动物营养学报 >

2026 , Vol. 38 >Issue 6: 4676 - 4688

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.374

研究论文

戊糖片球菌对苜蓿与串叶松香草混贮发酵品质和微生物群落的影响

  • 闫雨婷 ,
  • 珠拉 ,
  • 赵牧其尔 , * ,
  • 郝俊峰 ,
  • 格根图 , * ,
  • 贾玉山 ,
  • 王志军
展开
  • 内蒙古农业大学草业学院, 农业农村部饲草栽培、加工与高效利用重点实验室, 草地资源教育部重点实验室, 呼和浩特 010019
* 赵牧其尔,讲师,E-mail: ;
格根图,教授,博士生导师,E-mail:

闫雨婷(2000—),女,黑龙江牡丹江人,博士研究生,从事牧草加工与利用研究。E-mail:

Office editor: 田艳明

收稿日期: 2025-12-05

  网络出版日期: 2026-06-13

基金资助

一流学科专项一般项目-基于多组学分析的苜蓿青贮发酵时间序列中菌群-代谢互作与营养调控机制(IMAUCXQJ2025004)

一流学科专项项目-饲草产品质量安全调控及功能性产品的开发(YLXKZX-NND-004)

收起

Effects of Pediococcus pentosaceus on Fermentation Quality and Microbiota of Alfalfa and Silphium perfoliatum Mixed Silage

  • YAN Yuting ,
  • ZHU La ,
  • ZHAO Muqier , * ,
  • HAO Junfeng ,
  • GE Gentu , * ,
  • JIA Yushan ,
  • WANG Zhijun
Expand
  • Key Laboratory of Grassland Resources of Ministry of Education, Key Laboratory of Forage Cultivation, Processing and Highly Efficient Utilization of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, College of Grassland Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, China
* ZHAO Muqier, lecturer, E-mail: ;
GE Gentu, professor, E-mail:

Received date: 2025-12-05

  Online published: 2026-06-13

Fold

摘要

本试验旨在探究戊糖片球菌对苜蓿与串叶松香草混贮发酵品质和微生物群落的影响。选择紫花苜蓿和串叶松香草为青贮原料,以1∶1进行混贮,设置对照组(CK组)和戊糖片球菌组(PP组)(每组3个重复),CK组不添加添加剂,PP组添加戊糖片球菌,室温条件下密封发酵60 d,测定营养成分含量、发酵品质和微生物群落。结果表明:1)与CK组相比,PP组干物质含量显著降低(P<0.05),粗蛋白质、粗脂肪和水溶性碳水化合物含量显著提高(P<0.05)。2)与CK组相比,PP组pH显著降低(P<0.05),乳酸含量显著提高(P<0.05),丙酸和氨态氮含量显著降低(P<0.05)。3)与CK组相比,PP组微生物群落ACE指数、Chao指数和Sobs指数显著降低(P<0.05)。在门水平上,与CK组相比,PP组芽孢杆菌门(Bacillota)相对丰度提高,假单胞菌门(Pseudomonadota)相对丰度降低;在属水平上,与CK组相比,PP组乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)、片球菌属(Pediococcus)和慢生乳杆菌属(Lentilactobacillus)相对丰度提高,肠球菌属(Enterococcus)等相对丰度降低。同时,与原料相比,添加戊糖片球菌可以降低鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和梭菌属(Clostridium)相对丰度。综上所述,添加戊糖片球菌可以调控苜蓿与串叶松香草混贮微生物群落,从而改善其发酵品质。

关键词： 戊糖片球菌; 苜蓿; 串叶松香草; 混贮; 发酵品质; 微生物群落

本文引用格式

闫雨婷 , 珠拉 , 赵牧其尔 , 郝俊峰 , 格根图 , 贾玉山 , 王志军 . 戊糖片球菌对苜蓿与串叶松香草混贮发酵品质和微生物群落的影响[J]. 动物营养学报, 2026 , 38(6) : 4676 -4688 . DOI: 10.12418/CJAN2026.374

