动物营养学报 >

2026 , Vol. 38 >Issue 2: 1559 - 1568

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.124

研究论文

一株呕吐毒素降解菌的筛选、鉴定和生物学特性研究

  • 杨冠华 , 1 ,
  • 邢娅丽 1 ,
  • 乔家运 , 1, * ,
  • 李海花 , 2, * ,
  • 李伟 3
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  • 1 天津师范大学生命科学学院,天津市动物多样性保护与利用重点实验室,天津 300387
  • 2 天津农学院动物科学与动物医学学院,天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室,天津 300384
  • 3 天津中农兴科技有限公司,天津 301705
* 乔家运,教授,硕士生导师,E-mail: ;李海花,教授,硕士生导师,E-mail:

杨冠华(2001—),女,天津人,硕士研究生,研究方向为动物性食品生产与安全。E-mail:

Office editor: 田艳明

收稿日期: 2025-07-30

  网络出版日期: 2026-02-12

基金资助

天津市科技计划项目(24JRRCRC00070)

收起

Screening, Identification and Biological Characterization of a Deoxynivalenol-Degrading Bacterial Strain

  • YANG Guanhua , 1 ,
  • XING Yali 1 ,
  • QIAO Jiayun , 1, * ,
  • LI Haihua , 2, * ,
  • LI Wei 3
Expand
  • 1 Tianjin Key Laboratory of Conservation and Utilization of Animal Diversity, College of Life Sciences, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China
  • 2 Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China
  • 3 Tianjin Zhongnongxing Technology Co., Ltd., Tianjin 301705, China
* QIAO Jiayun, professor, E-mail: ; LI Haihua, professor, E-mail:

Received date: 2025-07-30

  Online published: 2026-02-12

Fold

摘要

本试验旨在从霉变玉米和土壤中分离出一株可高效降解呕吐毒素(DON)的菌株。以氧化苯乙烯为唯一碳源进行初筛,通过富集和纯化培养分离出长势良好的目标菌株;以DON为唯一碳源进行复筛,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各菌株对DON的降解率。采用显微镜油镜观察菌株形态特征、染色特性以及在固体培养基上的生长表现,并结合16S rRNA基因测序对菌株进行鉴定;同时,进一步探究其较适生长条件、胆盐和胃肠液耐受性及其降解机制。结果表明:1)从霉变玉米中分离出一株降解DON的菌,命名为BA-20,其DON降解率为(85.92±0.01)%;经鉴定,BA-20菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。2)BA-20菌株较适生长温度和pH分别为37 ℃和7.0,同时对浓度为0.1%~0.3%的胆盐、pH=3的模拟胃液和pH=8的模拟肠液具有一定的耐受性。3)经活性物质定位和定性分析推测,BA-20菌株主要通过分泌一种蛋白酶发挥对DON的降解作用。综上所述,本试验从霉变玉米中分离到一株高效降解DON的解淀粉芽孢杆菌BA-20,为DON污染的生物防治提供了候选菌株,有助于保障饲料与食品安全。

关键词： 呕吐毒素; 生物降解; 芽孢杆菌

本文引用格式

杨冠华 , 邢娅丽 , 乔家运 , 李海花 , 李伟 . 一株呕吐毒素降解菌的筛选、鉴定和生物学特性研究[J]. 动物营养学报, 2026 , 38(2) : 1559 -1568 . DOI: 10.12418/CJAN2026.124

Abstract

This experiment was conducted to isolate a strain that can efficiently degrade deoxynivalenol (DON) from moldy corn and soil. The initial screening was conducted using styrene oxide as the sole carbon source, and the target strains with good growth were isolated through enrichment and purification culture. The re-screening was carried out using DON as the sole carbon source, and the degradation rate of DON by each strain was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The morphological characteristics, staining properties and growth performance on solid medium were observed by using an oil immersion microscope, and the strains were identified by combining 16S rRNA gene sequencing. Furthermore, its more suitable growth conditions, bile salt and gastrointestinal fluid tolerance, as well as degradation mechanism were explored. The results showed as follows: 1) a strain of DON degrading bacteria was isolated from moldy corn and named BA-20, with DON degradation rate of (85.92±0.01)%. It was identified that BA-20 strain was Bacillus amyloliquefaciens. 2) The optimal growth temperature and pH of the isolated strain BA-20 were 37 ℃ and 7.0, respectively. Meanwhile, it had certain tolerance to bile salts with concentrations of 0.1% to 0.3%, simulated gastric fluid with pH=3, and simulated intestinal fluid with pH=8. 3) Based on the localization and qualitative analysis of active substances, it was speculated that the BA-20 strain mainly exerted the degradation effect on DON by secreting a protease. In conclusion, this study successfully isolates an efficient DON-degrading Bacillus amyloliquefaciens BA-20 from moldy corn, providing a candidate strain for the biological control of DON contamination and ensuring the safety of feed and food.

