动物营养学报 >

2026 , Vol. 38 >Issue 9: 7078 - 7089

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.564

研究论文

肉牛瘤胃源热带假丝酵母GRJA011的分离、鉴定及其体外益生特性评价

  • 刘倩 , 1, 2 ,
  • 孙庆余 1 ,
  • 邓瑞鹏 3 ,
  • 朴国瑞 3 ,
  • 贺树亮 1, 2 ,
  • 钟荣珍 , 1, 4, *
展开
  • 1 中国科学院东北地理与农业生态研究所, 吉林省饲料加工与草食家畜精准饲养跨区域合作科技创新中心, 长春 130102
  • 2 中国科学院大学, 北京 100049
  • 3 东丰县畜牧业发展促进中心, 辽源 136300
  • 4 吉林格润佳生物科技有限公司, 长春 130000
* 钟荣珍,研究员,博士生导师,E-mail:

刘 倩(1996—),女,河北保定人,博士研究生,研究方向为反刍家畜胃肠道微生态及益生菌调控。E-mail:

Office editor: 菅景颖

收稿日期: 2026-01-30

  网络出版日期: 2026-09-12

基金资助

国家重点研发计划子课题(2024YFD130110503)

长春市科技发展计划项目(24GXYSZZ11)

吉林省与中国科学院科技合作高新技术产业化专项(2025SYHZ0017)

收起

Isolation, Identification and in Vitro Probiotic Characterization of Rumen-Derived Candida tropicalis GRJA011 from Beef Cattle

  • LIU Qian , 1, 2 ,
  • SUN Qingyu 1 ,
  • DENG Ruipeng 3 ,
  • PU Guorui 3 ,
  • HE Shuliang 1, 2 ,
  • ZHONG Rongzhen , 1, 4, *
Expand
  • 1 Jilin Province Feed Processing and Ruminant Precision Breeding Cross Regional Cooperation Technology Innovation Center, Northeast Institute of Geography and Agroecology, Chinese Academy of Sciences, Changchun 130102, China
  • 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
  • 3 Dongfeng County Animal Husbandry Development Promotion Center, Liaoyuan 136300, China
  • 4 Jilin Green+ Biotechnology Co., Ltd., Changchun 130000, China
* professor, E-mail:

Received date: 2026-01-30

  Online published: 2026-09-12

Fold

摘要

为筛选适用于反刍家畜的天然原籍益生菌,本试验以西门塔尔×海福特杂交肉牛瘤胃液为样本,利用YPD培养基分离纯化酵母菌株,结合菌落形态、美兰染色及26S rDNA序列分析进行种属鉴定,并测定其生长曲线、酸与胆盐耐受性、人工胃液和人工肠液耐受性、表面疏水性、自凝聚能力及对12种抗生素的敏感性。结果显示:从肉牛瘤胃液中分离得到1株酵母菌,命名为GRJA011,经鉴定为热带假丝酵母(Candida tropicalis)。该菌株的最适生长条件为28 ℃、pH 6.0;在pH≥5.0时生长良好,pH≤2.0时生长被完全抑制;在0.1%~0.6%胆盐浓度下24 h相对生长率均高于初始值(100%);经人工胃液与人工肠液处理3 h后存活率分别为34.42%和37.52%;表面疏水率和自凝聚率分别为86.84%和85.65%。该菌株对氯霉素、四环素、庆大霉素、头孢哌酮等4种抗生素敏感,对红霉素、万古霉素、克林霉素、头孢拉定、阿奇霉素、青霉素、氨苄西林等7种常用抗生素具有耐药性。非靶向代谢组学分析显示该菌株代谢物在ATP结合盒(ABC)转运蛋白、次生代谢物生物合成、甘油磷脂代谢等通路中显著富集。综上可知,瘤胃源热带假丝酵母GRJA011具有一定的胃肠液耐受性、胆盐适应性及黏附定植能力,可作为反刍动物益生菌候选菌株进行后续研究。

关键词： 瘤胃源热带假丝酵母; 体外益生特性; 非靶向代谢组学分析

本文引用格式

刘倩 , 孙庆余 , 邓瑞鹏 , 朴国瑞 , 贺树亮 , 钟荣珍 . 肉牛瘤胃源热带假丝酵母GRJA011的分离、鉴定及其体外益生特性评价[J]. 动物营养学报, 2026 , 38(9) : 7078 -7089 . DOI: 10.12418/CJAN2026.564