Abstract

This experiment was conducted to explore the effects of Pediococcus pentosaceus on fermentation quality and microbiota of alfalfa and Silphium perfoliatum mixed silage. Alfalfa and Silphium perfoliatum were selected as silage raw materials and mixed in ratio of 1∶1. A control group (CK group) and a Pediococcus pentosaceus group (PP group) were set up (with 3 replicates in each group), no additives were added to CK group, while Pediococcus pentosaceus was added to PP group. Sealed fermentation was carried out at room temperature for 60 days, and the nutrient contents, fermentation quality and microbiota were determined. The results showed as follows: 1) compared with CK group, the dry matter content in PP group was significantly decreased (P<0.05), and the contents of crude protein, ether extract and water-soluble carbohydrates were significantly increased (P<0.05). 2) Compared with CK group, the pH in PP group was significantly decreased (P<0.05), the lactic acid content was significantly increased (P<0.05), and the contents of propionic acid and ammonia nitrogen were significantly decreased (P<0.05). 3) Compared with CK group, the ACE index, Chao index and Sobs index of microbiota in PP group were significantly decreased (P<0.05). At the phylum level, compared with CK group, the Bacillota relative abundance in PP group was increased, while the Pseudomonadota relative abundance was decreased; at the genus level, compared with CK group, the relative abundances of Lactiplantibacillus, Pediococcus and Lentilactobacillus in PP group were increased, while the Enterococcus relative abundance was decreased. Meanwhile, compared with the raw materials, the addition of Pediococcus pentosaceus could reduce the relative abundances of Sphingomonas and Clostridium. In conclusion, the addition of Pediococcus pentosaceus can regulate the microbiota of alfalfa and Silphium perfoliatum mixed silage, thereby improving the fermentation quality.

Key words： Pediococcus pentosaceus; alfalfa; Silphium perfoliatum; mixed silage; fermentation quality; microbiota

近年来,我国畜牧业步入高速发展阶段,但饲料供应的结构性短缺问题愈发严峻,以玉米、豆粕为主的常规饲料面临供需失衡压力,大豆等原料的对外依存度高更加加剧了供应的不确定性,已难以适配畜牧业高质量发展的需求。因此,挖掘并拓展多元化饲料资源,成为破解行业当前发展瓶颈的紧迫任务[1]。串叶松香草(Silphium perfoliatum),又名松香草,得名于茎从两叶中间贯穿而出,茎上对生叶片的基部相连呈杯状,是原产北美的菊科植物[2]。1979年,串叶松香草种子由中国科学院植物研究所北京植物园油料考察组访问朝鲜期间引入至我国[3]。作为一种优质、高产的饲用植物,串叶松香草在农艺性状上表现出适应性广、抗逆性强、易栽培及强分蘖等特点;在营养与功能成分方面,串叶松香草粗蛋白质(CP)含量较高,并富含黄酮类化合物和超氧化物歧化酶(SOD)等活性物质[4-5];此外,作为多年生草本植物,串叶松香草一般可生长10~15年[6],并适宜用作牛、羊、猪、兔等多种家畜的饲料[7-8]。
串叶松香草一般在每年6月份进行第1次刈割,通常每隔20~30 d就可以再次收割并持续到秋末[9]。其水分含量高,晒制困难,且在自然晾晒过程中,叶片(蛋白质和维生素的主要部分)极易脱落和碎化,导致营养大量损失[10]。相比而言,制作青贮在营养保存、适口性和实际操作性上更具优势,并有研究表明不同处理串叶松香草饲用价值的综合排序为:青草>青贮>微贮>干草[11]。不过,当串叶松香草单独进行青贮60 d时,乳酸(lactic acid,LA)含量≤2%[以干物质(DM)计],丁酸(butyric acid,BA)含量为0.1%~0.2% DM,氨态氮(NH3-N)含量达12%~15%[以总氮(TN)计],说明其发酵效果并不理想[12],应该适当与其他植物混贮以改善其发酵品质。早期研究中提出“菊科多酚-豆科蛋白质”的混贮模型,其原理在于菊科植物中的多酚类物质可抑制蛋白质脱氨,而豆科植物可提供可发酵底物,同时菊科植物(如串叶松香草)富含的酚类物质可与豆科植物(如苜蓿)的蛋白质发生非共价结合,这种相互作用能在一定程度上抑制蛋白质在发酵过程中的过度降解,减少NH3-N等不良产物的生成,两者混贮具有“1+1>2”的发酵优势[13-14]。戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)作为青贮饲料发酵中常用的乳酸菌菌种,其核心功效是促进优质发酵、提高乳酸产量、降低NH3-N产生,同时减少营养损耗、抑制有害微生物,尤其在复杂原料[如高水分、低水溶性碳水化合物(WSC)原料]青贮中优势显著[15-17]。研究表明,在苜蓿[18]、荨麻[19]等多种青贮中,戊糖片球菌均可改善发酵品质,这对于稳定“菊科-豆科”混贮体系的发酵方向、减少营养损耗具有重要参考意义。基于此,本试验旨在通过探究戊糖片球菌对苜蓿与串叶松香草混贮发酵品质和微生物群落的影响,以期为串叶松香草的利用以及拓展多元化饲料资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验混合青贮所使用的原料为紫花苜蓿和串叶松香草,种植于内蒙古自治区呼和浩特市土默特左旗内蒙古农业大学海流图实验教学基地(40°31'17″N,111°23'46''E),其中紫花苜蓿于盛花期进行刈割,留茬高度8 cm;串叶松香草于结实期进行刈割,留茬高度5 cm。于2024年9月1日使用手持镰刀进行收割,青贮前用切割机将收割的紫花苜蓿和串叶松香草切成1~2 cm长。2种原料混合比例为1∶1,在混合前均经自然晾晒处理,将DM含量统一调整至约35%(安全水分含量范围),以消除高水分对压实的负面影响并避免渗滤液产生。2种原料营养成分含量见表1。戊糖片球菌制剂为市购产品,活菌数为2×1011 CFU/g。
表1 2种原料营养成分含量(实测值)