Key words： deoxynivalenol; biodegradation; Bacillus

霉菌毒素是在谷物生长、收割和储存过程中由曲霉属、镰刀属和青霉属等真菌产生的有毒次级代谢产物,主要包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和伏马菌素等[1]。调查显示,全球近80%的粮食作物都遭到了霉菌毒素的污染,这一情况对食品与饲料安全构成了威胁,致使人类和动物面临极大的健康风险[2]。呕吐毒素又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),是农业上重要的5种霉菌毒素之一,可耐高温与强酸,在自然环境中稳定存在。作为一种常见的B型单端孢霉烯族毒素,DON的毒性主要取决于C12、C13位置上的环氧基团以及C3、C7和C15位置上的羟基[3]。在入侵细胞后,其毒性基团能够精准地与真核细胞60S核糖体亚基相互连接,从而诱导细胞内发生核糖毒性应激反应,导致核糖体活性下降,进而激活一系列细胞内信号通路,参与机体细胞增殖、炎症反应以及免疫调节等诸多生理过程[4]。畜禽在食用受DON污染的饲粮后会出现呕吐和腹泻等症状,同时伴有采食量减少、肠上皮完整性降低以及肠道炎症[5-6],严重影响畜牧业健康发展。
为确保饲料与食品安全,近年来关于DON脱毒方法的研究不断推进,主要包括物理降解、化学降解和生物降解。与前两者相比,生物降解能够在温和的环境条件下,借助微生物或生物酶作用于DON的毒性基团,通过氧化、羟化或水解反应改变其分子结构,从而将其转变为毒性较低的次生代谢物[7],具备绿色环保且安全可靠等诸多优势,既可避免物理降解造成的农作物营养成分损耗,又不会引发化学降解造成的二次污染,因此在霉菌毒素降解研究中使用极为广泛。在农产品与饲料储存过程中,芽孢杆菌可有效降解赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素等多种霉菌毒素的毒性[8-10],极大程度降低对农副产品的危害。然而,在前人研究[11-13]中,芽孢杆菌对DON虽具备一定的降解能力,却难以高效发挥作用,降解效率与实际需求仍存在较大差距,需进一步探索解决方案,其中高效降解DON菌株的分离筛选是一项关键技术。基于芽孢杆菌具有良好的抗逆性,因此,本试验以霉变玉米与其根部土壤为原料,旨在筛选出一株对DON具有较强降解作用的芽孢杆菌菌株,并深入探究其生理特性、对胆盐和模拟胃肠液的耐受性以及活性物质的定位与定性,为DON的生物防治提供候选菌株,同时也为后续进一步研究其降解DON的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

霉变玉米和土壤采集自天津市蓟州区玉米农田。

1.2 主要试剂

氧化苯乙烯,购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DON标准品(纯度98%),购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DON试剂盒,购自江苏晶美生物科技有限公司。

1.3 培养基

LB培养基、初筛培养基和复筛培养基参考马欣怡等[11]的方法配制,模拟胃肠液参考邵春山等[14]的方法配制。具体配方如下:1)LB培养基。胰蛋白胨10.00 g,NaCl 10.00 g,酵母提取物5.00 g,加入蒸馏水定容至1 000 mL,pH 6.0~7.0,0.102 MPa,121 ℃灭菌20 min,固体培养基需加入2%琼脂。2)初筛培养基。(NH4)2SO4 1.00 g,KH2PO4 3.00 g,K2HPO4 6.00 g,NaCl 0.50 g,MgSO4·7H2O 0.50 g,CaCl2 0.05 g,FeSO4·7H2O 0.001 g,蛋白胨0.05 g,琼脂20.00 g,加入蒸馏水定容至1 000 mL,pH 6.0~7.0,灭菌后加入过滤除菌的氧化苯乙烯,终浓度为15 mmol/L。3)复筛培养基。LB液体培养基经高压灭菌冷却后加入过滤除菌的DON纯品,使其终浓度为2 mg/L。4)模拟胃液:NaCl 2.00 g,胃蛋白酶3.50 g,蛋白胨1.20 g,酵母膏3.10 g,加入蒸馏水定容至1 000 mL,1 mol/L HCl调pH为3.0,用0.22 μm滤菌膜除菌。5)模拟肠液。NaHCO3 11.00 g,NaCl 2.00 g,胰蛋白酶1.00 g,牛胆盐1.20 g,加入蒸馏水定容至1 000 mL,NaOH调pH为8.0,用0.22 μm滤菌膜除菌。

