letter mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

如图5所示,有机氮源比例对生物量无显著影响(P>0.05)。有机氮源比例为1∶0的类胡萝卜素产量显著低于有机氮源比例为2∶1、1∶1、0∶1时(P<0.05),有机氮源比例为2∶1、1∶1、0∶1时的类胡萝卜素产量无显著差异(P>0.05)。因此,选择适宜有机氮源比例为2∶1。
图5 有机氮源比例对胶红酵母突变菌株CS-15产类胡萝卜素的影响

Fig.5 Effects of organic nitrogen source ratio on carotenoid production of Rhodotorula mucilaginosa mutant strain CS-15

如图6所示,碳氮比为10∶1时的生物量和类胡萝卜素产量最高,显著高于其他碳氮比(P<0.05)。因此,选择适宜碳氮比为10∶1。
图6 碳氮比对胶红酵母突变菌株CS-15产类胡萝卜素的影响

Fig.6 Effects of carbon-nitrogen ratio on carotenoid production of Rhodotorula mucilaginosa mutant strain CS-15

如图7所示,随着氯化钠浓度的增加,生物量呈先下降后升高的趋势。氯化钠浓度对类胡萝卜素产量无显著影响(P>0.05),且类胡萝卜素产量在氯化钠浓度为20.0 g/L时最大。因此,选择适宜氯化钠浓度为20.0 g/L。
图7 氯化钠浓度对胶红酵母突变菌株CS-15产类胡萝卜素的影响

Fig.7 Effects of NaCl concentration on carotenoid production of Rhodotorula mucilaginosa mutant strain CS-15

如图8所示,接种量为5%时的生物量显著高于接种量为10%~25%时(P<0.05);接种量为5%~20%时的类胡萝卜素产量无显著差异(P>0.05),接种量为25%时的类胡萝卜素产量显著低于接种量为5%~20%时(P<0.05)。因此,选择适宜接种量为5%。
图8 接种量对胶红酵母突变菌株CS-15产类胡萝卜素的影响

Fig.8 Effects of inoculation amount on carotenoid production of Rhodotorula mucilaginosa mutant strain CS-15

如图9所示,随发酵时间延长,生物量显著降低(P<0.05);发酵时间为72、96 h时的类胡萝卜素产量无显著差异(P>0.05),发酵时间为96 h时的类胡萝卜素产量最高,发酵时间为120 h时的类胡萝卜素产量显著低于发酵时间为72、96 h时(P<0.05)。因此,选择适宜发酵时间为96 h。
图9 发酵时间对胶红酵母突变菌株CS-15产类胡萝卜素的影响

Fig.9 Effects of fermentation time on carotenoid production of Rhodotorula mucilaginosa mutant strain CS-15

2.4 响应面试验结果

结合单因素试验结果及预试验,选择葡萄糖浓度、碳氮比和氯化钠浓度作为响应面试验的3个主要因素。利用Box-Behnken设计了3因素3水平的响应面试验,以类胡萝卜素产量为指标来优化各因素。试验设计的因素及水平见表2,用软件Design expert 8.0进行试验设计,响应面试验设计及试验结果见表3,共需进行15次试验,零点重复3次,以便估计试验误差。
表2 试验设计的因素及水平

Table 2 Factors and levels of experimental design

项目
Items		 因素Factors
葡萄糖浓度
Glucose concentration/
(g/L)(A)		 碳氮比
Carbon-nitrogen
ratio(B)		 氯化钠浓度
NaCl concentration/(g/L)(C)
水平-1 Level-1 50 5 15
水平0 Level 0 60 10 20
水平1 Level 1 70 25 25
表3 响应面试验设计及试验结果