Table 1 Nutrient contents of the two raw materials (measured values)

项目
Items		 干物质
DM/% FW		 粗蛋白质
CP/% DM		 粗脂肪
EE/% DM		 水溶性碳水化合物
WSC/% DM		 中性洗涤纤维
NDF/% DM		 酸性洗涤纤维
ADF/% DM
苜蓿 Alfalfa 25.85±0.77 15.52±0.30 2.89±0.09 3.25±0.16 37.86±0.37 31.86±0.33
串叶松香草
Silphium perfoliatum		 16.58±0.68 13.16±0.11 3.24±0.06 4.84±0.10 34.66±0.50 29.41±0.52

1.2 试验设计

采用单因素试验设计,设置对照组(CK组)和戊糖片球菌组(PP组),每组3个重复。取600 g青贮原料,CK组不添加添加剂;PP组将添加剂溶解在20 mL蒸馏水中,并均匀喷洒在原料上。将原料混匀后装入3个30 cm×40 cm聚乙烯袋中,采用真空包装机密封,室温条件下发酵60 d,取样分析相关指标。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 营养成分含量

参照GB/T 6435—2014[20]中方法测定DM含量;参照GB/T 6432—2018[21]中方法测定CP含量;采用VELP SER148/6脂肪测试仪(意大利)按照所附说明书测定粗脂肪(EE)含量;参照AOAC(1990)[22]方法,采用Ankom 2000型纤维分析仪(美国)按照所附说明书测定中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量;采用蒽酮-硫酸比色法[23]测定WSC含量。

1.3.2 发酵品质

开袋后取10 g青贮样品,加入90 mL蒸馏水,使用均质拍打仪匀速拍打2 min,过滤得到青贮饲料浸提液。采用酸度计测量pH。采用Agilent 1100高效液相色谱仪(美国)测定乳酸、乙酸(acetic acid,AA)、丙酸(propionic acid,PA)和丁酸含量[24],色谱条件如下:色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为甲醇∶0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(10∶90,体积比),流速为1.0 mL/min,柱温为30 ℃,检测波长为210 nm。采用苯酚-次氯酸钠比色法[25]测定NH3-N含量,并采用凯氏定氮法测定总氮含量。

1.3.3 微生物测序

在无菌条件下称取约0.5 g(湿重)青贮饲料及原料样品,采用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals,美国),严格按照说明书操作提取微生物总DNA;提取后的DNA用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific,美国)检测浓度与纯度(A260/A280),并采用1%琼脂糖凝胶电泳评估其完整性;采用引物338F(5'-ACTCCTACGGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')扩增V3~V4高变区,并采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物;采用QuantiFluorTM-ST荧光定量系统进行定量,根据Illumina MiSeq平台标准操作程序使用纯化的扩增片段构建PE 2×300文库,并采用Illumina MiSeq PE300平台(上海美吉生物医药科技有限公司)进行测序。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2021对试验数据进行预处理,然后采用SAS 9.2软件进行统计分析,营养成分含量和发酵品质指标数据采用独立样本t检验;微生物群落数据采用一般线性模型(GLM)进行方差分析,差异显著时采用Tukey’s法进行多重比较。结果数据采用“平均值±标准误”形式表示,P<0.05表示差异显著。采用Origin 2024软件对数据进行绘图。