1.4 试验方法

1.4.1 菌株筛选

将10 g霉变玉米样品和土壤样品分别置于90 mL无菌生理盐水中,于37 ℃、180 r/min振荡培养5 h,取菌液样品1 mL加入至50 mL LB液体培养基中,于37 ℃、180 r/min培养24 h;将富集培养后的菌液进行梯度稀释,并于初筛固体培养基上划线,37 ℃培养3 d。观察培养基上菌落的形态及生长情况,使用接种环挑取长势良好的单菌落进行纯化培养。取纯化的菌液按5%的接种量接种至含2 mg/L DON的复筛培养基中,于37 ℃、180 r/min培养24 h,以未接种菌液的复筛培养基为空白对照,使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测DON残留量,计算菌株对DON的降解率,每个样品3次重复。DON降解率计算公式如下:
DON降解率(%)=100×(空白对照组DON含量-试验组DON含量)/空白对照组DON含量。

1.4.2 菌株鉴定

形态学鉴定:选取降解率最高的菌株在LB固体培养基上进行划线培养,37 ℃恒温培养24 h后,观察分离菌株在LB固体培养基上的生长表现,同时挑取单菌落进行革兰氏染色,使用显微镜油镜观察细菌形态特征和染色特性。
16S rRNA基因鉴定:将分离菌株的LB液体纯培养物送至生工生物工程(上海)股份有限公司,以细菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16S rRNA基因序列扩增及测序,将测序结果在NCBI数据库中进行同源性比对,并使用MEGA 11程序构建系统发育树。

1.4.3 菌株生长特性分析

生长曲线的绘制:取纯化的BA-20菌株菌液,按5%的接种量接种于LB液体培养基中,于37 ℃、180 r/min振荡培养48 h,每隔6 h取样进行活菌计数。温度对BA-20菌株的影响:取纯化的BA-20菌液,按5%的接种量接种于LB液体培养基中,分别置于25、30、35、37、40和45 ℃培养24 h,收集菌液,进行活菌计数。pH对BA-20菌株的影响:取纯化的BA-20菌株菌液,按5%的接种量接种于pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的LB液体培养基中,37 ℃、180 r/min培养24 h,收集菌液,进行平板活菌计数。

1.4.4 菌株胆盐耐受性分析

将BA-20菌株按5%的接种量分别接种至牛胆盐质量浓度分别为0.1%、0.2%和0.3%的LB培养基中,于37 ℃、180 r/min振荡培养,分别在培养0、1、2、3和4 h时收集菌液,进行平板活菌计数。

1.4.5 菌株胃肠液耐受性分析

将BA-20菌株按5%的接种量分别接入pH=3的模拟胃液和pH=8的模拟肠液中,于37 ℃、180 r/min培养,分别在培养0、1、2、3和4 h时收集菌液,进行平板活菌计数。

1.4.6 菌株活性物质定位

为探究BA-20菌株降解DON活性物质的存在部位,将50 mL BA-20菌株菌液于4 ℃、4 548×g条件下离心15 min,获取细胞培养上清液样品;细胞沉淀以无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次,加入50 mL PBS予以重悬细胞沉淀,获得细胞悬液样品,留取10 mL作为样品;其余细胞悬液使用超声波破碎仪进行破碎,获取细胞裂解物,留取10 mL作为样品;其余细胞裂解物于4 ℃、4 548×g条件下离心15 min,获取细胞裂解物上清液,留取10 mL作为样品;将裂解物沉淀用无菌PBS清洗3次,加入30 mL PBS予以重悬,获取细胞裂解物沉淀样品。取上述样品各5 mL加入DON(浓度为2 mg/L),以含等浓度DON的细胞培养液为空白对照,于37 ℃、180 r/min培养24 h,使用ELISA试剂盒检测DON残留量,计算各样品对DON的降解率,每个样品3次重复。

