动物营养学报 >

2026 , Vol. 38 >Issue 6: 4586 - 4600

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.368

研究论文

两阶段固态发酵处理对柠条青贮品质及体外瘤胃发酵特性的影响

  • 于向宇 , 1 ,
  • 柯文灿 2, 3 ,
  • 刘伟 1 ,
  • 张桂杰 , 1, *
展开
  • 1 宁夏大学动物科技学院, 银川 750021
  • 2 宁夏大学林业与草业学院, 银川 750021
  • 3 内蒙古自治区农牧业科学院, 呼和浩特 010000
* 张桂杰,教授,博士生导师,E-mail:

于向宇(2001—),男,河南驻马店人,硕士研究生,从事饲草青贮加工研究。E-mail:

Office editor: 靳 爽

收稿日期: 2025-11-07

  网络出版日期: 2026-06-13

基金资助

国家重点研发项目(2022YFD1300905)

国家自然科学基金区域创新发展联合基金(U24A20446)

宁夏回族自治区中央引导地方科技发展专项(2025FRF05008)

宁夏自然科学基金项目(2023AAC05018)

收起

Effects of Two-Stage Solid-State Fermentation on Silage Quality and in Vitro Rumen Fermentation Characteristics of Caragana korshinskii Kom.

  • YU Xiangyu , 1 ,
  • KE Wencan 2, 3 ,
  • LIU Wei 1 ,
  • ZHANG Guijie , 1, *
Expand
  • 1 School of Animal Science and Technology, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
  • 2 School of Forestry and Grassland Science, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
  • 3 Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Hohhot 010000, China
* professor, E-mail:

Received date: 2025-11-07

  Online published: 2026-06-13

Fold

摘要

为改善柠条发酵品质和养分利用率,本试验采用两阶段3×2析因设计,研究里氏木霉(TR)或纤维素酶有氧发酵后联合植物乳杆菌(LP)青贮对柠条青贮品质及体外瘤胃发酵特性影响。第1阶段为有氧发酵阶段(7 d),设置无添加剂(CK处理)、添加70 mL/kg鲜重(FW)TR(TR处理)及添加70 mg/kg FW纤维素酶(CE处理)3个处理;第2阶段为青贮阶段(60 d),以第1阶段产物为原料,设置接种70 mg/kg FW LP(LP处理)和未接种LP(NLP处理)2个处理。结果表明:1)有氧发酵7 d后,与CK处理相比,TR和CE处理的中性洗涤纤维(NDF)、半纤维素和单宁含量显著降低(P<0.05);TR处理的酸性洗涤纤维(ADF)和纤维素含量显著降低(P<0.05)。2)青贮60 d后,与CK处理相比,TR和CE处理可显著降低柠条青贮纤维组分(NDF、ADF、半纤维素、纤维素)含量(P<0.05),且TR+LP处理表现出较强的协同增效作用,可进一步显著降低纤维组分含量(P<0.05)。TR+LP处理柠条青贮pH和氨态氮(NH3-N)含量最低,乳酸和乙酸含量最高,发酵品质最优。3)扫描电镜结果显示,TR和CE处理均可破坏柠条青贮细胞壁结构,产生裂纹和孔洞;接种LP后对木质纤维素的降解作用进一步增强,TR+LP处理的结构破坏最为明显。4)体外瘤胃发酵结果表明,TR+LP处理对柠条青贮体外干物质消化率(IVDMD)、体外中性洗涤纤维消化率(IVNDFD)、体外酸性洗涤纤维消化率(IVADFD)及体外产气量的提升效果最好。综上所述,TR与LP联合处理可通过协同效应优化柠条青贮品质,降解木质纤维素,改善体外消化率。

关键词： 柠条青贮; 里氏木霉; 纤维素酶; 植物乳杆菌; 发酵品质; 体外消化率

本文引用格式

于向宇 , 柯文灿 , 刘伟 , 张桂杰 . 两阶段固态发酵处理对柠条青贮品质及体外瘤胃发酵特性的影响[J]. 动物营养学报, 2026 , 38(6) : 4586 -4600 . DOI: 10.12418/CJAN2026.368

Abstract

To improve the fermentation quality and nutrient utilization efficiency of Caragana korshinskii Kom., a two-stage 3×2 factorial design was conducted to investigate the effects of aerobic fermentation with Trichoderma reesei (TR) or cellulase combined with ensiling with Lactobacillus plantarum (LP) on silage quality and in vitro rumen fermentation characteristics of Caragana korshinskii Kom. The first stage was an aerobic fermentation period (7 d), with three treatments set: no additive (CK treatment), 70 mL/kg fresh weight (FW) TR (TR treatment) and 70 mg/kg FW cellulase (CE treatment). The second stage was a silage period (60 d), using the products of the first stage as raw materials, with two treatments set: inoculation with 70 mg/kg FW LP (LP treatment) and no inoculation with LP (NLP treatment). The results showed as follows: 1) after 7 d of aerobic fermentation, compared with the CK treatment, the contents of neutral detergent fiber (NDF), hemicellulose and tannin in the TR and CE treatments were significantly decreased (P<0.05); the contents of acid detergent fiber (ADF) and cellulose in the TR treatment were significantly decreased (P<0.05). 2) After 60 d of ensiling, compared with the CK treatment, TR and CE treatments could significantly reduce the contents of fiber components (NDF, ADF, hemicellulose, cellulose) in Caragana korshinskii Kom. silage (P<0.05), and the TR+LP treatment exhibited a strong synergistic effect, which could further significantly decrease the fiber component contents (P<0.05). The TR+LP treatment had the lowest pH and ammonia nitrogen (NH3-N) content, the highest lactic acid and acetic acid contents, and the optimal fermentation quality of Caragana korshinskii Kom. silage. 3) Scanning electron microscopy results showed that both TR and CE treatments could destroy the cell wall structure of Caragana korshinskii Kom. silage, resulting in cracks and holes; the degradation effect on lignocellulose was further enhanced after inoculation with LP, and the structural damage was the most obvious in the TR+LP treatment. 4) In vitro rumen fermentation results indicated that the TR+LP treatment had the best improvement effects on in vitro dry matter digestibility (IVDMD), in vitro neutral detergent fiber digestibility (IVNDFD), in vitro acid detergent fiber digestibility (IVADFD) and in vitro gas production of Caragana korshinskii Kom. silage. In conclusion, the combined treatment of TR and LP can optimize the silage quality of Caragana korshinskii Kom., degrade lignocellulose and improve in vitro digestibility through synergistic effects.