Abstract

To screen for natural autochthonous probiotics suitable for ruminants, this study used rumen fluid from Simmental×Hereford crossbred beef cattle as the sample source. Yeast strains were isolated and purified using YPD medium, and species identification was performed through colony morphology, methylene blue staining and 26S rDNA sequence analysis. The probiotic properties were evaluated by determining the growth curve, acid and bile salt tolerance, tolerance to artificial gastric fluid and artificial intestinal fluid, surface hydrophobicity, auto-aggregation ability, and susceptibility to 12 antibiotics. The results showed that one yeast strain, designated GRJA011, was isolated from the rumen fluid of beef cattle and identified as Candida tropicalis. The optimal growth conditions for this strain were 28 ℃ and pH 6.0. It grew well at pH≥5.0, while growth was completely inhibited at pH≤2.0. After being cultured for 24 hours at bile salt concentrations ranging from 0.1% to 0.6%, the relative growth rate of the strain GRJA011 was higher than the initial value (100%). After 3 h of exposure to artificial gastric fluid or artificial intestinal fluid, the survival rates were 34.42% and 37.52%, respectively. The surface hydrophobicity rate and self-coagulation rate were 86.84% and 85.65%, respectively. This strain was susceptible to four antibiotics (chloramphenicol, tetracycline, gentamicin and cefoperazone) and resistant to seven commonly used antibiotics (erythromycin, vancomycin, clindamycin, cefradine, azithromycin, penicillin and ampicillin). Untargeted metabolomics analysis revealed that the metabolites of this strain were significantly enriched in pathways such as ATP-binding cassette (ABC) transporters, biosynthesis of secondary metabolites, and glycerophospholipid metabolism. In conclusion, the rumen-derived Candida tropicalis GRJA011 exhibits moderate gastrointestinal fluid tolerance, bile salt adaptability, and adhesion and colonization potential, making it a promising probiotic candidate for further research in ruminants.

Key words： rumen-derived Candida tropicalis; in vitro probiotic characteristics; untargeted metabolomics analysis

在全球“减抗、限抗”趋势及我国全面实施饲料“禁抗”、养殖“减抗”的政策背景下,开发安全、高效、绿色的抗生素替代品已成为保障畜牧业健康可持续发展的迫切需求。我国是畜牧大国,畜牧业总产值占全国农业总产值的25%以上,是重要支柱产业[1]。微生态制剂作为饲用抗生素重要的替代方案之一,其研发与应用响应了《遏制微生物耐药国家行动计划(2022—2025年)》[2]的号召。然而,适用于反刍动物且具有高效定植和功能稳定的“原籍菌”资源严重匮乏,制约了产业的发展。
目前应用于反刍动物的益生菌研究多集中于乳酸菌和酵母菌等传统种属。然而,由于反刍动物瘤胃及后段肠道微环境复杂,存在高温、pH波动、高浓度挥发性脂肪酸、胆盐与多种消化酶等多重胁迫,且伴随复杂的微生物竞争,外源菌株常因适应性不足导致存活率低、定植能力差及功能不稳定[3-6],成为制约其在反刍动物中应用效果的关键瓶颈。因此,从反刍动物胃肠道中分离天然适应的“原籍菌”或“土著菌”,利用其固有的环境适应性和定植优势,已成为突破上述瓶颈、开发高效微生态制剂的重要研究方向[7-8]。
热带假丝酵母(Candida tropicalis)在工业生物技术和环境修复中表现出较强的逆境耐受能力[9],其在耐酸、耐胆盐及胃肠道环境适应方面具有显著优势[10-11]。但与酿酒酵母相比,热带假丝酵母在细胞壁结构、代谢途径和应激反应机制等方面存在显著差异[12],其在反刍动物益生菌领域的系统研究仍相对有限,尤其是针对瘤胃源菌株的全面益生特性评价与机制解析尚未充分展开。
基于此,本研究旨在从健康反刍动物瘤胃液中分离筛选具有益生潜力的热带假丝酵母,并系统评价其体外关键益生特性,同时结合非靶向代谢组学技术解析其益生机制,以期为开发适用于反刍动物的新型益生菌制剂提供菌种资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品与试剂

本试验经中国科学院东北地理与农业生态研究所实验动物福利伦理委员会审核通过(审批号:202407-02)。瘤胃液样品采集自吉林省长春市公主岭市吉林省农业科技示范园(43°29'42″N,124°47'37″E)内处于育肥期的健康成年西门塔尔×海福特杂交肉牛,通过口腔插管法进行无菌采集,采集后立即用4层无菌医用纱布过滤,收集滤液备用。
蛋白胨、酵母粉、葡萄糖等培养基组分购自北京奥博星生物技术有限责任公司;胆盐购自北京索莱宝科技有限公司;抗生素药敏纸片购自湖南比克曼生物科技有限公司。