1.4.7 菌株活性物质定性

由结果可知,BA-20菌株降解DON的活性物质存在于细胞培养上清液中,为探究此活性物质的化学性质,将细胞培养上清液分别进行100 ℃水浴10 min、添加1%十二烷基硫酸钠(SDS)后58 ℃水浴2 h、添加2 mg/mL蛋白酶K后58 ℃水浴2 h以及添加2 mg/mL蛋白酶K与1% SDS后58 ℃水浴2 h。取上述样品各5 mL加入DON(浓度为2 mg/L),以含等浓度DON的未处理细胞培养上清液为空白对照,于37 ℃、180 r/min培养24 h,使用ELISA试剂盒检测DON残留量,计算各样品对DON的降解率,每个样品3次重复。

1.5 数据统计分析

采用SPSS 20.0软件对试验结果数据进行处理,结果以“平均值±标准误”表示;采用GraphPad Prism 9和MEGA 7.0软件绘制图像。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

初筛使用以氧化苯乙烯为唯一碳源的固体培养基对菌液样品进行37 ℃恒温培养,3 d后观察培养基上各菌落形态,共有10株分离菌长势良好,编号分别为BA-10、BA-16、BA-17、BA-18、BA-20、BC-11、BC-13、BC-19、BC-21和BC-28。复筛将各株分离菌纯培养物(600 nm吸光度=0.6)按5%的接种量分别接种至以DON为唯一碳源的液体培养基中,培养24 h后采用ELISA试剂盒测定各菌株对DON的降解情况,结果如图1所示:在37 ℃、接种量为5%、180 r/min的条件下培养24 h后,以上10株分离菌对DON均具有一定的降解效果,降解率为(54.79±0.01)%~(85.92±0.01)%;其中,BA-20菌株对DON的降解效果最好,降解率高达(85.92±0.01)%。
图1 不同菌株的DON降解率

Fig.1 DON degradation rates of different strains

2.2 菌株的鉴定

BA-20菌株的形态学鉴定结果如图2所示。在LB固体培养基上培养24 h后,BA-20菌株菌落呈圆形、淡黄色、不透明,表面粗糙,质地较干燥;经革兰氏染色可见,菌体呈杆状,两端钝圆,呈单个或双个存在,是革兰氏阳性菌,部分菌体衰老并开始产生芽孢,且芽孢呈椭圆形,位于菌体中央或偏端,不容易着色,呈透明状。
图2 BA-20菌株形态学检查

A:BA-20菌株菌落形态;B:BA-20菌株菌体形态及革兰染色特性(1 000×)。

Fig.2 Morphological examination of BA-20 strain

A: BA-20 strain colony morphology; B: BA-20 strain bacterial morphology and Gram staining characteristics (1 000×).

对BA-20菌株进行16S rRNA基因测序,所得序列经NCBI数据库进行BLAST比对,基于比对结果,使用MEGA 7.0软件,采用邻位相连法构建系统发育树,并设置自展值为1 000次重复抽样,以评估各分支的置信度,结果如图3所示:BA-20菌株与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)位于同一分支,序列最为接近,相似度高达99.59%。综合形态学结果,确定BA-20菌株为解淀粉芽孢杆菌。
图3 基于16S rRNA基因序列的BA-20菌株系统发育树

Bacillus amyloliquefaciens:解淀粉芽孢杆菌;Bacillus velezensis:贝莱斯芽孢杆菌;Bacillus subtilis subsp. subtilis:枯草芽孢杆菌枯草亚种;Bacillus cabrialesii:卡布里亚氏芽孢杆菌;Bacillus inaquosorum:贫瘠水芽孢杆菌;Bacillus nakamurai:中村芽孢杆菌;Bacillus atrophaeus:萎缩性芽孢杆菌;Bacillus licheniformis:地衣芽孢杆菌;Bacillus aerius:空气芽孢杆菌;Bacillus pumilus:短小芽孢杆菌;Bacillus fengqiuensis:封丘芽孢杆菌;strain:菌株。