Key words： Caragana korshinskii Kom. silage; Trichoderma reesei; cellulase; Lactobacillus plantarum; fermentation quality; in vitro digestibility

柠条(Caragana korshinskii Kom.)为豆科耐旱灌木,是我国西北干旱区生态屏障建设的核心物种,其非食用木质化茎秆年产量超过400万t干物质(dry matter,DM)。尽管柠条在生态修复中发挥重要作用,但其高纤维含量和低消化率限制了其在畜牧业中的直接应用。文献数据显示,柠条粗蛋白质(crude protein,CP)含量为8.24% DM~20.20% DM,中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)占比70%~80%[1],且细胞壁中木质素-纤维素复合结构(lignin-cellulose complex,LCC)形成的物理屏障[酸性洗涤木质素(acid detergent lignin,ADL)含量15%~30%]导致瘤胃微生物对结构性碳水化合物的体外消化率普遍低于45%,严重制约其利用效率[2]。因此,开发适宜的预处理与贮存技术以提高柠条的可降解性和全年供应能力具有重要意义。
预处理技术旨在通过物理、化学或生物方法改变木质纤维素生物质(lignocellulosic biomass,LCB)的理化性质,破坏其物理结构,从而提高可降解性[3-4]。然而,常规高温爆破及酸碱水解等方法可能导致营养物质损失或产生发酵抑制性残留物,不利于后续发酵过程。生物预处理技术因环境友好、可持续和安全的特点而受到广泛关注[5],主要包括酶处理和微生物发酵2种生物改性方式。酶处理使用多种生物酶(如纤维素酶、木聚糖酶等)水解细胞壁成分,但处理过程中释放的糖易被内源微生物迅速消耗,影响全流程的经济效率[6];微生物发酵则通过调控细菌、真菌等微生物的分解作用,定向破解LCB的大分子结构[7],展现出更好的应用潜力。
在LCB降解领域,丝状真菌因具备高效的酶分泌特性成为研究热点,其商业化纤维素酶产量占全球总产量的20%以上,尤以木霉属应用最为广泛[8]。其中,里氏木霉(Trichoderma reesei,TR)是典型代表,其模式菌株RUT-C30能高效分泌具有协同作用的纤维素酶和半纤维素酶,在木质纤维素降解与饲料生物转化中表现突出[9]。研究表明,源自TR的外源纤维素酶可显著提高豆科和木本饲料的纤维降解率与瘤胃体外消化率[10],显示了其在高纤维饲料改良中的潜力。
然而,经微生物发酵处理的固态发酵饲料仍存在易腐败、季节性供应不均等问题[11]。青贮被认为是解决该问题的经济高效方法之一,尤其适用于经真菌或酶预处理后的饲料。青贮过程通过形成厌氧酸性环境抑制腐败微生物生长,同时最大限度保存饲料中的营养成分。研究表明,接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,LP)可显著改善青贮发酵品质、抑制蛋白质降解并增强微生物稳定性。例如,Du等[12]研究发现,纤维素酶与LP协同作用可加速木本原料的乳酸发酵过程,并改善发酵代谢结构;Xian等[13]报道,在决明子青贮中联合添加纤维素酶和LP能显著降低青贮pH与氨态氮(ammoniacal nitrogen,NH3-N)含量,并促进纤维降解;Bai等[14]也证实,纤维素酶与LP复合处理可改善柠条青贮的发酵稳定性,并调节青贮微生物群落结构。
目前,关于TR或其酶系与LP在柠条两阶段固态发酵(有氧预处理+厌氧青贮)过程中的联合效应研究仍较为有限。既往研究多聚焦于单一酶制剂处理或传统青贮工艺,对木质纤维素结构解聚、结构性碳水化合物转化及瘤胃发酵产能之间的耦合机制缺乏系统阐释。本研究基于纤维降解真菌或酶在结构性碳水化合物解聚中的生物催化优势,以及乳酸菌在快速产酸与营养保存方面的互补作用,构建柠条两阶段固态发酵工艺,以期形成结构破坏-底物释放-快速酸化的协同过程,从而促进LCC解聚、提高细胞壁可降解性并增强瘤胃发酵效率。本研究旨在系统评估菌酶预处理联合LP青贮对柠条营养特性、木质纤维素结构特征及体外瘤胃发酵特性的影响,揭示两阶段固态发酵中木质素降解与瘤胃发酵特性的内在关联机制,以期为木本饲料的高效生物转化、贮存利用,以及反刍动物饲料体系的资源化开发提供理论依据与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为盛花期柠条,于2024年5月采自宁夏盐池县宁夏农垦茂盛有限公司人工柠条林(38°33'N,106°03'E)。柠条刈割后立即经机械揉丝、粉碎处理,运回实验室备用。柠条原料营养成分及单宁含量见表1。
表1 柠条原料营养成分及单宁含量

Table 1 Contents of nutritional components and tannin of Caragana korshinskii Kom. raw materialg/kg DM

项目 Items 含量 Content
中性洗涤纤维 NDF 792.86±12.76
酸性洗涤纤维 ADF 591.59±9.04
酸性洗涤木质素 ADL 108.39±7.69
半纤维素 Hemicellulose 201.27±19.15
纤维素 Cellulose 483.20±2.73
水溶性碳水化合物 WSC 32.56±0.96
粗蛋白质 CP 90.68±1.50
粗脂肪 EE 23.96±2.46
单宁 Tannin 47.35±0.82
试验所用纤维素酶(酶活力10 000 U/g)购自广东溢多利生物科技股份有限公司;TR RUT-C30(菌株编号BNCC186147,活菌数1×108 CFU/mL)购自北京北纳创联生物技术研究院;LP菌剂(活菌数≥5×1010 CFU/g)购自拉曼动物营养英国有限责任公司,经稀释冻干后制得试验用菌粉(活菌数1×106 CFU/g)。

