随着国家“禁抗”以及“豆粕减量替代”政策的推行,开发替代抗生素的饲料添加剂和新的蛋白质原料资源成为畜牧业发展的重要方向。一方面,目前“豆粕减量替代”技术替代效果有限,急需开发新的蛋白质原料资源;另一方面,生物活性物质是替代抗生素饲料添加剂的一个重要来源,某些生物活性物质仍存在成本高、工艺复杂等问题。微生物制造通过利用微生物或构造工程菌株来制造生物活性物质或生产新型饲料资源,在畜牧领域展现出巨大的应用潜力。
微生物生产技术早在古代就被人们所使用,例如酿造、发酵等。到了19世纪,人们发现发酵是由微生物引起的,这为微生物制造的出现奠定了基础。20世纪以后,微生物开始逐渐走向工业化生产,例如利用微生物制造丙酮、丁醇、抗生素以及胰岛素等。20世纪90年代,随着基因组学和系统生物学的兴起,在此基础上,微生物制造行业飞速发展。在21世纪初,逐步发展出一门严格的工程学科来创造、控制和编程细胞行为。由此产生的领域,被称为合成生物学[1]。在过去几十年中,微生物制造飞速发展,其在畜牧领域的潜力也逐渐展现。目前,通过微生物生产生物活性物质、氨基酸和蛋白质原料的技术不断发展,部分技术已经投入生产中使用。本文综述了微生物制造的概述及其在畜牧领域的研究进展,为微生物制造在畜牧领域进一步开发应用提供参考。
1 微生物制造概述
微生物制造是以微生物细胞为生产单位,以可再生资源为原料,可持续地制造各种天然和大宗化学品[2]。微生物制造的科学技术分别经历了代谢工程和反向代谢工程的早期发展,高通量组学、基因组水平代谢网络模型及细胞性能改造的后基因组时代,以及系统代谢工程和合成生物学推动的最新进展3个阶段[3]。在20世纪初,微生物制造专注于正丁醇、甘油、氨基酸、维生素和有机酸等初级代谢物,随后重点转移到次生代谢物青霉素、四环素和链霉素等,此后不断有工业规模的复杂生物制药出现,包括胰岛素和促红细胞生成素等[4]。20世纪90年代中期,自动化DNA测序和改进的计算工具使完整的微生物基因组测序成为可能,用于测量RNA、蛋白质、脂质和代谢物的高通量技术,能够生成大量细胞组分及其相互作用[1]。2000年以后,Gardne等[5]首次通过构建启动子开关来控制转录因子;Elowitz等[6]设计了一个振荡回路,该回路由一个由串联的阻遏物-启动子对组成的三重负反馈环组成,这2个成果意味着合成生物学的正式出现,同时也开启了人造细胞工厂的新时代。在此之后,微生物制造业飞速发展,合成生物学改变了传统微生物制造的模式,将其从“发现和利用”提升到了“设计和构建”,开始构建不同的途径,利用大肠杆菌或酿酒酵母等作为表达载体来合成目的产物,其中就包括著名的抗疟疾药物青蒿素前体的生物合成,这让各行各业注意到微生物制造的发展前景以及商业价值[7]。
微生物制造可以更方便、更快捷地生产一些难以提取或生产成本较高、速度较慢的产物。目前,常用的微生物表达系统主要包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母和丝状真菌表达系统[8]。例如,在生物制药方面,利用大肠杆菌和酿酒酵母生产抗疟疾药物青蒿素前体,为青蒿素的提取提供了新的途径[7]。还可以通过构建基因工程菌或发酵的方式,来生物合成人胰岛素等药物[9]。在能源环境方面,用于生产生物燃料。例如,Atsumi等[10]利用大肠杆菌的高活性氨基酸生物合成途径,将2-酮酸中间体转移用于合成醇,实现从葡萄糖中高产率、高特异性地生产异丁醇。使用无机氮等底物生产氨基酸,使用的主要是谷氨酸棒状杆菌以及大肠杆菌,谷氨酸棒状杆菌常被应用于工业生产氨基酸[11]。上述研究成果启发了微生物制造可以应用在畜牧生产领域,也成为了重点研究和应用的方向之一。部分生物活性物质、酶制剂以及蛋白质原料等,都已经开始使用微生物制造,这促使畜禽养殖逐步走向了更环保、更高效的新时代。
2 微生物制造在畜牧生产上的应用
近年来,由于微生物制造的高效、低成本、环保等特点,在畜牧生产领域也得到广泛的应用,如用于生产绿色替代抗生素饲料添加剂、酶制剂、氨基酸/单细胞蛋白质原料等。