1.1.2 仪器设备

试验所用主要仪器设备:高速台式离心机(DHS-NX-3R型,北京鼎昊源科技有限公司)、生物显微镜(BM2000型,宁波永兴光学仪器有限公司)、pH计(PHS-3E型,上海雷磁仪器有限公司)、超净工作台(CBV45S型,北京尚方京工科技有限公司)、恒温振荡培养箱[XS-ZDIA型,象尚昱科(上海)实验仪器有限公司]、生化培养箱(LC-SPX-70B型,上海力辰仪器科技有限公司)、高压灭菌器(DXL-100型,山东德祥仪器有限公司)、全波长酶联免疫分析仪(UResder Eyes Ⅰ型,杭州优米仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离与鉴定

分离纯化:将瘤胃滤液进行10倍系列梯度,分别选取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度的稀释液各100 μL,均匀涂布于YPD固体培养基,置于28 ℃恒温培养箱培养48~72 h。待菌落长出后,通过反复划线对单菌落进行纯化,对纯化后单克隆菌落进行形态学观察,通过美兰染色在显微镜下对其细胞形态进行观察。
分子鉴定:使用真菌基因组DNA快速提取试剂盒提取基因组DNA。以引物NL1和NL4(NL1:5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’和NL4:5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)扩增26S rDNA区域。采用25 μL体系进行PCR扩增,其中含有12.5 μL 2×Premix Taq、1 μL上游引物、1 μL下游引物、1 μL基因组DNA,余量用ddH2O补充。反应程序如下:95 ℃起始变性5 min;继以30个循环(94 ℃变性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s);72 ℃延伸持续10 min。扩增产物经生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序,所得序列通过NCBI数据库进行BLAST同源性比对。
菌种保藏:菌株GRJA011已于2025年3月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC No: M 2025452。

1.2.2 生长曲线与耐受特性测定

生长曲线与产酸性能:取活化后的菌株,按2%(v/v)的接种量接入YPD液体培养基,置于28 ℃恒温培养箱中静置培养48 h。培养期间,每间隔2 h定期取样1次,测定菌液在600 nm处的吸光度(OD600)值和pH。每个培养时间点设置3个平行,以各培养时间点OD600的平均值绘制生长曲线,以各培养时间点pH的平均值绘制产酸曲线。
最适温度和pH:将活化后的菌株以2%(v/v)的接种量接种于YPD液体培养基,分别在不同温度(25、28、30、37、40、45、55 ℃)和培养基不同初始pH(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0)条件培养,于0~48 h定期取样测定OD600值。每个培养时间点设置3个平行,根据各培养时间点OD600的平均值绘制菌株在不同温度和不同pH条件下的生长曲线。
胆盐耐受性:分别配制胆盐终浓度为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的YPD液体培养基。将活化的菌株以2%(v/v)的接种量分别接种于上述培养基,28 ℃恒温静置培养。培养全程采用带密封盖的试管,以模拟肠道内微氧环境并减少氧扩散。分别于接种后0、6、12、24 h时测定菌液的OD600值,计算菌株的相对生长率,计算公式为:
相对生长率(%)=100×At/A0。
式中:At为t h时菌液的OD600值;A0为0 h时菌液的OD600值。

1.2.3 人工胃液和人工肠液耐受性测定

人工胃液和人工肠液的配制方法参考《中华人民共和国药典》[13](2020年版)。人工胃液为含3.5 g/L胃蛋白酶(3 000~3 500 U/g)、pH 3.0的盐酸溶液;人工肠液为含1.0 g/L胰蛋白酶(≥50 000 U/g)、pH 8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)。取活化后的菌液,离心后收集菌体沉淀,用等体积生理盐水重悬。取1 mL菌悬液,加入10 mL经0.2 μm无菌滤膜过滤处理后的人工胃液或人工肠液,28 ℃静置孵育。孵育过程中使用带密封盖的试管,以模拟肠道内微氧环境并减少氧扩散。分别于0、3 h时取样,梯度稀释后于YPD平板上均匀涂布进行活菌计数。菌株的存活率依据孵育0 h的初始活菌进行计算,计算公式为:
存活率(%)=100×(人工胃液或人工肠液孵育后活菌数)/(人工胃液或人工肠液孵育前活菌数)。