2 结果与分析

2.1 戊糖片球菌对苜蓿与串叶松香草混贮营养成分含量的影响

由表2可知,与CK组相比,PP组苜蓿与串叶松香草混贮DM含量显著降低(P<0.05),CP、EE和WSC含量显著提高(P<0.05),NDF和ADF含量无显著差异(P>0.05)。
表2 戊糖片球菌对苜蓿与串叶松香草混贮营养成分含量的影响

Table 2 Effects of Pediococcus pentosaceus on nutrient contents of alfalfa and Silphium perfoliatum mixed silage

项目
Items		 干物质
DM/% FW		 粗蛋白质
CP/% DM		 粗脂肪
EE/% DM		 水溶性碳水化合物
WSC/% DM		 中性洗涤纤维
NDF/% DM		 酸性洗涤纤维
ADF/% DM
CK组 CK group 35.15±1.17a 13.27±0.44b 3.11±0.08b 2.43±0.03b 36.92±1.02 29.26±1.89
PP组 PP group 30.82±0.83b 15.62±0.82a 4.22±0.09a 2.63±0.02a 38.01±0.45 29.70±1.15
P值 P-value <0.001 <0.001 <0.001 0.018 0.080 0.191

同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same column, values with different letter superscripts indicated significant difference (P<0.05), while with the same letter or no letter superscripts indicated no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 戊糖片球菌对苜蓿与串叶松香草混贮发酵品质的影响

由表3可知,与CK组相比,PP组苜蓿与串叶松香草混贮pH显著降低(P<0.05),乳酸含量显著提高(P<0.05),丙酸和NH3-N含量显著降低(P<0.05),乙酸含量无显著差异(P>0.05)。同时,2组均未被检测到丁酸。
表3 戊糖片球菌对苜蓿与串叶松香草混贮发酵品质的影响

Table 3 Effects of Pediococcus pentosaceus on fermentation quality of alfalfa and Silphium perfoliatum mixed silage

项目
Item		 pH 乳酸
LA/% DM		 乙酸
AA/% DM		 丙酸
PA/% DM		 丁酸
BA/% DM		 氨态氮/总氮
NH3-N/TN/%
CK组 CK group 5.09±0.02a 2.72±0.11b 1.07±0.12 0.95±0.01a ND 3.55±0.71a
PP组 PP group 4.56±0.04b 3.37±0.09a 1.02±0.03 0.51±0.00b ND 3.18±0.29b
P值 P-value 0.029 0.004 0.830 <0.001 0.048

ND表示未检测到。

ND indicated not detected.

2.3 戊糖片球菌对苜蓿与串叶松香草混贮微生物群落的影响

2.3.1 alpha多样性

由表4可知,alpha多样性分析结果表明,串叶松香草原料微生物群落ACE指数、Chao指数和Sobs指数显著高于苜蓿原料及CK组和PP组苜蓿与串叶松香草混合青贮(P<0.05),串叶松香草原料和CK组苜蓿与串叶松香草混贮微生物群落Shannon指数显著高于苜蓿原料(P<0.05)。与CK组相比,PP组苜蓿与串叶松香草混贮微生物群落ACE指数、Chao指数和Sobs指数显著降低(P<0.05),Shannon指数有所降低,但差异不显著(P>0.05)。2种原料和2组混贮间微生物群Simpson指数和Coverage指数无显著差异(P>0.05)。结果表明,串叶松香草原料微生物群落物种丰富度和多样性较高,添加戊糖片球菌会降低苜蓿与串叶松香草混贮微生物群落物种丰富度和多样性。
表4 戊糖片球菌对苜蓿与串叶松香草混贮微生物群落alpha多样性的影响

Table 4 Effects of Pediococcus pentosaceus on microbiota alpha diversity of alfalfa and Silphium perfoliatum mixed silage

项目
Items		 ACE指数
ACE index		 Chao指数
Chao index		 Shannon指数
Shannon index		 Simpson指数
Simpson index		 Coverage指数
Coverage index		 Sobs指数
Sobs index
苜蓿 Alfalfa 40.33±2.96c 40.33±2.96c 1.20±0.13b 0.25±0.03 1.00±0.00 40.33±2.96c
串叶松香草
Silphium perfoliatum		 106.39±6.13a 106.33±6.17a 2.38±0.23a 0.24±0.04 1.00±0.00 106.33±6.17a
CK组 CK group 82.33±8.17b 82.33±8.17b 1.93±0.18a 0.29±0.05 1.00±0.00 82.33±8.17b
PP组 PP group 29.76±2.90c 29.67±2.91c 1.34±0.04ab 0.38±0.01 1.00±0.00 29.67±2.91c
P值 P-value <0.001 <0.001 0.034 0.213 0.654 <0.001