2.1 微生物制造天然生物活性物质
天然生物活性物质是抗生素替代品的重要方向之一。研究发现,一些天然生物活性物质可在不同程度上替代抗生素,并具有一定的促进生长、提高免疫力等效果。但是,天然生物活性物质利用工业手段或农业手段生产,可能存在提取效率低、需要时间长和成本高等缺点。与传统提取工艺相比,微生物制造具有生产效率高、成本低等优势。
白藜芦醇是一种天然生物活性物质。有研究表明,在肉鸡饲粮中添加白藜芦醇可以提高动物的生长性能和抵抗病原微生物的能力[12]。但是,目前白藜芦醇的产量仍然主要来自于植物中提取。近些年来,不断有研究通过微生物生产白藜芦醇。Becker等[13]在酿酒酵母菌株中成功共表达杂交杨树的辅酶A连接酶编码基因(4CL216)和葡萄白藜芦醇合酶基因(vst1),并检测出白藜芦醇的产生。Li等[14]设计出酿酒酵母通过酪氨酸中间体从葡萄糖或乙醇中产生白藜芦醇的途径,证明了从葡萄糖中从头合成白藜芦醇的可能性。颜丙扬等[15]使用树干毕赤酵母工程菌株Ss17在5 L发酵罐中通过分批补料葡萄糖发酵128 h,白藜芦醇产量达到了558.40 mg/L。利用不同微生物合成白藜芦醇的研究见表1。
表1 利用不同微生物合成白藜芦醇的研究Table 1 Study on synthesis of resveratrol using different microorganisms |
| 菌株Strains | 原料Raw material | 规模Scale | 滴度Titer | 参考文献Reference |
|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母S.cerevisiae | 葡萄糖 | 生物反应器 | 531.41 mg/L | Li等[14] |
| 树干毕赤酵母S.stipitis | 葡萄糖 | 生物反应器 | 558.4 mg/L | 颜丙扬等[15] |
| 解脂亚洛酵母Y.lipolytica | 葡萄糖 | 5 L发酵罐 | 22.5 g/L | Liu等[16] |
| 树干毕赤酵母S.stipitis | 糖蜜 | 摇瓶 | 1 076 mg/L | Kobayashi等[17] |
| 大肠杆菌-酿酒酵母共培养 E.coli-S.cerevisiae co-culture | 葡萄糖 | 摇瓶 | 36 mg/L | Yuan等[18] |
| 大肠杆菌E.coli | 葡萄糖 | 摇瓶 | 304.5 mg/L | Wu等[19] |
2.2 微生物制造酶制剂
酶制剂主要是由细菌或真菌等发酵产生的,但很多野生菌株生产效率低,随着微生物制造进入新时代,通过合成生物学技术改造菌株或选择其他的表达载体可以达到增加产量的目的。
在畜禽饲粮中,谷物是其主要成分,在谷物原料中植酸磷可占总磷的50%~80%,这种形式的磷通常不能被单胃动物所利用[25]。在畜禽饲粮中添加植酸酶,可以提高饲粮中磷的利用率,避免磷的浪费。在蛋鸡饲粮中添加植酸酶,可以改善鸡蛋质量,减少不合格蛋数量和磷排放[26-27]。传统微生物制造植酸酶的方法以发酵生产为主,目前最常用菌株是黑曲霉菌、毕赤酵母以及大肠杆菌。在20世纪末,Papagianni等[28]就研究了黑曲霉菌发酵方式对植酸酶生产的影响。随着微生物制造的发展,基因工程菌用来发酵生产酶也渐渐登上了舞台。许多研究将多种菌的植酸酶基因在毕赤酵母中表达以提高产率[29]。也有通过敲除毕赤酵母的自噬和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路相关基因来提高植酸酶活性,例如ΔPAS_chr1-10353缺失型菌株植酸酶活性为440.87 U/mL,相比野生型提高了2.4倍;ΔPAS_chr3_0637缺失型菌株植酸酶活性为316.01 U/mL,相比野生型提高了2.09倍[30]。Sinzinger等[31]在蓝藻水解物和缓冲甘油复合物上使用工程毕赤酵母发酵方式生长、发酵77 h后,植酸酶最大活性产率和单位生物质活性产率均提高了40%,分别达到7 200 U/mL和113 000 U/g。