1.2.4 黏附特性测定

表面疏水性:菌体经PBS洗涤3次后,重悬调整至OD600值为0.25±0.05(A初始),得到初始悬液。取3 mL初始悬液与等量二甲苯混合,涡旋振荡3 min,随后于28 ℃静置1 h,待溶液分层后测定其OD600值(A孵育后)。上述操作独立重复测定3次。表面疏水率计算公式为:
表面疏水率(%)=[(A初始-A孵育后)/A初始]×100。
自凝聚能力:取2 mL经PBS洗涤后的菌悬液,涡旋混匀后测定OD600值(A初始),28 ℃静置孵育2 h后吸取上清液测定OD600值(A孵育后)。上述操作独立重复测定3次。自凝聚率计算公式为:
自凝聚率(%)=[(A初始-A孵育后)/A初始]×100。

1.2.5 抗生素敏感性测定

为确保评估的针对性,本研究选取了12种反刍动物临床常用抗生素进行测试,包括β-内酰胺类(青霉素、氨苄西林、头孢拉定、头孢哌酮)、大环内酯类(红霉素、阿奇霉素)、四环素类(四环素)、氯霉素类(氯霉素)、氨基糖苷类(庆大霉素、万古霉素)、氟喹诺酮类(环丙沙星)、林可胺类(克林霉素)等类别。采用纸片扩散法(Kirby-Bauer法),将活化后的菌液(菌体浓度调整至108 CFU/mL)200 μL均匀涂布于YPD固体培养基,使用无菌镊将相应药敏片紧贴于干燥后的平板表面。28 ℃培养箱中过夜培养后使用游标卡尺测量抑菌圈直径。参照世界卫生组织(WHO)推荐的美国临床和实验室标准协会(CLSI)标准进行试验,抑菌圈直径判断标准参见本课题组前期发表文章[14]。

1.2.6 非靶向代谢组学分析

代谢物提取:设置6个生物学重复(n=6),分别独立培养并取样。吸取100 μL菌液与400 μL冰甲醇混匀,于-20 ℃冰箱静置0.5 h进行蛋白质沉淀,然后4 ℃、20 000×g离心10 min,吸取上清液待测,同时每个样品等量取出一定体积混合成质控(QC)样品。
本研究的非靶向代谢组学分析及数据处理方法完全参照文献[14]进行,具体的色谱、质谱参数及数据处理与分析方法参见该文献。

1.3 数据统计分析

各项试验均独立重复至少3次。益生特性相关数据经Excel 2019整理后,采用GraphPad Prism 8进行统计和作图,结果以“平均值±标准差”表示。代谢组学数据采用R软件(version 4.0)进行统计分析。图形绘制通过联川生物云平台的云工具(https://www.omicstudio.cn/tool)完成。

2 结果与分析

2.1 菌株GRJA011的分离与鉴定

利用YPD固体培养基从健康成年西门塔尔×海福特杂交牛的瘤胃液中分离到1株酵母菌,命名为GRJA011。菌株GRJA011在YPD培养基上呈现为乳白色、圆形、凸起、表面光滑、边缘整齐的菌落,散发轻微发酵气味(图1-A);菌株GRJA011的细胞形态呈球形或卵圆形(图1-B);利用真菌26S rDNA通用引物进行PCR扩增和测序后,通过NCBI数据库与标准菌株序列进行同源性比对,发现菌株GRJA011与登录号为ON113916.1和OQ592782.1的热带假丝酵母的基因序列同源性最高,相似度达100%(图1-C)。结合菌株形态、细胞形态及26S rDNA序列分析结果,鉴定该分离菌株GRJA011为热带假丝酵母。
图1 菌株GRJA011的菌落(A)、细胞形态(100×,B)及系统发育进化树(C)

Candida tropicalis:热带假丝酵母;Candida sojae:大豆假丝酵母;Candida sanyaensis:三亚假丝酵母;Candida frijolesensis:弗里霍莱斯假丝酵母;Candida neerlandica:尼氏假丝酵母;Candida viswanathii:维斯假丝酵母;Candida maltosa:麦芽糖假丝酵母;Candida dubliniensis:都柏林念珠菌;Candida africana:非洲假丝酵母;Candida albicans:白假丝酵母菌;Aspergillus niger:黑曲霉。

Fig.1 Colony (A), cell morphology (100×,B) and phylogenetic tree (C) of strain GRJA011