Fig.3 Phylogenetic tree of BA-20 strain based on 16S rRNA gene sequence

2.3 菌株生长特性

分别以培养时间、培养温度和培养基pH为横坐标,以活菌数为纵坐标绘制BA-20菌株的生长曲线,如图4-A所示,在0~6 h菌株生长缓慢,处于迟缓期;6~24 h处于对数生长期;24 h后进入稳定生长期,持续至36 h,此时活菌数最高;36 h后进入衰亡期。如图4-B和图4-C所示,经过24 h培养的BA-20菌株在35~40 ℃、pH=6.0~8.0间活菌数较高。由此可见,该分离菌株的较适生长条件为37 ℃、pH=7。
图4 BA-20菌株生长特性

Fig.4 Growth characteristics of BA-20 strain

2.4 菌株胆盐耐受性

如图5所示,在胆盐浓度为0.1%时,BA-20菌株培养1、2、3和4 h的活菌数分别为8.43×108、8.37×108、8.33×108和8.23×108 CFU/mL,其对应的存活率分别为(99.57±0.03)%、(98.78±0.03)%、(98.39±0.03)%和(97.21±0.03)%;在胆盐浓度为0.2%时,培养1、2、3和4 h的活菌数分别为8.00×108、7.57×108、7.27×108和6.93×108 CFU/mL,其对应的存活率分别为(94.45±0.06)%、(89.33±0.09)%、(85.79±0.03)%和(81.86±0.03)%;在胆盐浓度为0.3%时,培养1、2、3和4 h的活菌数分别为7.20×108、6.47×108、5.97×108和5.27×108 CFU/mL,其对应的存活率分别为(82.76±0.06)%、(74.33±0.03)%、(68.58±0.03)%和(60.54±0.03)%,表明BA-20菌株对胆盐具有一定的耐受能力。
图5 BA-20菌株对不同浓度胆盐的耐受性

Fig.5 Tolerance of BA-20 strain to bile salts of different concentrations

2.5 菌株胃肠液耐受性

如图6所示,在pH=3的模拟胃液中,BA-20菌株培养1、2、3和4 h的活菌数分别为6.73×108、5.63×108、5.07×108和4.33×108 CFU/mL,其对应的存活率分别为(92.66±0.09)%、(77.52±0.09)%、(69.72±0.07)%和(59.63±0.18)%;在pH=8的模拟肠液中,培养1、2、3和4 h的活菌数分别为7.90×108、7.27×108、6.70×108和5.67×108 CFU/mL,其对应的存活率分别为(93.68±0.06)%、(86.17±0.03)%、(79.45±0.12)%和(67.19±0.07)%,表明BA-20菌株对模拟胃肠液具有一定的耐受能力,能够在胃肠液中存活,且在pH=8的模拟肠液中更适合生长。
图6 BA-20菌株对胃肠液的耐受性

Fig.6 Tolerance of BA-20 strain to gastric and intestinal fluids

2.6 菌株活性物质定位

为初步探究BA-20菌株降解DON活性物质的存在部位,将细胞培养上清液、细胞悬液、细胞裂解物、细胞裂解物上清液和细胞裂解物沉淀等5组样品分别与DON孵育24 h后测定DON降解率,以含等浓度DON的细胞培养液为空白对照,结果如图7所示:与空白对照相比,5组样品中,细胞培养上清液对DON的降解效果最佳,降解率为(74.01±0.02)%;细胞裂解物和细胞裂解物上清液具有一定的降解效果,降解率分别为(35.64±0.04)%和(27.79±0.02)%;细胞悬液和细胞裂解物沉淀降解率较低,分别为(15.29±0.02)%和(6.29±0.02)%。由此表明,BA-20菌株降解DON的活性物质极有可能主要通过细胞分泌作用释放到上清液中,进而发挥降解功能。
图7 BA-20菌株不同组分对DON的降解效果