2.3.2 beta多样性

如图1所示,在beta多样性分析中,主坐标分析(PCoA)结果显示,苜蓿和串叶松香草原料与苜蓿与串叶松香草混贮间微生物群落存在明显分离,表明菌群结构存在显著差异(P<0.05);CK组和PP组间样本存在重叠,距离较近,表明菌群结构相似。
图1 戊糖片球菌对苜蓿与串叶松香草混贮微生物群落beta多样性的影响

Fig.1 Effects of Pediococcus pentosaceus on microbiota beta diversity of alfalfa and Silphium perfoliatum mixed silage

2.3.3 微生物群落组成

如图2所示,苜蓿和串叶松香草原料及其混贮微生物群落共发现82个操作分类单元(OTU),其中串叶松香草原料与CK组混贮共有OTU最多,为23个,占总数的28.05%;串叶松香草原料独有OTU最多,为14个,占总数的17.07%;PP组混贮独有OTU最少,仅为1个。
图2 苜蓿和串叶松香草原料及其混贮微生物群落操作分类单元韦恩图

Fig.2 Venn diagram of OTU in microbiota of alfalfa and Silphium perfoliatum raw materials and their mixed silage

如图3-A所示,在门水平上,苜蓿和串叶松香草原料及其混贮微生物群落中均以芽孢杆菌门(Bacillota)为优势菌门,其在苜蓿原料和PP组混贮中的相对丰度分别达到了99.02%和97.90%;串叶松香草原料和CK组混贮微生物群落中出现了较多的假单胞菌门(Pseudomonadota),串叶松香草原料中还出现了4.59%的放线菌门(Actinomycetota)。
图3 苜蓿和串叶松香草原料及其混贮微生物群落在门(A)和属(B)水平上的组成

Fig.3 Microbiota composition of alfalfa and Silphium perfoliatum raw materials and their mixed silage at phylum (A) and genus (B) levels

如图3-B所示,在属水平上,苜蓿和串叶松香草原料及其混贮微生物群落中以乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)为优势菌属,除在串叶松香草原料外,其在苜蓿原料及混贮中的相对丰度均大于50%。CK组和PP组菌群组成较为相似,以乳植杆菌属和片球菌属(Pediococcus)为主导,同时均观察到慢生乳杆菌属(Lentilactobacillus)的存在;不同的是,CK组菌群组成更为复杂,还存在相对丰度较高的肠球菌属(Enterococcus)、未分类肠杆菌科(unclassified_f_Enterobacteriaceae)、魏斯氏菌属(Weissella)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)。串叶松香草原料与PP组混贮菌群组成有些相似,但前者鞘氨醇单胞菌属相对丰度偏高;苜蓿原料菌群组成较为特殊,有着其他组无法观察到的梭菌属(Clostridium)和未分类毛螺菌科(unclassified_f_Lachnospiraceae)。
如图4所示,从相对丰度来看,苜蓿原料微生物群落中持续型(54.21%)和间歇型(41.96%)为优势类群,暂存型相对丰度仅为3.83%;串叶松香草原料以间歇型(47.85%)为核心类群,持续型相对丰度(46.91%)接近,暂存型相对丰度低至5.24%;PP组混贮中持续型相对丰度最高(66.38%),间歇型(32.99%)和暂存型(0.63%)相对丰度偏低;CK组混贮中持续型相对丰度为55.73%,间歇型次之(40.13%),暂存型相对丰度为4.14%。从数量来看,苜蓿原料微生物群落中暂存型占比达50.41%,间歇型(35.54%)和持续型(14.05%)占比较低;串叶松香草原料以间歇型(49.22%)为优势类群,暂存型次之(45.45%),持续型仅占5.33%;PP组混贮中间歇型占比最高(55.06%),暂存型和持续型各占25.84%和19.10%;CK组混贮中暂存型占比高达61.54%,间歇型次之(31.98%),持续型占比仅为6.48%。
图4 苜蓿和串叶松香草原料及其混贮微生物群落类型分布堆叠图

Fig.4 Stacking diagram of microbiota type distribution of alfalfa and Silphium perfoliatum raw materials and their mixed silage