2.2 菌株GRJA011的生长曲线和产酸曲线

如图2所示,菌株在接种后2 h内生长缓慢,随后进入对数生长期,10~18 h生长速度缓慢升高,36 h达到生长稳定期;培养基pH在菌株接种2 h内下降缓慢,在2~20 h从5.40迅速降至4.84,此后趋于平稳,并于36 h降到最低。上述结果表明,菌株GRJA011在36 h内可达到生长稳定期并伴随明显产酸过程。
图2 菌株GRJA011的生长曲线和产酸曲线

Fig.2 Growth curve and acid-producing curve of strain GRJA011

2.3 菌株GRJA011的体外益生特性

2.3.1 菌株GRJA011不同温度下的生长曲线

如图3所示,菌株GRJA011在28 ℃培养时生长最佳,延滞期约2 h,之后进入对数生长期,其约在44 h达到稳定期,此时OD600值达到最高值;在25、30、37 ℃培养时,菌株GRJA011的延滞期依次延长至4、3和2 h,随后进入对数生长期,但达到稳定期所需时间均较28 ℃更长,且48 h最终OD600值均低于28 ℃;在40 ℃培养时,菌株GRJA011的延滞期缩短至2 h,6 h后进入对数生长期,14 h后生长速率迅速放缓,22 h起出现提前衰亡;在45 ℃培养时,菌株GRJA011的延滞期极短(2 h),6 h后即转入对数生长期,但24 h后生长停滞,48 h OD600值仅为0.508;在55 ℃培养时,菌株GRJA011的生长被完全抑制,全程无增殖,这表明55 ℃已超过其生长耐受极限。综上可知,菌株GRJA011的最适生长温度为28 ℃。
图3 菌株GRJA011不同温度下的生长曲线

Fig.3 Growth curve of strain GRJA011 at different temperatures

2.3.2 菌株GRJA011对酸的耐受性

如图4所示,当培养基pH为6.0时,菌株GRJA011的延滞期最短,进入对数生长期最快,且最终获得的生物量最高;当培养基pH为5.0和7.0时,菌株GRJA011的生长曲线与pH为6.0时相似,但进入对数生长期时间延长,且稳定期OD600值略低;当培养基pH为4.0时,菌株GRJA011的延滞期延长至6 h,随后进入对数生长期,36 h时OD600值达到0.998,表明其对pH为4.0的环境有一定耐受性;当pH为3.0时,菌株GRJA011的延滞期延长至12 h,24 h后生长明显受限,36 h时OD600值仅为0.761,表明pH为3.0的环境对其生长产生了明显的抑制作用;而当pH≤2.0时,菌液的OD600值基本无变化,表明pH≤2.0的环境可完全抑制其生长。综上可知,菌株GRJA011在pH≥5.0的环境中生长状态最佳,对pH为4.0的环境具备一定耐受性,而pH≤3.0的环境则抑制其生长。
图4 菌株GRJA011在不同pH培养基中的生长曲线

Fig.4 Growth curve of strain GRJA011 in culture with different pH

2.3.3 菌株GRJA011对胆盐的耐受性

由图5可知,菌株GRJA011在0.10%~0.60%胆盐胁迫下,24 h相对生长率均高于初始值(100%),表明菌株GRJA011在宽范围胆盐浓度下均能维持较高活性,显示出良好的胆盐耐受性。
图5 菌株GRJA011在不同浓度胆盐中的相对生长率

Fig.5 Relative growth rate of strain GRJA011 in different concentrations of bile salt

2.3.4 菌株GRJA011对人工胃液和人工肠液的耐受性

由表1可知,菌株GRJA011接种于人工胃液和人工肠液3 h后,存活率分别为34.42%和37.52%,对应的活菌数为2.75×105和2.10×105 CFU/mL,表明菌株GRJA011对人工胃液和人工肠液有一定的耐受能力。
表1 菌株GRJA011在人工胃液和人工肠液中的存活率

Table 1 Survival rate of strain GRJA011 in artificial gastric fluid and artificial intestinal fluid

项目
Items		 耐受时间
Tolerance time/h		 活菌数
Viable count/(×105 CFU/mL)		 存活率
Survival rate/%

人工胃液Artificial gastric fluid		 0 8.00±0.29
34.42±1.72
3 2.75±0.07

人工肠液Artificial intestinal fluid		 0 5.67±0.64
37.52±5.69
3 2.10±0.14

2.3.5 菌株GRJA011的表面疏水性及自凝聚能力

由表2可知,菌株GRJA011的表面疏水率和自凝聚率分别为86.84%和85.65%,表明具有较高的表面疏水性和自凝聚能力。
表2 菌株GRJA011的表面疏水率及自凝聚率