1.2 试验设计与方法

本试验以盛花期柠条为原料,采用两阶段3×2双因子试验设计开展研究,试验分为2个阶段:第1阶段为有氧发酵阶段,旨在评估不同预处理方式对柠条营养成分的影响,共设置3个处理,分别为无添加剂(CK处理)、添加70 mL/kg鲜重(FW)TR(TR处理)、添加70 mg/kg FW纤维素酶(CE处理),每个处理6个重复。其中,TR与CE处理分别以菌液及酶液形式直接添加,未单独设置载体对照,因此本试验所观测的处理效应为活性成分与制剂基质的综合效应。参照《饲料中水分的测定》(GB/T 6435—2014)测定柠条原料初始水分含量,并将其调节至60%;将柠条原料与各添加剂按对应处理要求充分混合后,每份称取300 g样品装入聚丙烯青贮袋(11.46 cm×36.00 cm),采用带透气片的封口盖密封,置于28 ℃条件下有氧发酵7 d,发酵期间每12 h翻动1次底物,保证底物与氧气充分接触,发酵结束后取样测定样品营养成分。第2阶段为青贮阶段,以第1阶段发酵产物为原料,在每种预处理条件下均设置2个处理,即接种70 mg/kg FW的LP(LP处理)与未接种LP(NLP处理),最终形成3×2共6个组合处理,用于分析预处理方式与LP的交互效应。每个组合处理设置3个生物学重复,每个重复称取200 g样品装入聚乙烯青贮袋(20 cm×30 cm),抽真空后密封,置于25 ℃室内避光条件下青贮60 d,发酵结束后测定青贮营养成分含量、发酵品质、形态结构及体外发酵特性。进行所有理化指标测定时,对每个生物学重复均设置3次技术重复,以提高测定结果的稳定性与代表性。

1.3 指标测定

1.3.1 营养成分和单宁含量及霉菌数量

取有氧发酵和青贮阶段样品,于105 ℃烘箱中杀青30 min,随后置于65 ℃烘箱烘至恒重。将烘干样品研磨,过1 mm筛网后备用。其中,NDF、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)和ADL含量采用范氏洗涤纤维法[15]测定,并通过NDF与ADF含量及ADF与ADL含量的差值计算半纤维素和纤维素含量;水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate,WSC)含量采用硫酸-蒽酮比色法[16]测定;粗脂肪(ether extract,EE)和粗灰分(crude ash,Ash)含量参照AOAC(2000)[17]测定;CP含量采用凯氏定氮法[18]测定;霉菌数量采用平板计数法[19]测定;单宁含量参照《饲料中单宁的测定 分光光度法》(GB/T 27985—2011)测定。柠条原料NDF、ADF、ADL、WSC、EE、CP和单宁含量的测定方法同上。

1.3.2 发酵品质

取20 g柠条青贮样品,加入60 mL去离子水,于4 ℃条件下浸提24 h;浸提液经定性滤纸过滤后,采用S20K型pH计(Mettler Toledo,瑞士)测定滤液pH,并采用苯酚-次氯酸钠比色法测定NH3-N含量。滤液中乳酸(lactic acid,LA)、乙酸(acetic acid,AA)、丙酸(propionic acid,PA)和丁酸(butyric acid,BA)含量采用岛津高效液相色谱仪(Shimadzu,日本)测定,色谱条件:色谱柱Agilent TC-C18,流动相为甲醇,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃。

1.3.3 青贮形态结构观察

柠条青贮样品经预处理、干燥后,固定于扫描样品台,采用IB-3型离子溅射仪(Eiko,日本)进行铂金喷涂处理,使样品表面具有导电性,随后置于干燥器内待测。采用SU5000型热场发射扫描电镜(Hitachi,日本)对样品显微形态结构进行观察,设定放大倍率为1 000倍,观察并记录样品表面特征及物理结构,包括孔隙分布、表面粗糙度、颗粒粒径及形态等相关信息。

1.3.4 体外瘤胃发酵特性

试验动物的处理与护理均严格遵循宁夏大学科技伦理委员会的相关规定并已获得批准(批准号:24-F-062)。试验所用瘤胃液取自宁夏红寺堡天源良种羊繁育有限公司,于晨饲前采集5头滩羊的瘤胃液,置于恒温无氧保温瓶中带回实验室。瘤胃液经4层纱布过滤后于39 ℃水浴并持续通入二氧化碳(CO2)。参照Menke等[20]的方法配制缓冲液,配制完成后于39 ℃水浴条件下通入CO2,至溶液由粉色完全褪为无色,再将瘤胃液与缓冲液按1∶2体积比混合,制备成人工瘤胃液。

1.3.4.1 体外消化率

采用ANKOM DAISY Ⅱ体外模拟消化系统测定体外消化率。准确称取(0.500±0.005) g柠条青贮样品封装于F57纤维袋中,每个处理设3个重复;将纤维袋置于消化罐内,注入2 L人工瘤胃液,通入CO2后密封,于39 ℃恒温培养48 h。培养结束后取出纤维袋,用流动蒸馏水冲洗至滤出液澄清,65 ℃烘至恒重,分别计算体外干物质消化率(in vitro dry matter digestibility,IVDMD)、体外中性洗涤纤维消化率(in vitro neutral detergent fiber digestibility,IVNDFD)和体外酸性洗涤纤维消化率(in vitro acid detergent fiber digestibility,IVADFD),计算公式如下:
IVDMD(%)=[(发酵前样品DM含量-终止发酵后残渣DM含量)/发酵前样品DM含量]×100;
IVNDFD(%)=[(发酵前样品NDF含量-终止发酵后残渣NDF含量)/发酵前样品NDF含量]×100;
IVADFD(%)=[(发酵前样品ADF含量-终止发酵后残渣ADF含量)/发酵前样品ADF含量]×100。