Table 3 Response surface experimental design and experimental results

试验号
Test number		 葡萄糖浓度
Glucose concentration/
(g/L)(A)		 碳氮比
Carbon-nitrogen
ratio(B)		 氯化钠浓度
NaCl concentration/
(g/L)(C)		 类胡萝卜素产量
Carotenoid yield/
(mg/L)
1 50 25 20 22.498 4
2 70 25 20 21.875 0
3 60 10 20 19.297 4
4 60 5 25 14.634 4
5 70 10 25 18.458 9
6 50 5 20 13.825 0
7 60 10 20 19.297 4
8 70 5 20 15.443 8
9 70 10 25 18.560 9
10 60 10 20 19.297 4
11 60 25 25 24.230 2
12 50 10 15 17.658 6
13 50 10 25 18.116 1
14 60 25 15 19.687 5
15 60 5 15 14.683 6
以类胡萝卜素产量(Y)为响应值,利用Design Expert 8.0对试验结果进行二次回归方程拟合,得到类胡萝卜素产量对各影响因素[葡萄糖浓度(A)、碳氮比(B)、氯化钠浓度(C)]的三元二次回归方程:
Y=21.90+0.15A+3.71B+0.94C-0.51AB-
0.089AC+1.24BC-0.5A2-2.99B2-0.60C2。
对该模型进行方差分析(表4),模型P<0.000 1,达到极显著水平,表明该回归模型有效。各因素的F值大小可反映其影响程度,根据F值判断,各因素对类胡萝卜素产量的影响主次顺序为:碳氮比(B)>氯化钠浓度(C)>葡萄糖浓度(A)。模型决定系数(R2)=0.996 7,表明模型能解释99.67%的响应值变化,拟合优度极高。由于中心点重复试验的纯误差为0,表明试验随机误差极小,因此模型未表现出显著的失拟问题。由模型可信度分析(表5)可知,本试验变异系数(CV)较低(1.56%),进一步表明试验重复性良好,操作可靠。
表4 回归方程方差分析

Table 4 Analysis of variance for regression equations

变异来源
Source of variation		 平方和
Sum of squares		 自由度
Degrees of freedom		 均方
Mean square		 F值
F-value		 P值
P-value
模型Model 124.68 9 124.68 167.16 <0.000 1
A 0.17 1 0.17 2.01 0.215 7
B 110.29 1 110.29 1 330.85 <0.000 1
C 6.38 1 6.38 76.99 0.000 3
AB 1.18 1 1.18 14.24 0.013 0
AC 0.032 1 0.03 0.38 0.564 0
BC 6.91 1 6.91 83.35 0.000 3
A2 0.92 1 0.92 11.07 0.020 8
B2 16.68 1 16.68 201.28 <0.000 1
C2 1.33 1 1.33 16.05 0.010 3
剩余Residual 0.41 5 0.08
失拟项Lack of fit 0.41 3 0.14
纯误差Pure error 0 2 0.00
总和Total 125.09 14
决定系数R2 0.996 7
信噪比Adeq precision 43.263

P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

P<0.05 indicated significant difference, and P<0.01 indicated extremely significant difference.

表5 模型可信度分析

Table 5 Reliability analysis of model

项目Items 数值Value 项目Items 数值Value
标准差SD 0.29 决定系数R2 0.996 7
平均值Mean 18.50 调整决定系数Adjusted R2 0.990 7
变异系数CV/% 1.56 预测决定系数Predicted R2 0.948 0
基于上述建立的三元二次回归方程,利用Design Expert 8.0软件进行数值优化,预测得到理论最佳发酵条件为:葡萄糖浓度58.97 g/L,碳氮比22.73,氯化钠浓度24.68 g/L,该条件下类胡萝卜素产量预测值为24.26 mg/L。从响应曲面图(图10至图12)中可直观看出,该最优点位于曲面的最高峰处,对应等高线图中心最密集的椭圆区域。图中曲面坡度越陡、等高线越密集,表明因素影响越显著;等高线呈现明显的椭圆形,则说明2因素之间存在较强的交互作用。
图10 葡萄糖浓度(A)和碳氮比(B)对类胡萝卜素生物合成的影响

Fig.10 Effects of glucose concentration (A) and carbon-nitrogen ratio (B) on carotenoid biosynthesis

图11 葡萄糖浓度(A)和氯化钠浓度(C)对类胡萝卜素生物合成的影响

Fig.11 Effects of glucose concentration (A) and NaCl concentration (C) on carotenoid biosynthesis

图12 碳氮比(B)和氯化钠浓度(C)对类胡萝卜素生物合成的影响

Fig.12 Effects of carbon-nitrogen ratio (B) and NaCl concentration (C) on carotenoid biosynthesis