Table 2 Surface hydrophobicity rate and self-coagulation rate of strain GRJA011

菌株
Strain		 表面疏水率
Surface hydrophobicity rate		 自凝聚率
Self-coagulation rate
GRJA011 86.84±0.61 85.65±0.97

表面疏水率标准设定:50%以上,高度疏水;20%~50%;中度疏水;20%以下;非疏水。自凝聚能力标准设定:16%~35%,低自凝聚能力;>35%~50%,中等自凝聚能力;50%以上,高自凝聚能力。

The standards for surface hydrophobicity are set as follows: above 50%, highly hydrophobic; 20% to 50%, moderately hydrophobic; below 20%, non-hydrophobic. The standards for self-aggregation ability are set as: 16% to 35%, low self-aggregation ability; >35% to 50%, medium self-aggregation ability; above 50%, high self-aggregation ability.

2.3.6 菌株GRJA011的抗生素敏感性

如表3所示,菌株GRJA011对所选12种抗生素的敏感性存在差异。菌株GRJA011对氯霉素、四环素、庆大霉素、头孢哌酮等4种常见抗生素表现出敏感;对环丙沙星表现出中介;对红霉素、万古霉素、克林霉素、头孢拉定、阿奇霉素、青霉素、氨苄西林等7种常见抗生素表现出耐药。
表3 菌株GRJA011对常见抗生素的敏感性

Table 3 Sensitivity of strain GRJA011 to common antibiotics

抗生素名称
Antibiotics names		 抑菌圈直径
Inhibition zone diameter/mm		 敏感性
Susceptibility
氯霉素Chloramphenicol 21.60±1.67 S
红霉素Erythomycin — R
万古霉素Vancomycin — R
四环素Tetracycline 23.95±0.92 S
克林霉素Clindamycin — R
庆大霉素Gentamycin 25.73±0.62 S
头孢拉定Cefradine — R
阿奇霉素Azithromycin — R
环丙沙星Ciprofloxacin 17.56±1.67 I
青霉素Penicillin — R
氨苄西林Ampicillin — R
头孢哌酮Cefoperazone 25.01±1.02 S

—:无抑菌圈 no inhibition zone;S:敏感 susceptible;I:中介 intermediate;R:耐药 resistant。

2.3.7 菌株GRJA011的代谢特性

2.3.7.1 菌株GRJA011非靶向代谢组学数据质量评价

为了评估整个分析过程中仪器系统的稳定性和数据的可靠性,采用正、负离子模式同时采集,以保证代谢物的覆盖度。数据质量评价结果如图6所示。QC样本总离子流(TIC)曲线均重叠良好(正离子模式:图6-A;负离子模式:图6-B),表明色谱系统在整个数据采集过程中保持高度稳定。进一步的质量控制分析显示,所有检测离子的质荷比(m/z)偏差均小于1 ppm(正离子模式:图6-C;负离子模式:图6-D),证明了质谱仪具有极高的质量精度和校准准确性。同时,代谢物的保留时间(RT)漂移均小于0.1 min(正离子模式:图6-E;负离子模式:图6-F)。上述结果从色谱和质谱2个维度共同证实了本次代谢组学数据可靠。
图6 非靶向代谢组学数据质量评价

Fig.6 Quality evaluation of non-targeted metabolomics data

2.3.7.2 菌株GRJA011代谢物鉴定

本研究共检测到55 374个代谢离子,经注释后共鉴定到Level-1代谢物30 732个,Level-2代谢物847个。KEGG通路注释分析显示,这些代谢物主要参与新陈代谢(metabolism)、生物体系统(organismal systems)、环境信息处理(environmental information processing)和人类疾病(human diseases)等一级功能分类,其中参与新陈代谢通路的代谢物数量最多。在三级通路层面,富集代谢物数量最多的通路包括代谢通路(metabolic pathways)、次生代谢物生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、不同环境中的微生物代谢(microbial metabolism in diverse environments)和ATP结合盒(ABC)转运蛋白(ABC transporters)等(图7)。
图7 基于代谢物数量的前20条代谢通路