1.3.4.2 体外产气量及产气动力学参数

采用ANKOM RFS全自动产气监测系统测定体外产气量。准确称取(1.000±0.005) g柠条青贮样品置于250 mL培养瓶中,注入110 mL人工瘤胃液后,持续通入CO2(不少于15 s),待压力归零后密封。将培养瓶于39 ℃恒温振荡培养48 h,每个处理设置3个重复,系统每1 h自动记录产气量。产气动力学参数参照Ørskov等[21]的模型进行计算:
GP=(a+b)×(1-e-ct)。
式中:GP表示t时刻的累计产气量(mL);a表示快速产气部分(mL);b表示慢速产气部分(mL);c表示产气速率(h-1),a+b表示潜在产气量(mL)。

1.3.4.3 体外瘤胃发酵参数

体外产气试验培养48 h结束后,取出250 mL培养瓶,立即用冰水浴终止发酵进程。将瓶内混合物摇匀后,培养液经4层无菌纱布过滤,采用S20K型pH计(Mettler Toledo,瑞士)测定滤液pH,使用岛津高效气相色谱仪(Shimadzu,日本)测定AA、PA、BA、戊酸(valeric acid,VA)、异丁酸(isobutyric acid,Iso-BA)和异戊酸(isovaleric,Iso-VA)含量,并计算总挥发性脂肪酸(total volatile fatty acids,TVFAs)含量。

1.4 数据统计分析

所有数据经Excel 2016整理后,采用SPSS 26.0软件进行统计分析。有氧发酵阶段营养成分含量采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行检验。青贮阶段营养成分含量、发酵品质及体外消化试验数据采用一般线性模型进行3×2双因素方差分析,不同预处理方式间的差异采用Duncan氏法进行多重比较,LP接种与否间的差异采用t检验进行分析。结果以平均值和均值标准误(SEM)表示,P<0.05为差异显著。
双因素方差分析模型如下:
Yij=μ+Pi+Lj+(P×L)ij+eijk。
式中:Yij为青贮阶段各指标测定值;μ为总平均值;Pi为有氧发酵阶段预处理方式的主效应(i=1,2,3);Lj为青贮阶段LP的主效应(j=1,2);(P×L)ij为预处理方式与LP的交互效应;eijk为随机误差。

2 结果与分析

2.1 不同预处理方式对柠条营养成分和单宁含量及霉菌数量的影响

由表2可知,有氧发酵7 d后,与CK处理相比,TR和CE处理的CP含量显著升高(P<0.05),且以TR处理最高;TR和CE处理的NDF、半纤维素和单宁含量显著降低(P<0.05);TR处理的ADF和纤维素含量显著降低(P<0.05)。各处理间ADL、WSC和EE含量及霉菌数量均无显著差异(P>0.05)。
表2 不同预处理方式对柠条营养成分和单宁含量及霉菌数量的影响

Table 2 Effects of different pretreatment methods on contents of nutritional components, tannin and mold count of Caragana korshinskii Kom.

项目
Items		 预处理方式 Pretreatment methods 均值标准误
SEM		 P值
P-value
CK TR CE
中性洗涤纤维 NDF/% DM 78.67a 68.84b 71.32b 1.363 <0.001
酸性洗涤纤维 ADF/% DM 58.00a 52.05b 54.66ab 0.927 0.012
酸性洗涤木质素 ADL/% DM 10.01 8.88 9.07 0.232 0.097
半纤维素 Hemicellulose/% DM 20.67a 16.79b 16.65b 0.757 0.029
纤维素 Cellulose/% DM 47.99a 43.17b 45.59ab 0.724 0.006
水溶性碳水化合物 WSC/% DM 3.23 3.19 3.24 0.182 0.376
粗蛋白质 CP/% DM 9.02c 9.89a 9.21b 0.128 <0.001
粗脂肪 EE/% DM 2.29 2.39 2.36 0.043 0.691
单宁 Tannin/(g/kg DM) 38.48a 32.14c 35.62b 0.671 <0.001
霉菌数量 Mold count/[lg(CFU/g FW)] 3.21 3.18 3.23 0.025 0.712

CK:无添加剂 no additive;TR:里氏木霉 Trichoderma reesei;CE:纤维素酶 cellulase。下表同 the same as below。

同行数据肩标无字母或相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。In the same row, values with no letter or the same lowercase letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different lowercase letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.2 不同发酵处理对柠条青贮营养成分及单宁含量的影响

由表3可知,预处理方式与LP对柠条青贮NDF、ADF、ADL、半纤维素、纤维素及单宁含量存在显著交互效应(P<0.05)。与未接种LP相比,接种LP后柠条青贮CP含量显著升高(P<0.05),单宁含量显著降低(P<0.05),且该效应在TR与CE处理条件下更为明显。与CK处理相比,TR和CE处理柠条青贮NDF、ADF、半纤维素和纤维素含量显著降低(P<0.05);在TR处理条件下接种LP,可进一步显著降低上述指标含量(P<0.05),如NDF含量从64.33% DM降至61.05% DM。而在CE处理条件下接种LP,对部分纤维组分(如半纤维素)的进一步降解效果不显著(P>0.05),表明TR处理与LP在纤维组分降解方面具有更强的协同增效作用。在TR处理条件下,接种LP后柠条青贮ADL含量较未接种时显著降低(从9.23% DM降至9.13% DM,P<0.05);而在CE与CK处理条件下,接种LP对柠条青贮ADL含量无显著影响(P>0.05)。此外,在TR与CE处理条件下,接种LP后柠条青贮Ash含量较未接种时显著升高(P<0.05)。
表3 不同发酵处理对柠条青贮营养成分及单宁含量的影响

Table 3 Effects of different fermentation treatments on contents of nutritional components and tannin of Caragana korshinskii Kom. silage

项目
Items		 预处理方式
Pretreatment
methods		 植物乳杆菌 LP 均值标准误
SEM		 P值 P-value
NLP LP P L P×L