纤维素酶是由3种酶组成的复合酶:外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[32]。有研究表明,在肉鸡饲粮中添加纤维素酶可以提高肉鸡的生长性能以及降低粪便中的氮排放[33]。在高纤维饲粮中添加纤维素酶,可以有效增加猪的饲粮总能、粗蛋白质、干物质、有机质、总膳食纤维、中性洗涤纤维的表观回肠消化率和不溶性膳食纤维的表观消化率,提高猪的生长性能[34]。随着微生物制造的发展,同时也为了满足工业生产需求,常对产纤维素酶微生物进行改造以提升产量。生产中主要用里氏木霉进行生产纤维素酶,与初始菌株QP4相比,通过敲除里氏木霉的ΔVPS13基因可以使胞外蛋白产量及纤维素酶活性分别提高16.4%和21.9%[35]。王逸凡[36]通过构建新型杂合启动子在里氏木霉中使用Pcc启动子成功同时过表达了内切葡聚糖酶2(EG2)和β-葡萄糖苷酶A(BGLA),这一操作使转化株的滤纸酶活性(FPA)相比初始菌株QP4提高了178%。Zhao等[37]将里氏木霉的丙氨酸873残基突变为酪氨酸,使得以纤维素为碳源的培养基中二甲醇分解酶的产量显著增加,当葡萄糖作为唯一碳源时,使得木聚糖酶和纤维素酶的产量分别增加了56.7和3.3倍。
木聚糖属于非淀粉多糖(NPS),是一种抗营养因子,木聚糖酶是能将木聚糖分解为木寡糖的一类酶的总称。有研究表明,在小麦和玉米干酒精糟及其可溶物(DDGS)饲粮中添加木聚糖酶,可以提高育肥猪的生长性能[38]。在20世纪70年代,就有研究用黑曲霉菌生产木聚糖酶[39]。为满足市场需求,学者们对木聚糖酶菌进行分子改良。Wu等[40]通过在木聚糖酶活性位点结构的-3亚位点选择性定点诱变而增加AnXynB(一种来源于黑曲霉的糖苷水解酶)的活性和热稳定性。Min等[41]将49位的精氨酸定点突变为天冬酰胺,使得环状芽孢杆菌木聚糖酶催化效率提高了7.51倍。总之,利用微生物发酵可以高效制备多种酶制剂,同时也能减少对环境造成的污染。
2.3 微生物制造氨基酸/蛋白质原料
玉米-豆粕型饲粮是畜禽生产上的经典饲粮,随着畜牧业不断发展,我国大豆资源难以满足动物生产中需要的蛋白质原料,大豆对进口的依赖度超过80%,随着国家推行“豆粕减量替代”,豆粕资源紧张得到一定缓解。但是,蛋白质原料资源仍然处于不能自给自足的境况,利用微生物生产单细胞蛋白质为开辟新蛋白质原料资源提供了思路。此外,饲粮中蛋白质原料添加量的减少可能会使饲粮中的必需氨基酸不足。利用微生物制造可以生产多种氨基酸,添加到饲粮中以满足动物对低蛋白质饲粮中必需氨基酸的需要。生物合成蛋白质在动物生产上的应用见表2。
表2 生物合成蛋白质在动物生产上的应用Table 2 Application of biosynthetic proteins in animal production |
| 蛋白来源 Protein sources | 试验动物 Experimental animal | 试验期 Test period | 添加量 Addition | 应用效果 Application effect | 参考文献 Reference |
|---|---|---|---|---|---|
杰丁塞伯林德纳氏酵母 Cyberlindnera jadinii | 肉鸡 | 1~34日龄 | 10% | 对生长性能无显著影响 | Itani等[42] |
| 20% | 对生长性能无显著影响 | ||||
| 30% | 料重比和营养物质 表观消化率下降 | ||||
| 产朊假丝酵母 Candida utilis | 猪 | 30~58日龄 | 40% | 对生长性能无显著影响 | Cruz等[43] |
| 乙醇梭菌蛋白 Clostridium autoethanogenum protein | 肉鸡 | 1~42日龄 | 1%~5% | 平均日采食量提高,料重比 降低,以4%添加量效果最好 | Wu等[44] |