Environmental Information Processing:环境信息处理;Genetic Information Processing:遗传信息处理;Human Diseases:人类疾病;Metabolism:新陈代谢;Organismal Systems:生物体系统;ABC transporters:ABC转运蛋白;Neuroactive ligand-receptor interaction:神经活性配体-受体相互作用;Aminoacyl-tRNA biosynthesis:氨酰-tRNA生物合成;Central carbon metabolism in cancer:癌症中的中心碳代谢;Metabolic pathways:代谢通路;Biosynthesis of secondary metabolites:次生代谢物生物合成;Biosynthesis of plant secondary metabolites:植物次生代谢物生物合成;Microbial metabolism in diverse environments:不同环境中的微生物代谢;Biosynthesis of cofactors:辅因子生物合成;Biosynthesis of alkaloids derived from shikimate pathway:源自莽草酸途径的生物碱生物合成;Nucleotide metabolism:核苷酸代谢;Biosynthesis of amino acids:氨基酸生物合成;Purine metabolism:嘌呤代谢;Biosynthesis of alkaloids derived from ornithine, lysine and nicotinic acid:源自鸟氨酸、赖氨酸和烟酸的生物碱生物合成;Biosynthesis of various plant secondary metabolites:各种植物次生代谢物生物合成;Biosynthesis of phenylpropanoids:苯丙烷类生物合成;Secondary bile acid biosynthesis:次生胆汁酸生物合成;Tropane, piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis:莨菪烷、哌啶和吡啶类生物碱生物合成;Bile secretion:胆汁分泌;Protein digestion and absorption:蛋白质消化与吸收。

Fig.7 Top 20 pathways based on number of metabolites

2.3.7.3 关联益生特性的关键代谢通路与产物分析

为深入挖掘菌株GRJA011作为益生酵母的代谢基础,本研究重点分析了与其体外益生表型(胃肠液耐受、黏附定植)密切相关的代谢通路及其中富集的特征性代谢物。如表4所示,菌株GRJA011的代谢物在ABC转运蛋白通路中显著富集了甜菜碱(betaine)、脯氨酸(proline)等相容性溶质,这些物质可通过稳定蛋白质和膜结构增强菌株对渗透压及胆盐胁迫的耐受性;在次生代谢物生物合成通路中富集的亚精胺(spermidine)、酪胺(tyramine)等物质则可通过调控细胞表面电荷与膜流动性,直接参与生物膜形成及菌体聚集过程。在2-氧羧酸代谢(2-oxocarboxylic acid metabolism)通路中检测到琥珀酸(succinic acid)、L-天冬氨酸(L-aspartic acid)等能量中间体;在甘油磷脂代谢(glycerophospholipid metabolism)通路中检测到甘油磷酸胆碱等膜脂成分,可能通过影响膜结构与疏水性间接支持黏附定植。
表4 基于代谢组学的GRJA011菌株关键益生通路分析

Table 4 Analysis of key probiotic pathways in strain GRJA011 based on metabolomics

通路编号
Pathway ID		 通路名称(三级)
Pathway name (level 3)		 代谢物数目
Number of metabolites		 代表性代谢物
Representative metabolites
2010 ABC转运蛋白 17 甜菜碱、脯氨酸、亚精胺等
564 甘油磷脂代谢 5 甘油磷酸胆碱、溶血磷脂酰胆碱(15∶0/0∶0)等
1110 次生代谢物生物合成 54 亚精胺、酪胺、肉桂醛等
1210 2-氧羧酸代谢 8 琥珀酸、L-天冬氨酸等

3 讨论

3.1 菌株GRJA011的体外益生特性与安全性

益生菌的胃肠液耐受性与细胞黏附特性是其发挥益生功能的重要基础。本研究中,菌株GRJA011在梯度浓度胆盐胁迫下仍有较高活性,在人工胃肠液胁迫下仍具有一定的存活率,表明其具备良好的综合胃肠道环境耐受能力,这一综合耐受性表型优于酿酒酵母亚种布拉迪酵母BS-F1和酿酒酵母JM-4等在类似胁迫条件下的表现[15-16]。本研究采用表面疏水性与自凝聚性2项体外指标,初步评估了菌株GRJA011的黏附与定植潜能,结果显示,其表面疏水率和自凝聚率分别高达86.84%和85.65%,表明该菌株具备优异的黏膜与定植潜力。此外,该菌株在37~40 ℃下仍能良好生长,覆盖了反刍动物的体温区间,为其在宿主体内存活和定植提供了有利条件。
益生菌候选株的安全性评估是一个多层次、系统性的过程。本研究首先聚焦于其抗生素敏感性这一关键指标,尽管酵母作为真核生物,对多数作用于原核细胞壁或核糖体的抗生素天然不敏感,但明确其耐药谱对于评估养殖应用中的潜在冲突仍具重要意义。菌株GRJA011对临床常用的12种抗生素表现出较窄的敏感谱,仅对氯霉素、四环素等4种抗生素敏感,而对红霉素、青霉素等7种抗生素耐药。其耐药谱系主要集中于临床上较少用于反刍动物的抗生素(如β-内酰胺类),这在一定程度上降低了其在养殖应用中与临床治疗发生冲突的风险。然而,抗生素敏感性仅是安全性评估的初步环节。本研究作为对瘤胃源热带假丝酵母益生潜力的初步筛选,其安全性仍有待系统验证。后续研究应通过动物试验进一步评估其体内安全性,并需结合全基因组测序深入解析其耐药表型的遗传基础,以确认是否携带可转移的耐药基因,从而全面评估其应用的环境与生态安全性。