中性洗涤纤维
NDF/% DM		 CK 79.08Aa 77.36Ba

1.399

<0.001

<0.001

<0.001
TR 64.33Ac 61.05Bb
CE 69.63Ab 65.24Bb


酸性洗涤纤维
ADF/% DM		 CK 57.95Aa 56.53Ba

0.703

<0.001

<0.001

<0.001
TR 50.64Ac 48.52Bc
CE 53.70Ab 50.83Bb


酸性洗涤木质素
ADL/% DM		 CK 9.50a 9.47a

0.267

0.006

<0.001

0.004
TR 9.23Aab 9.13Bb
CE 9.34a 9.30a


半纤维素
Hemicellulose/% DM		 CK 21.13a 20.83a

0.708

<0.001

0.007

<0.001
TR 13.50Ac 12.53Bc
CE 15.93b 14.60b


纤维素
Cellulose/% DM		 CK 48.45Aa 47.07Ba

0.678

<0.001

<0.001

0.001
TR 41.40Ac 39.38Bc
CE 44.35Ab 41.52Bb


水溶性碳水化合物
WSC/% DM		 CK 2.50b 3.04b

0.162

<0.001

<0.001

0.624
TR 3.09Ba 3.55Aa
CE 2.78b 3.15ab


粗脂肪
EE/% DM		 CK 2.28 2.21

0.021

0.241

0.907

0.843
TR 2.29 2.32
CE 2.02 2.13


粗蛋白质
CP/% DM		 CK 8.48B 9.37A

0.107

0.102

<0.001

0.431
TR 8.57B 9.72A
CE 8.55B 9.56A


粗灰分
Ash/% DM		 CK 2.77c 3.10b

0.051

<0.001

0.007

0.324
TR 3.09Ba 3.40Aa
CE 2.84Bb 3.29Ab


单宁
Tannin/(g/kg DM)		 CK 37.25Aa 33.97Ba

0.651

0.007

<0.001

0.003
TR 29.62Ac 25.10Bc
CE 32.47Ab 30.07Bb

NLP:未接种LP;LP:接种LP。P为有氧发酵阶段预处理方式的主效应;L为青贮阶段LP的主效应;P×L为预处理方式与LP的交互效应。同列数据肩标不同小写字母表示不同预处理方式间差异显著(P<0.05),同行数据肩标不同大写字母表示LP接种与否间差异显著(P<0.05)。下表同。

NLP: not inoculated with LP; LP: inoculated with LP. P represented the main effect of pretreatment methods during aerobic fermentation period; L represented the main effect of LP during ensiling period; P×L represented the interaction effect between pretreatment methods and LP. In the same column, values with different lowercase letter superscripts mean significant difference among different pretreatment methods (P<0.05); in the same row, values with different uppercase letter superscripts mean significant difference between LP inoculation or no inoculation (P<0.05). The same as below.

2.3 不同发酵处理对柠条青贮发酵品质的影响

由表4可知,预处理方式与LP对柠条青贮PA含量均无显著影响(P>0.05),各处理均未检出BA。预处理方式与LP对柠条青贮pH、LA和NH3-N含量及LA/AA比值存在显著交互效应(P<0.05)。TR处理柠条青贮pH和NH3-N含量最低,LA和AA含量最高。在TR处理条件下,接种LP后柠条青贮LA和AA含量及LA/AA比值较未接种时显著升高(P<0.05),pH和NH3-N含量较未接种时显著降低(P<0.05)。未接种LP时,CE处理柠条青贮pH和NH3-N含量较CK处理显著降低(P<0.05),LA与AA含量较CK处理显著升高(P<0.05);CE处理条件下,接种LP后柠条青贮pH和NH3-N含量较未接种时显著降低(P<0.05),AA和LA含量较未接种时显著升高(P<0.05)。
表4 不同发酵处理对柠条青贮发酵品质的影响

Table 4 Effects of different fermentation treatments on fermentation quality of Caragana korshinskii Kom. silage

项目
Items		 预处理方式
Pretreatment
methods		 植物乳杆菌 LP 均值标准误
SEM		 P值 P-value
NLP LP P L P×L


pH		 CK 5.32Aa 4.61Ba

0.045

<0.001

<0.001

<0.001
TR 5.16Ac 4.55Bb
CE 5.22Ab 4.61Ba


乳酸 LA/% DM		 CK 0.91Bc 1.89Ab

0.108

<0.001

<0.001

<0.001
TR 1.45Ba 2.84Aa
CE 1.19Bb 2.02Ab


乙酸 AA/% DM		 CK 0.41b 0.57b

0.018

<0.001

<0.001

0.098
TR 0.53Ba 0.72Aa
CE 0.53Ba 0.62Ab


丙酸 PA/% DM		 CK 0.13 0.10

0.005

0.089

0.279

0.706
TR 0.14 0.12
CE 0.14 0.13


丁酸 BA/% DM		 CK ND ND
TR ND ND
CE ND ND


乳酸/乙酸 LA/AA		 CK 2.22Bb 3.31Ab

0.113

<0.001

<0.001

<0.001
TR 2.76Ba 3.94Aa
CE 2.33Bab 3.27Ab


氨态氮 NH3-N/% DM		 CK 11.00Aa 9.13Ba

0.183

<0.001

<0.001

0.003
TR 8.33Ac 7.00Bc
CE 9.48Ab 8.17Bb

ND:未检测到

not detected。

2.4 不同发酵处理对柠条青贮形态结构的影响

如图1所示,CK+NLP处理(图1-A)柠条青贮结构紧密且排列有序;CE+NLP处理(图1-B)柠条青贮纤维表面出现大量裂纹与孔隙,呈现原纤化、粗糙的形貌;TR+NLP处理(图1-C)对柠条青贮造成的破坏最为明显,样品外表面形成蛛网状结构,伴随明显的断裂、蚀孔及结构塌陷,内部组织因此暴露。
图1 不同发酵处理对柠条青贮形态结构的影响

A:CK+NLP处理 CK+NLP treatment;B:CE+NLP处理 CE+NLP treatment;C:TR+NLP处理 TR+NLP treatment;D:CK+LP处理 CK+LP treatment;E:CE+LP处理 CE+LP treatment;F:TR+LP处理 TR+LP treatment。