| 乙醇梭菌蛋白 Clostridium autoethanogenum protein | 猪 | 22~50日龄 | 1%~4% | 提高生长性能、营养物质表观 消化率、抗氧化能力、免疫力, 改善肠道形态 | 姚康[45] |
乙醇梭菌蛋白 Clostridium autoethanogenum protein | 日本沼虾 | 8周 | 20% | 对生长性能无显著影响 | 高国栋等[46] |
| 30% | 增重率、特定生长率下降, 料重比提高 | ||||
乙醇梭菌蛋白 Clostridium autoethanogenum protein | 草鱼 | 10周 | 5% | 提高饲料效率、增重率和 特定生长率 | 魏洪城等[47] |
| 10% | 造成肝细胞损伤,肝脏功能 受损,存活率降低 |
2.3.1 生产氨基酸
谷氨酸棒状杆菌是工业上生产氨基酸的重要菌株,随着基因工程技术发展,代谢工程编辑后谷氨酸棒状杆菌可以定向增加氨基酸的产量,例如L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸[48]、L-丝氨酸[49]等,其改造措施是过表达目的氨基酸代谢途径,削弱竞争氨基酸分支,增强目的氨基酸合成途径[50]。例如,L-赖氨酸是通过设计谷氨酸棒状杆菌的代谢网络以提高产量,通过过表达L-赖氨酸的合成关键酶相关基因、合成前体物质的基因,削弱其他分支旁路的竞争的方法,使L-赖氨酸的产量大幅提高[51-53]。L-苏氨酸也是通过增强编码L-苏氨酸合成途径中关键酶的目标基因表达以及提高前体物质的供应,以提高产量[54]。L-精氨酸采用谷氨酸棒状杆菌ARG01菌株,灭活L-精氨酸生物合成的负因子,阻断L-鸟氨酸分解代谢途径,促进L-精氨酸合成途径中关键酶的合成,再从大肠杆菌引入吡啶核苷酸转氢酶和敲除单磷酸腺苷核酸酶来优化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和ATP的细胞内供应,从而最大限度提高L-精氨酸产量[55]。
2.3.2 生产真菌蛋白
酵母是生产单细胞蛋白质最广泛的微生物[56],酵母蛋白营养价值高,能够满足动物体对多种氨基酸的需求。有研究表明,在畜禽饲粮中用灭活的酵母蛋白以10%~20%的量替代的常规饲粮中的蛋白质,对动物的采食、消化、吸收、代谢、生长和健康没有不利影响[57-58]。生产中通常用酿酒酵母来生产酵母蛋白,酿酒酵母细胞中含有丰富的蛋白质,蛋白质含量占其细胞干物质含量的45%~55%[59]。为了获得更高的质量和产量,常通过诱变或基因编辑技术进行酵母改造。Lee等[60]通过紫外诱变和基因修饰使酿酒酵母的蛋白质含量提升16%。通过常压室温等离子体(ARTP)诱变技术诱变酿酒酵母,可得到蛋白质含量高达68.4%~69.4%的酵母菌株[61]。马良等[62]通过离子辐射诱导一株饲料酵母,通过筛选得到的新菌株对比母本蛋白质含量提高了10.08%。
2.3.3 生产菌体蛋白
3 小结与展望
利用微生物制造在生产蛋白质、氨基酸、天然植物提取物以及酶制剂等方面已经得到了部分应用,在畜牧业上展现出了巨大的发展潜力。但是,目前仍处于发展的早期阶段,还面临着技术、成本和伦理等多方面的不足和挑战。酶制剂目前已经广泛应用于畜牧行业,但由于技术和成本原因,其他部分研发成果仍难以应用到工业生产中,仍需继续攻克技术难关,研发更为稳定和对培养要求更低的菌株来实现大规模量产。同时,公众对于转基因产品仍存在较大的疑虑,且产物在动物生产上的试验较少,新工艺合成出的产物仍需大量动物试验证实其安全性。对于菌体蛋白原料需要研究更适合该蛋白质的饲粮配方,扩大需求。随着微生物制造在畜牧领域的研究和应用不断深入,微生物制造将会成为畜牧业发展的巨大推动力。
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