Fig.7 Degradation effects of different components of BA-20 strain on DON

2.7 菌株活性物质定性

为初步探究BA-20菌株降解DON活性物质的化学性质,将细胞培养上清液分别进行高温、SDS、蛋白酶K和SDS+蛋白酶K处理,各组分别与DON孵育24 h后测定DON降解率,同时以含等浓度DON的未处理细胞培养上清液作为空白对照,结果如图8所示:空白对照组DON降解率达(74.01±0.02)%;100 ℃高温处理组降解率低至(10.03±0.02)%;分别对细胞培养上清液进行SDS、蛋白酶K以及SDS+蛋白酶K处理后,其对DON的降解率分别下降至(32.73±0.02)%、(21.44±0.02)%和(5.76±0.02)%,大部分降解活性丧失。由此表明,BA-20菌株对DON的降解作用可能主要依靠上清液中的胞外酶发挥作用,且SDS与蛋白酶K处理使酶的结构受损,活性降低,进而导致其对DON的降解率降低。
图8 不同处理的BA-20菌株细胞培养上清液对DON的降解效果

Fig.8 Degradation effects of cell culture supernatant of BA-20 strain with different treatments on DON

3 讨论

DON作为单端孢霉烯族化合物之一,是食品和饲料中最常见的霉菌毒素污染物,可通过食物链在人类和动物体内传递,严重威胁人类和禽畜健康,并造成重大经济损失[15]。研究发现,DON被摄入机体后会影响肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达,导致肠上皮细胞通透性增加、细胞黏附力下降[16];并且高剂量DON可造成杯状细胞生成减少,导致黏液分泌不足,肠黏膜的保护屏障被削弱,易受细菌侵害,进一步加重肠道炎症和损伤[17]。Wang等[18]研究表明,DON可通过破坏仔猪海马神经细胞膜完整性进而抑制细胞活力,并借助诱导丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路蛋白磷酸化以及凋亡基因B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(BAX)的表达,呈剂量依赖性地致使仔猪海马神经细胞产生毒性效应并引发细胞凋亡。此外,Liu等[19]发现饲粮中添加DON会使断奶仔猪小肠微生物群落中厚壁菌门、放线菌门和变形菌门的丰度失调,造成肠道菌群紊乱,危害肠道健康。
DON的生物降解可以通过特异性地破坏其分子结构中的毒性基团,使其生成无毒的代谢产物,从根本上解除DON的危害[20],保障农作物与食品安全。研究发现,多种芽孢杆菌对DON具有降解作用。田祖光等[21]从养殖场土壤中分离出一株既抑制禾谷镰刀菌生长又降解DON的菌株,经鉴定确认为枯草芽孢杆菌,在28 ℃培养24 h后对1 000 μg/L DON的降解率达96.56%;经发酵麸皮试验,在接种量为109 CFU/kg、含水量为40%的条件下,压实发酵5 d后,该菌对DON的降解率为73.25%,可有效降低发酵麸皮中的DON含量。赖根生等[15]从玉米胚芽粕中分离出一株贝莱斯芽孢杆菌,该菌株发酵16 h后对DON的降解率达82.63%,将该菌与乳酸菌NJ8、RS1联合使用,对发酵饲料的DON降解率达63.52%。马欣怡等[11]从霉变玉米中筛选出一株对DON降解率达80.07%的菌株,经16S rRNA基因测序鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。鉴于已有研究[11-12,21]中多以霉变玉米和土壤为试验材料,并成功从中分离出目标菌株,因此本试验同样选用这2种材料进行筛菌工作,结果显示,从霉变玉米和土壤中成功筛选到10株目标菌株,对DON的降解率为(54.79±0.01)%~(85.92±0.01)%;其中,BA-20菌株来自于霉变玉米,对DON的降解率最高,为(85.92±0.01)%,经形态学观察及16S rRNA基因测序鉴定为解淀粉芽孢杆菌,属革兰氏阳性菌,在37 ℃、接种量为5%的条件下,对2 mg/L DON的降解率达(85.92±0.01)%,降解率与前人具有一定的差异,可能是由于菌株种属的差异或培养条件的不同引起的。