Fig.1 Effects of different fermentation treatments on morphological structure of Caragana korshinskii Kom. silage (×1 000)

在该发酵体系中,LP单独作用(CK+LP处理,图1-D)仅使柠条青贮表面发生轻微改性;CE+LP处理(图1-E)柠条青贮表面的破坏程度进一步加剧,表现为多孔化;TR+LP处理(图1-F)则使柠条青贮形成倾斜多孔的结构,该结构渗透性更强且比表面积更高。

2.5 不同发酵处理对柠条青贮体外瘤胃发酵特性的影响

2.5.1 体外消化率

如图2所示,不同预处理方式显著影响柠条青贮体外发酵48 h的IVDMD、IVNDFD和IVADFD(P<0.05)。与CK处理相比,TR和CE处理柠条青贮IVDMD、IVNDFD和IVADFD显著升高(P<0.05),且以TR处理最高。在TR处理条件下,接种LP后柠条青贮IVDMD、IVNDFD和IVADFD较未接种时显著升高(P<0.05)。
图2 不同发酵处理对柠条青贮体外消化率的影响

NLP:未接种LP not inoculated with LP;LP:接种LP inoculated with LP;CK:无添加剂 no additive;TR:里氏木霉 Trichoderma reesei;CE:纤维素酶 cellulase。

数据柱形标注不同小写字母表示不同预处理方式间差异显著(P<0.05),不同大写字母表示LP接种与否间差异显著(P<0.05)。Values with different lowercase letters in the columns mean significant differences among different pretreatment methods (P<0.05), and different uppercase letters mean significant differences between LP inoculation or no inoculation (P<0.05).

Fig.2 Effects of different fermentation treatments on in vitro digestibility of Caragana korshinskii Kom. silage

2.5.2 体外产气量

由表5可知,各处理的体外产气量随培养时间的变化趋势一致:4~12 h呈快速上升趋势,24 h后增长速率放缓,36 h后基本保持稳定。预处理方式与LP对24~48 h的体外产气量存在显著交互效应(P<0.05)。未接种LP时,TR和CE处理在8~48 h的体外产气量均显著高于CK处理(P<0.05),TR处理与CE处理间无显著差异(P>0.05);接种LP后,TR处理在12~48 h的体外产气量均显著高于其他处理(P<0.05);在整个48 h培养过程中,TR与LP联合处理对体外产气量的提升效果最为显著。
表5 不同发酵处理对柠条青贮体外产气量的影响

Table 5 Effects of different fermentation treatments on in vitro gas production of Caragana korshinskii Kom. silagemL

时间
Time/h		 预处理方式
Pretreatment
methods		 植物乳杆菌 LP 均值标准误
SEM		 P值 P-value
NLP LP P L P×L


4		 CK 14.28B 18.09A

0.375

0.116

<0.001

0.453
TR 15.48B 18.44A
CE 14.90B 17.99A


8		 CK 20.29Bb 24.52Ab

0.519

0.001

<0.001

0.564
TR 21.74Ba 26.75Aa
CE 21.71Ba 25.97Aa


12		 CK 25.25Bb 31.89Ac

0.767

<0.001

<0.001

0.739
TR 27.99Ba 35.14Aa
CE 27.00Ba 33.65Ab


16		 CK 27.57Bb 33.73Ac

0.758

<0.001

<0.001

0.231
TR 30.13Ba 37.46Aa
CE 29.22Ba 35.78Ab


20		 CK 29.56Bb 35.97Ac

0.789

<0.001

<0.001

0.062
TR 31.16Ba 39.31Aa
CE 30.31Ba 37.22Ab


24		 CK 31.04Bb 37.89Ac

0.851

<0.001

<0.001

0.004
TR 32.21Ba 41.31Aa
CE 31.63Ba 39.15Ab


28		 CK 31.38Bb 38.30Ac

0.858

<0.001

<0.001

0.001
TR 32.43Ba 41.90Aa
CE 32.10Ba 39.27Ab


32		 CK 31.63Bb 38.49Ab

0.853

<0.001

<0.001

<0.001
TR 32.55Ba 42.17Aa
CE 32.48Ba 39.33Ab


36		 CK 31.84Bb 38.68Ab

0.845

<0.001

<0.001

<0.001
TR 32.60Ba 42.21Aa
CE 32.63Ba 39.35Ab


40		 CK 31.89Bb 38.77Ab

0.844

<0.001

<0.001

<0.001
TR 32.65Ba 42.23Aa
CE 32.68Ba 39.38Ab


44		 CK 32.02Bb 38.83Ab

0.839

<0.001

<0.001

<0.001
TR 32.68Ba 42.25Aa
CE 32.71Ba 39.39Ab


48		 CK 32.05Bb 38.85Ab

0.837

<0.001

<0.001

<0.001
TR 32.70Ba 42.26Aa
CE 32.74Ba 39.39Ab

2.5.3 体外产气动力学参数

由表6可知,各预处理条件下,接种LP后柠条青贮体外发酵的快速降解部分、慢速降解部分及潜在产气量均较未添加时显著升高(P<0.05)。接种LP后,CE处理的潜在产气量显著高于TR和CK处理(P<0.05)。CK处理的快速降解部分、慢速降解部分及潜在产气量均处于较低水平。此外,无论是否接种LP,各处理的产气速率均无显著差异(P>0.05)。
表6 不同发酵处理对柠条青贮体外产气动力学参数的影响

Table 6 Effects of different fermentation treatments on in vitro gas production kinetic parameters of Caragana korshinskii Kom. silage

项目
Items		 预处理方式
Pretreatment
methods		 植物乳杆菌 LP 均值标准误
SEM		 P值 P-value
NLP LP P L P×L