如图13所示,经优化后的发酵条件验证试验结果表明,突变菌株CS-15在优化培养基中培养后,其类胡萝卜素产量达到24.09 mg/L。该实测值与响应面模型的理论预测值(24.26 mg/L)高度吻合,相对误差仅为0.73%,验证了模型的有效性和预测准确性。与优化前的基础培养基相比(5.02 mg/L),优化后类胡萝卜素产量提升4.8倍。
图13 优化前后突变菌株CS-15类胡萝卜素产量对比

Fig.13 Comparison of CS-15 carotenoid yield of Rhodotorula mucilaginosa mutant strain CS-15 before and after optimization

3 讨论

3.1 诱变策略优化与高产菌株筛选

DPA作为类胡萝卜素合成抑制剂,通过特异性抑制八氢番茄红素脱氢酶活性阻断代谢通路,使野生型菌株的色素合成停滞于无色的八氢番茄红素阶段,而具备抗性的高产突变菌株则因酶活性提升而呈现红色表型[19]。基于此原理,本研究建立了以40 μmol/L DPA为抗性筛选体系,较传统直接色素分析法显著提升了筛选效率,成功规避诱变后数量庞大突变菌株的繁复检测流程。
在诱变策略优化中,采用UV与DES复合处理,并以70%~80%致死率为基准,平衡诱变效率与菌株存活率。UV(100 s)通过诱导嘧啶二聚体形成干扰DNA复制[20],而DES作为烷化剂则优先修饰鸟嘌呤N7位点引发碱基错配[21],二者协同作用显著拓宽突变谱。经初筛获得20株阳性菌株,最终通过发酵复筛确定遗传稳定的高产突变菌株CS-15,其类胡萝卜素合成能力明显优于野生型。
复合诱变策略在代谢途径关键节点的改造中展现出优势,本研究结果表明,UV与DES诱变所致的DNA损伤类型互补,与基于DPA抗性的强效筛选压力相结合,能够协同驱动菌株向高产类胡萝卜素的方向进化。该方法为工业微生物的定向选育提供了有效的实践方案。

3.2 发酵培养基优化与菌株代谢

类胡萝卜素产量受菌株遗传特性和培养体系双重调控:一方面依赖于核心碳氮源充足供应,另一方面需优化无机盐的协同作用以维持胞内氧化还原稳态。此外,接种量、培养周期等参数通过影响细胞生长-产物合成的代谢平衡,直接决定终产物积累效率。本研究通过系统考察葡萄糖浓度、有机氮源比例、碳氮比、氯化钠浓度、接种量及发酵时间6个关键参数,多角度调控胶红酵母突变菌株CS-15的代谢,实现类胡萝卜素胞内积累和生物量增殖。
单因素试验结果表明,碳氮源对胶红酵母突变菌株CS-15产类胡萝卜素有较大影响,以60.0 g/L葡萄糖为适宜,既能满足碳源需求,也可避免Crabtree效应引发的有氧抑制[22];2∶1有机氮源(蛋白胨∶酵母粉)比例则提供了氨基酸、核苷酸前体及生长因子,并直接影响菌体的初级代谢与次级代谢平衡[23]。此外,24.68 g/L氯化钠的促产作用证实菌株具备渗透压调节能力。通过响应面法建立的优化模型显示,5%接种量与96 h发酵时间可实现生长与代谢的最佳平衡:适中接种量缓解营养竞争,而延长的稳定期促进类胡萝卜素积累。最终,在优化后的发酵条件下,突变菌株CS-15的类胡萝卜素产量达到24.09 mg/L。相较于优化前的基础培养基条件提高了4.8倍;相较于出发菌株ATCC 9449在原始条件下的产量(1.04 mg/L),综合提升了23.2倍。该研究为利用胶红酵母发酵生产类胡萝卜素,同时提供了性能优异的菌株资源与配套的工艺参数。

4 结论

本试验以胶红酵母ATCC 9449为出发菌株,进行UV和DES交叉复合诱变,确定DPA浓度40 μmol/L作为抗性筛选,获得1株遗传稳定、高产类胡萝卜素的胶红酵母突变菌株CS-15,其类胡萝卜素产量为5.38 mg/L,是出发菌株(1.04 mg/L)的5.17倍。随后通过单因素试验结合响应面试验确定最佳的发酵条件:葡萄糖浓度58.97 g/L,有机氮源比例(蛋白胨∶酵母粉)2∶1,氯化钠浓度24.68 g/L,碳氮比22.73,接种量5%,发酵时间96 h。

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