3 讨论

3.1 戊糖片球菌对苜蓿与串叶松香草混贮发酵品质的影响

优质青贮饲料的制作依赖于一系列理想的物理化学参数,包括适宜的水分含量(通常为65%~70%)、紧密的压实密度(>700 kg/m3鲜重)等[26],然而,在实际生产中,原料特性往往难以完全契合上述理想标准。本试验所用的苜蓿和串叶松香草原料,经晾晒后虽已调整水分含量,但其固有的低含量WSC和高缓冲能特性,对启动发酵有着先天限制。这种“非标准”的原料背景,使得探究外源微生物干预策略变得尤为重要。pH是评价青贮饲料发酵品质的关键量化指标,其数值高低直接反映发酵过程的稳定性和产物优劣;学界普遍认为,达到优质标准的青贮饲料,其pH通常需控制在3.8~4.2[26-27]。本试验中,2组混贮均未达到此标准,这主要来自原料固有的“低WSC+高缓冲能”的双重制约。这一制约因素具有普遍性,即便在单贮条件下也难以克服。例如,有研究表明,苜蓿单贮56 d时pH仍高达5.0[28];串叶松香草单贮60 d时pH也维持在4.6~4.8[29]。这从侧面印证了以这类原料为基础的青贮(包括本试验的混合青贮),其发酵进程和最终pH确实会受限于原料本身的特性。戊糖片球菌作为一种同型发酵乳酸菌,能够通过代谢途径将青贮原料中的WSC(主要是葡萄糖等单糖)高效转化为乳酸。乳酸作为一种有机酸,在青贮料的水相中会解离释放出氢离子(H+)。这些氢离子直接导致青贮饲料整体pH迅速下降[30],因此PP组pH显著低于CK组,且乳酸含量显著高于CK组。戊糖片球菌将葡萄糖转化为乳酸,使pH随之下降,从而抑制丙酸菌活性[31],造成PP组丙酸含量显著低于CK组。丁酸在青贮饲料中通常被视为一个“麻烦制造者”,当它大量出现时,往往意味着青贮发酵出了问题,会直接导致饲料品质下降[32]。本试验中,2组均未检测到丁酸,说明发酵效果较为理想。戊糖片球菌通过快速产酸降低pH、竞争营养与空间、调控氮代谢途径以及直接抑制腐败菌酶活性等多重机制,显著减少了苜蓿与串叶松香草混贮过程中蛋白质的分解,从而降低NH3-N含量[33],因此PP组NH3-N含量显著低于CK组。
串叶松香草鲜草因植株多汁、水分含量高,DM含量普遍更低[34]。本研究中,PP组混贮与苜蓿原料CP含量较为接近,且显著高于CK组,这可能由2方面原因导致:一方面,串叶松香草本身具有较高的CP含量潜力[27,35];另一方面,经过戊糖片球菌处理后通过其快速生长和产酸,抑制了分解蛋白质的腐败菌,减少了因腐败菌活动造成的蛋白质降解和流失,从而共同维持了较高的CP含量[36]。而CK组混贮与串叶松香草原料CP含量相近,这进一步印证原料(串叶松香草)自身蛋白质潜力需配合适宜处理(如脱水、添加保护剂)才能充分体现,否则易因水分或微生物作用导致蛋白质损失。PP组EE含量显著高于CK组,这是因为戊糖片球菌通过抑制脂肪分解酶活性、竞争抑制腐败微生物以及促进脂肪合成代谢三重机制,有效减少了苜蓿与串叶松香草混贮过程中的脂肪损失[37-38]。在青贮发酵过程中,无论是自然发酵还是添加戊糖片球菌,微生物(主要是乳酸菌)确实会利用WSC作为其生长和代谢的主要能源,从而导致青贮中WSC含量的下降。研究表明,戊糖片球菌添加组碳水化合物代谢功能丰度最高,糖→乳酸通量上调2.1倍,与WSC含量下降同步[39-40]。乳酸菌(含戊糖片球菌)在60 d内仅水解可溶性多糖(WSC→乳酸),对纤维素、半纤维素、木质素的降解率<2%,不足以引起化学分析层面的显著变化,这在多项研究中[18,41]得到证实。