为确保BA-20菌株在饲料生产中能高效降解DON,提升饲料安全性与品质,本试验对其较适生长条件进行了探究,结果显示在培养时长24 h、温度37 ℃、pH=7.0的环境下生长状态较佳。此外,菌株要在动物体内发挥作用,必须具备良好的耐受性。胆盐作为胆汁的重要成分,在脂肪的消化和吸收中至关重要。当饲粮进入动物小肠后,会与富含胆盐的胆汁混合,若菌株缺乏胆盐耐受性,则在小肠中被胆盐破坏。胃液和肠液中含有多种消化酶,前者呈强酸性,后者呈弱碱性,菌株在随饲粮进入动物体内后,需先后经过胃液和肠液环境,若其无法耐受其环境,则在发挥降解作用前失去活性。夏超笃等[22]将解淀粉芽孢杆菌DHN04置于浓度为0.1%、0.2%和0.3%的胆盐培养基培养3 h后存活率分别为87.87%、77.32%和73.20%,且在人工胃液和人工肠液中保持3 h后存活率分别为55.55%和53.33%。本试验中,BA-20菌株在0.1%、0.2%和0.3%的胆盐浓度中培养4 h的存活率分别为(97.21±0.03)%、(81.86±0.03)%和(60.54±0.03)%,在pH=3的模拟胃液和pH=8的模拟肠液中培养4 h的存活率分别为(59.63±0.18)%和(67.19±0.07)%。本试验结果与前人的研究结果相似,表明BA-20菌株具备良好的胆盐耐受性和模拟胃肠液耐受性,可以适应机体胃肠道内的复杂环境,发挥益生作用,降解有害物质,提升饲料安全性与品质。
此外,为初步探究BA-20菌株对DON的降解机制,本试验对菌株进行活性物质定位和定性分析。分离BA-20菌株的细胞培养上清液、细胞悬液、细胞裂解物、细胞裂解物上清液和细胞裂解物沉淀,分别与DON孵育24 h,测得细胞培养上清液对DON的降解效果最佳,降解率为(74.01±0.02)%,而细胞悬液、细胞裂解物和细胞裂解物上清液对DON的降解率相对较低。马欣怡等[11]将其分离出的枯草芽孢杆菌BT-11进行相同处理,测得细胞培养上清液降解效果最佳。曹荣耀等[13]于猪肠道中分离出一株贝莱斯芽孢杆菌,测得其细胞培养上清液、细胞悬液和胞内提取物对DON的降解率分别为58.90%、5.98%和6.26%。本试验研究结果与前人一致,表明其活性物质主要位于细胞培养上清液中。马欣怡等[11]对枯草芽孢杆菌BT-11细胞培养上清液分别进行95 ℃水浴、SDS和蛋白酶K处理,结果发现对DON的降解能力显著降低。曹荣耀等[13]将细胞培养上清液进行蛋白酶K和高温加热处理后,DON降解率分别下降了14.5和11.2个百分点,表明其活性物质为胞外酶。本试验将细胞培养上清液分别进行100 ℃水浴、SDS、蛋白酶K以及SDS+蛋白酶K处理后,对DON的降解率明显降低,结果与前人一致,因此推断BA-20菌株对DON的降解作用主要依靠上清液中的酶发挥作用。
作为一种优良的农业肥料和生物防治剂,解淀粉芽孢杆菌通过分泌植物生长素、产生挥发性有机化合物以及改善土壤微生物的丰度进而提高植物的养分吸收,同时增强植物对土壤病原菌生物胁迫的抵抗力,在农业生产与动物养殖中应用广泛[23-24]。王俊峰等[25]从小麦田土壤样品中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌H7,使用超高效液相色谱法测得对DON的降解率为60.77%;并通过细胞凋亡试验发现,DON降解后毒性降低,对猪小肠上皮细胞的抑制作用减弱,诱导细胞凋亡的能力也随之降低。曹坤等[26]从土壤中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌CPLK1314,该菌株对禾谷镰刀菌具有显著的拮抗效果,能够在体外抑制禾谷镰刀菌的菌丝生长、孢子萌发,减少其在饲料中定植,降低了饲料因DON带来的安全风险。本试验筛选出的解淀粉芽孢杆菌BA-20,相较于先前研究成果对DON的降解效率更胜一筹,且具有良好的胆盐与胃肠液耐受性,未来将会继续探讨解淀粉芽孢杆菌BA-20在动物体内的解毒效果,有望在保障畜禽健康、提升养殖效益等方面发挥重要作用。

4 结论

以DON为唯一碳源,本试验从霉变玉米中分离出一株高效降解DON的解淀粉芽孢杆菌BA-20,其较适生长条件为37 ℃、pH=7,对胆盐与模拟胃肠液具有一定的耐受性;在37 ℃培养24 h后,该菌对2 mg/L DON的降解率达(85.92±0.01)%,其活性物质为一种分泌性的蛋白酶。

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