快速产气部分 a/mL		 CK 9.40B 14.01A

0.507

0.541

<0.001

0.074
TR 10.68B 12.93A
CE 10.08B 14.41A


慢速产气部分 b/mL		 CK 22.65B 24.69A

0.405

0.117

<0.001

0.087
TR 22.02B 25.57A
CE 22.66B 26.19A


潜在产气量 a+b/mL		 CK 32.05B 38.70Ab

0.841

<0.001

<0.001

<0.001
TR 32.70B 38.50Ab
CE 32.74B 40.60Aa


产气速率 c/h-1		 CK 0.14 0.14

0.002

0.375

0.545

0.235
TR 0.15 0.14
CE 0.14 0.14

2.5.4 体外瘤胃发酵参数

由表7可知,预处理方式和LP及二者的交互效应对各体外瘤胃发酵参数均有显著影响(P<0.05),其中TR处理对各发酵参数的改善效果最为突出。未接种LP时,与CK处理相比,TR处理的pH和AA/PA比值显著降低(P<0.05),AA、PA、BA和TVFAs含量显著升高(P<0.05);在TR处理条件下,接种LP后的AA、PA、BA和TVFAs含量较未接种时显著升高(P<0.05),且pH和AA/PA比值较未接种时显著降低(P<0.05)。CE处理的作用效果与TR处理相似,但改善强度较弱。无论是否接种LP,CE处理均能显著降低pH(P<0.05),但对各挥发性脂肪酸(VFA)含量的改善作用有限;接种LP后,CE处理对发酵参数的改善程度整体上低于TR处理。CK处理的整体发酵性能较差,相关发酵产物含量均低于TR处理。
表7 不同发酵处理对柠条青贮体外瘤胃发酵参数的影响

Table 7 Effects of different fermentation treatments on in vitro rumen fermentation parameters of Caragana korshinskii Kom. silage

项目
Items		 预处理方式
Pretreatment
methods		 植物乳杆菌 LP 均值标准误
SEM		 P值 P-value
NLP LP P L P×L


pH		 CK 6.58Aa 6.50Ba

0.011

<0.001

0.012

0.005
TR 6.53Ab 6.43Bc
CE 6.52Ab 6.47Bb


乙酸
AA/(mmol/L)		 CK 26.33Bb 31.70Ab

0.886

<0.001

<0.001

<0.001
TR 33.77Ba 35.78Aa
CE 26.87Bb 33.63Aab


丙酸
PA/(mmol/L)		 CK 8.83Bb 9.86Ac

0.542

<0.001

<0.001

<0.001
TR 11.88Ba 14.88Aa
CE 9.12Bb 13.23Ab


异丁酸
Iso-BA/(mmol/L)		 CK 0.58A 0.48B

0.015

0.007

0.002

0.042
TR 0.49 0.44
CE 0.55A 0.46B


丁酸
BA/(mmol/L)		 CK 2.88b 3.67

0.152

0.012

0.004

0.045
TR 3.76Ba 4.53A
CE 3.60Bab 4.24A


异戊酸
Iso-VA/(mmol/L)		 CK 0.80 0.76b

0.035

0.031

0.039

0.036
TR 0.94 1.08a
CE 1.07 0.95a


戊酸
VA/(mmol/L)		 CK 0.61b 0.81

0.044

0.007

0.022

0.039
TR 0.92ab 1.02
CE 1.02a 0.90


乙酸/丙酸
AA/PA		 CK 2.99a 3.22a

0.070

<0.001

0.002

<0.001
TR 2.84Ab 2.41Bc
CE 2.95Aa 2.54Bb


总挥发性脂肪酸
TVFAs/(mmol/L)		 CK 40.03Bc 47.28Ac

1.537

<0.001

<0.001

0.021
TR 51.76Ba 57.72Aa
CE 42.23Bb 53.49Ab

3 讨论

3.1 不同发酵处理对柠条青贮营养及发酵品质的影响

柠条是一种营养丰富的青贮原料,但其高度木质化的结构阻碍了微生物对细胞壁多糖的利用,导致发酵底物供给不足、pH下降滞后,进而抑制LA发酵并降低养分利用率。为改善发酵品质,需要通过适宜的预处理方式来破坏其坚韧的木质纤维素复合结构。TR作为一种高效的纤维素降解菌,不仅能通过根状结构穿透植物细胞壁的角质层和木质素,更能分泌包括纤维素酶、半纤维素酶及木质素过氧化物酶等在内的复杂酶系,直接作用于植物细胞壁,提高其降解速率[22]。本研究中,柠条青贮前经TR或CE有氧发酵预处理,CP含量显著增加,NDF、半纤维素和单宁含量显著降低;其中TR处理还显著降低了ADF和纤维素含量,这与Heng等[23]和Borisova等[24]的研究结果相符。经TR处理后,柠条CP含量显著增加,这很可能与发酵过程中LCC被水解破坏,从而释放出原本被包被的基质蛋白质有关;此外,TR可通过分泌单宁酶、表达脲酶及合成微生物生物量,促进蛋白质的积累[25]。霉菌及其毒素是影响青贮品质的关键因素,本试验中各处理的霉菌数量均维持在较低水平,表明有氧发酵预处理可有效改善柠条作为青贮原料的适用性。值得注意的是,TR处理对单宁含量的降低效果优于CE处理,这可能与TR分泌的多酚氧化酶和单宁酶对缩合型单宁的降解作用相关。青贮阶段添加LP可进一步降低单宁含量,其中TR与LP联合处理的降幅最大,这可能是由于TR破坏LCC释放单宁,LP快速产酸降低发酵体系pH,而酸性环境促进单宁水解与聚合,进而降低其生物有效性。
LP作为同型乳酸菌,可快速产酸并降低发酵体系pH,从而抑制蛋白质分解菌和腐败菌活性,有效减少营养损失[26]。WSC是决定乳酸菌发酵活性的关键因子[27],TR处理青贮WSC含量显著增加,而接种LP可进一步增强WSC的保存效果,加快酸化速率,并显著降低青贮pH。优质豆科青贮的理想pH为4.3~4.7。本研究结果显示,TR与LP联合处理的青贮pH不仅处于该理想区间内,而且较其他处理更为稳定,体现出二者在抑制腐败菌和优化发酵环境方面的协同作用。
本研究中,在纤维降解方面,TR处理效果优于CE处理,因其能形成合理的酶系结构,更全面地破坏细胞壁结构。相比之下,LP虽然在木质纤维素降解中作用有限,但其快速产酸能力可维持低pH环境,显著抑制腐败微生物生长,减少TR分泌酶的失活或降解[28]。TR与LP联合处理在发酵过程中产生协同效应,显著提高了青贮纤维素及半纤维素的降解效率。尤其在ADL降解方面,本研究发现单独添加纤维素酶或LP均未产生显著效果,这与既往研究结果[29-30]一致;而TR与LP联合处理可显著降低青贮ADL含量,推测这与TR对LCC的酶解作用,以及LP提供酸性环境增强酶活性密切相关。
此外,TR与LP联合处理在有机酸积累方面表现最佳,二者协同不仅提高了LA含量,还增加了AA含量,表明其在促进同型LA发酵方面具有互补性。NH3-N含量是反映蛋白质降解程度的重要指标,在TR与LP联合处理时较单独TR处理时显著降低。这可能是由于TR降解LCC减少了蛋白质的暴露,同时释放可溶性碳源以促进快速酸化;而LP通过迅速降低pH抑制蛋白质分解菌活性,二者共同实现对蛋白质降解的抑制[31]。