3.2 戊糖片球菌对苜蓿与串叶松香草混贮微生物群落的影响

3.2.1 戊糖片球菌对苜蓿与串叶松香草混贮微生物群落多样性的影响

alpha多样性是衡量微生物群落结构的核心维度,其中ACE指数、Chao指数和Sobs指数聚焦群落物种丰富度(即群落中微生物物种的总数),Shannon指数综合反映物种丰富度和均匀度(物种分布的均衡性),Simpson指数侧重体现群落优势度(优势物种的主导程度),Coverage指数则表征测序深度对群落的覆盖程度[42]。本试验中,ACE指数、Chao指数和Sobs指数呈现完全一致的数值与变化趋势,表明这3个指标对微生物群落丰富度的表征具有高度一致性,进一步验证了数据的可靠性。串叶松香草原料微生物群落ACE指数、Chao指数、Sobs指数和Shannon指数均最高,PP组较低,苜蓿原料提升有限且与PP组相比无显著差异;各处理Coverage指数均达1.00,表明测序无遗漏;PP组Simpson指数最高,与Shannon指数结果互补验证优势度差异[43]。
PCoA中主坐标1(PC1)和主坐标2(PC2)累计解释了约68.07%的群落组成差异,且各处理样本聚类紧凑、重复性稳定,这与β多样性研究中“功能性添加剂组群落聚类分离”的普遍规律一致,说明添加剂对菌群的影响具有稳定性[44]。作为发酵促进剂,戊糖片球菌添加组(PP组)样本点与CK组在PCoA空间中距离较近,表明其微生物组成相似。这与alpha多样性分析结果(丰富度降低但Shannon指数无显著差异)相呼应,表明戊糖片球菌作为常用青贮添加剂,其作用核心是强化如乳酸菌等优势发酵菌群的主导地位,而非重塑整个群落结构[45]。这一现象与已有研究中添加剂通过竞争快速主导发酵的结论[46]相符。相比之下,苜蓿和串叶松香草原料则各有自己的群落结构,在PCoA图上表现为明显的分离。