3.2 菌株GRJA011益生特性的代谢成因

菌株GRJA011分离自反刍动物瘤胃液,作为兼性厌氧微生物,虽分离自严格厌氧的瘤胃环境,但可通过呼吸与发酵代谢的灵活切换,并可能通过与严格厌氧菌的代谢互作在该生态位中存活[8]。菌株GRJA011可能通过分泌琥珀酸等代谢中间产物或消耗瘤胃内容物中的微量氧气,间接调节瘤胃微生态,从而适应并定植。这种对原位环境的多重适应性,是其区别于外源益生菌,可能实现更稳定功效的核心优势之一。
为从代谢物层面解析上述适应性的物质基础,本研究开展了非靶向代谢组学测定。菌株GRJA011在ABC转运蛋白通路中显著富集的特征性代谢物如甜菜碱和脯氨酸,是已知的相容性溶质,能在高渗及酸胁迫下稳定蛋白质与细胞膜结构,帮助细胞维持稳态[17],这可能是该菌株在人工胃肠液中保持高存活率的重要机制之一。甘油磷脂代谢通路中富集的甘油磷酸胆碱等膜脂成分可能与细胞表面疏水性直接相关[18],从而支持其高黏附与自凝聚能力。次生代谢物生物合成通路中富集的亚精胺、酪胺等物质被证实可通过影响细胞表面电荷和膜流动性直接参与生物膜的形成和菌体聚集过程[19-20],进一步增强了菌株的定植潜力。2-氧羧酸代谢通路中琥珀酸等三羧酸循环中间产物的富集,表明该菌株可能通过调整中心碳代谢流,快速产生ATP,为维持胞内pH稳态提供能量基础[21],这揭示其可作为信号分子参与瘤胃微生态的调节。
这些代谢特征均从代谢物层面初步解释了菌株GRJA011耐受胃肠环境、实现黏附定植的潜在机制,然而,体外表面疏水性与自凝聚性试验仅是黏附潜力的间接表征,其体内真实的定植效率尚待验证。后续可结合转录组学与蛋白质组学分析,进一步阐明这些代谢通路在应激响应与定植过程中的动态调控网络,并在动物模型中验证代谢物与宿主微生物组的互作效应。

3.3 菌株GRJA011代谢物对于宿主健康的潜在益生功能

菌株GRJA011的益生作用可能不仅限于其自身的存活与定植,其丰富代谢物谱还提示其可能通过分泌活性物质间接改善宿主健康。该菌株在2-氧羧酸代谢通路中富集的琥珀酸和L-天冬氨酸等代谢中间体,可作为瘤胃微生物的重要碳源或代谢前体。特别是琥珀酸,作为产丙酸菌的关键底物,其外源性供应可能有助于优化瘤胃发酵模式,提高丙酸生成量,从而为宿主提供更多的生糖前体[22]。菌株产生或代谢相关的甜菜碱和亚精胺等代谢物已被证实具有增强肠道屏障完整性、抗炎及调节免疫反应的功能[17]。这些代谢特征表明菌株GRJA011定植后可能通过代谢产物的分泌参与宿主肠道微生态的调节,间接提高宿主健康。未来研究应通过动物模型系统评价该菌株对反刍动物生长性能、瘤胃发酵参数及肠道健康的影响,并结合多组学技术深入揭示其与宿主互作的代谢与免疫机制。

4 结论

本研究成功自肉牛瘤胃液中分离出1株热带假丝酵母GRJA011。体外评价表明,该菌株具备一定的胃肠液耐受性、胆盐适应性以及黏附定植能力。非靶向代谢组学分析揭示,其益生表型与ABC转运蛋白、次生代谢物生物合成及甘油磷脂代谢等通路的富集密切相关。因此,肉牛瘤胃源热带假丝酵母GRJA011是一株具有优良体外益生特性的反刍动物候选益生菌,其体内功效及与宿主互作机制值得进一步研究。

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