3.2 不同发酵处理对柠条青贮形态结构的影响

CE处理引起的纤维结构变化,主要源于纤维素酶对β-1,4-葡聚糖键的水解,进而破坏细胞壁的致密结构[32]。TR处理则表现出更为复杂的降解机制:一方面,其分泌的过氧化物酶可催化木质素发生脱甲基化和脱甲氧基化反应,降低纤维聚合度[33];另一方面,TR菌丝可机械性侵入次生壁S2层,破坏纤维素结晶区结构的同时增加孔隙率,显著提升了细胞壁的可降解性[34]。作为对照,未经过外源酶或微生物作用的CK处理,纤维结构基本保持完整,降解程度低于TR与CE处理。
在预处理的基础上,接种LP进一步促进了柠条青贮纤维素的降解。CE处理后,LP快速产酸不仅能够降低糖苷键水解所需的活化能,提升纤维素酶的降解效率,还可通过生成的乳酸溶解钙质胶结物,软化纤维网络结构,进一步促进纤维素酶解过程[12]。TR处理后,复合酶系与菌丝的物理穿透作用共同形成了多孔化的细胞壁渗透结构,LP则通过产酸能力为复合酶提供适宜的酸性环境,从而加速了LCB的降解过程[35]。此外,TR与CE处理均可引发LCB的部分脱聚,这不仅改善了细胞壁的可降解性,还为瘤胃微生物提供了更多附着与定植位点,从而可有效提升瘤胃发酵效率和饲粮纤维的消化率[36]。

3.3 不同发酵处理对柠条青贮体外瘤胃发酵特性的影响

体外消化率是评价青贮饲料营养物质有效利用程度的重要指标。本研究结果表明,在不同预处理方式中,TR与CE处理均能显著提高IVDMD、IVNDFD和IVADFD,且TR处理的改善效果更为突出。与CE处理的酶水解机制相比,TR处理特有的菌-酶协同降解机制(如木质素修饰与物理穿孔)能更高效地破坏柠条坚韧的细胞壁结构,改善发酵底物的可及性,进而提高纤维降解效率。接种LP进一步增强了预处理效果,且TR+LP处理表现最优。这可能与LP在发酵过程中加速细胞壁多糖降解、促进纤维分解、增强养分释放有关[37]。
体外产气量及产气动力学参数反映了青贮饲料在瘤胃内的发酵状况和微生物活性。本研究发现,TR处理显著提高了柠条青贮的体外产气量,这主要是由于其有效降解了木质纤维素,增加可溶性物质含量,为瘤胃微生物提供更多发酵底物[38]。在此基础上,额外接种的LP通过快速产酸降低pH并改善微生物群落结构,为瘤胃微生物创造更高效的发酵环境。因此,当TR与LP联合处理时,产气量与发酵效率均得到提高,表明二者在促进底物利用与微生物活性方面具有协同效应。
体外瘤胃发酵参数是综合衡量青贮饲料营养价值、发酵品质和微生物活性的重要指标,其中瘤胃液pH和VFA生成量是关键指标。维持瘤胃液pH在5.9~7.2,有利于瘤胃微生物的正常代谢与功能发挥[39]。本研究中,所有处理的体外发酵pH均处于此适宜范围,表明菌酶预处理及乳酸菌添加均未破坏瘤胃内环境的稳定性。与CK处理相比,TR处理显著降低了体外瘤胃发酵pH和AA/PA比值,同时显著提升了AA、PA、BA及TVFAs含量;而CE处理的改善作用相对有限,其仅在降低pH和提高TVFAs含量上表现出显著性。接种LP使TR处理下pH进一步显著降低,AA、PA及TVFAs含量显著升高。这与Nurjana等[40]和Mu等[41]的研究结果一致,即较低的pH常伴随更高的TVFAs积累。从代谢角度分析,AA含量上升与碳水化合物消化率提高有关,PA作为反刍动物糖异生的重要前体,其占比增加(即AA/PA比值降低)标志着发酵模式向能量转化效率更高的方向转变。BA含量的增加则与IVNDFD和IVADFD的提高相互印证,反映了纤维降解效率的增强。综上所述,TR与LP联合处理通过优化瘤胃微生物活性与VFA代谢谱(即促进PA生成并大幅提高TVFAs总量),最为有效地改善柠条青贮的体外瘤胃发酵特性。

4 结论

TR通过多酶系协同作用显著促进柠条木质纤维素降解,并与LP形成互补效应,共同改善青贮发酵环境及提升营养物质保存效率。本研究构建的两阶段发酵体系,通过“菌酶有氧预降解-乳酸菌厌氧保存”模式,有效提升了柠条青贮的体外消化率和产气性能。该结果揭示了木本饲料生物转化的潜在机制,为高纤维木本饲料资源的高效生物转化与利用提供了可行的技术路径。

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