3.2.2 戊糖片球菌对苜蓿与串叶松香草混贮微生物群落组成的影响

本试验中,基于OTU的韦恩图进一步揭示了不同处理对微生物群落组成的差异化影响。将苜蓿和串叶松香草单原料分别与混贮对比,原料与混贮共有OTU仅为0,且单原料特有OTU分别为4(苜蓿)和14个(串叶松香草),说明单原料与混贮的菌群组成本身差异极大,群落特异性由原料组合方式主导[47]。单独对比混合青贮的CK组和PP组,两者共有OTU为24个,但CK组特有OTU为10个,PP组特有OTU仅为1个,结合核心共有OTU的占比变化,说明添加剂处理进一步改变了混合青贮体系的物种特异性,仅少量核心微生物不受处理方式的影响,这与青贮体系中“核心菌群相对稳定、特有菌群受环境/添加剂驱动”的研究规律[46]一致。本研究中,PP组特有OTU极少,这表明戊糖片球菌作为外源发酵促进剂,其主要功能并非引入新的微生物类群,而在于快速定植并富集为优势菌,通过强化同型乳酸发酵来主导发酵方向[48]。
在门水平上,所有处理的菌群均以芽孢杆菌门(旧称厚壁菌门)为主导,这符合青贮体系中乳酸菌作为核心发酵菌群的普遍规律[49]。然而,不同处理间优势菌门的相对丰度存在分化:苜蓿原料和PP组混贮芽孢杆菌门相对丰度接近100%,这与前人研究中乳酸菌添加剂会进一步富集厚壁菌门的结论[50]一致。值得注意的是,串叶松香草原料中除芽孢杆菌门外,还保留了相当比例的假单胞菌门和放线菌门(合计>26.78%),这与其alpha多样性最高的结果相呼应。这一现象可能源于不同植物原料自身对其附着微生物群落具有强烈的选择和塑造作用[51],使得串叶松香草作为独特原料,其在保留核心菌群的同时,也维持了更多样化的环境相关细菌类群。属水平分析揭示了不同处理的菌群功能差异。乳植杆菌属是各处理的优势菌属,但其在串叶松香草原料中的相对丰度(<50%)低于其他处理(>50%),这与戊糖片球菌作为发酵剂强化乳酸菌优势的作用一致[52]。PP组与CK组菌属组成高度相似(均以乳植杆菌属、片球菌属为主),印证了二者菌群相似。CK组含有肠球菌属等杂菌,这解释了其Shannon指数略高的原因。串叶松香草原料除核心乳植杆菌属外,鞘氨醇单胞菌属等非优势菌相对丰度更高,与其“丰富度高、均匀度高”的α多样性特征相符。苜蓿原料出现了特有的梭菌属,这可能与其原料组分有关,串叶松香草可能含有黄酮类、酚酸类等次生代谢物,这些化合物本身就可能对梭菌等微生物有抑制作用[53],而加入串叶松香草后,混合原料的理化特性被重塑,创造了一个更利于乳酸菌、极度不利于梭菌的全新生态位。有研究指出,戊糖片球菌等菌种与梭菌存在显著的负相关关系,具有靶向抑制效果[54]。
在菌群类型中,暂存型作为“启动者与消耗者”,在发酵初期(好氧阶段)活跃,能够快速消耗残留氧气和部分糖分,为厌氧环境创造条件;但也可能因过度消耗资源或产生不良代谢物,为后续发酵埋下隐患,其快速响应、快速更替的特性是初期群落剧烈波动的体现[55]。间歇型更像“机会主义者与扰动者”,在资源波动或条件改变(如pH阶段性变化、开窖取料导致的有氧暴露)时出现,它们的存在反映了发酵体系的不稳定性,可能与发酵中期菌群竞争或后期有氧腐败的启动有关[56]。而持续型则是“主导者与稳定器”,在厌氧发酵稳定阶段占据绝对优势,是决定最终发酵品质的核心功能菌群;它们高效产酸,快速降低并维持低pH环境,抑制有害菌,是青贮成功保存的关键[57]。PP组持续型微生物的高相对丰度,与发酵指标呈现明显的协同适配性,持续型微生物的长期定植与代谢活性,推动了乳酸的高效积累(3.37% DM),同时抑制了丙酸的生成(0.51% DM),最终使pH降至4.56,这一结果反映持续型微生物更偏向乳酸主导的稳定发酵路径,可通过持续的代谢活动维持低pH环境,减少有害微生物(如产丙酸、产氨微生物)的增殖,提升发酵体系的安全性[58]。而CK组是间歇型微生物主导的格局,对应的发酵过程呈现“非定向性”,其乳酸积累不足(2.72% DM)、丙酸含量偏高,同时NH3-N含量更高,本质是间歇型微生物的“脉冲式代谢”难以维持稳定的发酵环境,导致杂菌代谢(产丙酸、产氨)更活跃,发酵质量的可控性更弱[59]。苜蓿原料的核心特性在于其高蛋白质含量伴随的高缓冲能,以及相对均衡但绝对含量不足的WSC,其均衡的养分也为建立复杂的微生物互作提供了物质基础。在理想情况下,苜蓿可能支持“快速启动型”与“长期稳定型”微生物的更替和协作,即初期利用易利用碳源的菌群快速启动产酸,后期由能分解纤维等复杂物质的菌群维持酸度和稳定性,从而实现“快速启动与长期保鲜”的潜力;但这种潜力的实现高度依赖于外源干预以克服其固有缺陷。串叶松香草在结实期常表现为“蛋白质低、纤维高、糖少”的特点;此外,其含有的黄酮类、酚酸类等次生代谢物可能构成化学防御层。低WSC含量限制了乳酸发酵的底物总量,而高纤维含量意味着不易利用的碳源占主导。这种底物结构可能导致发酵中后期易利用资源的耗竭,使得依赖快速增殖的乳酸菌群代谢停滞,从而为能利用乳酸、纤维或蛋白质的杂菌(如某些丙酸菌、腐败菌)提供中后期的生态位,增加发酵品质波动的风险。
综合来看,在未添加外源菌剂的条件下,苜蓿与串叶松香草混贮(CK组)发酵不充分,最终pH为5.09,乳酸积累不足(2.72% DM),且NH3-N含量较高(3.55%),表明其发酵品质不佳,蛋白质保存效果不理想。添加戊糖片球菌(PP组)显著改善了发酵品质,与CK组相比,PP组pH显著降低至4.56,乳酸含量显著提高了23.90%(3.37% DM),同时丙酸(降低46.32%)和NH3-N含量(降低10.42%)显著降低。这表明,在该特定原料体系中,戊糖片球菌通过强化同型乳酸发酵,有效引导了发酵方向。微生物群落分析表明,戊糖片球菌的主要作用是强化乳植杆菌属等优势乳酸菌群,并抑制梭菌等有害菌的增殖,这与其改善发酵品质的结果相互印证。不过,尽管添加戊糖片球菌改善了多项指标,但由于原料固有的低WSC和高缓冲能的限制,所有处理的最终pH均未达到优质青贮(pH<4.2)的标准。这突显了从原料管理(如刈割期)或补充可发酵底物层面进行综合调控的必要性。

4 结论

综上所述,在本试验设定的高缓冲能、低WSC原料条件下,添加戊糖片球菌是一种有效的微生物调控策略,可显著改善苜蓿与串叶松香草混贮的发酵品质,提高乳酸产量并减少蛋白质降解。然而,要实现优质青贮,仍需结合原料预处理或其他综合措施。

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