1 材料与方法
1.1 试验材料
叶黄素和叶黄素酯为万寿菊提取,类胡萝卜素含量均为2%;叶黄素标准品(X6250)、玉米黄质标准品(14681)均为Sigma-Aldrich公司产品。
1.2 试验设计
选取350日龄、健康的海兰灰蛋鸡72只,随机分成2个组,每组6个重复,每个重复6只鸡。试验期共56 d,划分为2个阶段。阶段1为28 d的耗竭期,期间饲喂粉状小麦型基础饲粮(表1 ),其营养水平配制标准参照《海兰灰商品蛋鸡饲养管理手册》。阶段2为28 d的正试期,期间2个组分别饲喂在小麦型基础饲粮中添加40 mg/kg叶黄素和叶黄素酯的试验饲粮。饲粮取样后冻存于-80 ℃待测。试验期间的环境参数和日常管理参照《海兰灰商品蛋鸡饲养管理手册》执行。
表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis)% |
| 原料Ingredients | 含量Content | 营养水平Nutrient levels3) | 含量Content | |
|---|---|---|---|---|
| 小麦Wheat | 76.92 | 代谢能ME/(MJ/kg) | 11.15 | |
| 豆粕Soybean meal | 10.08 | 粗蛋白质CP | 15.00 | |
| 石粉Limestone1) | 8.00 | 钙Ca | 3.87 | |
| 预混料Premix2) | 5.00 | 有效磷AP | 0.33 | |
| 合计Total | 100.00 | 赖氨酸Lys | 0.70 | |
| 蛋氨酸+半胱氨酸Met+Cys | 0.58 |
1)粗细石粉比例为6∶4。The ratio of coarse and fine limestone is 6∶4. 2)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of the diet:CaHPO4 2 000 mg,植酸酶 phytase 1 000 U,NaCl 3 000 mg,VA 8 000 IU,VD3 3 300 IU,VE 20 mg,VK3 2.5 mg,VB1 2.5 mg,VB2 5.5 mg,烟酸 nicotinic acid 30 mg,泛酸 pantothenic acid 8 mg,VB6 4 mg,D-生物素 D-biotin 0.08 mg,叶酸 folic acid 1 mg,VB12 0.02 mg,胆碱 choline 110 mg,Mn 90 mg,Zn 80 mg,Fe 80 mg,Cu 8 mg,I 1.2 mg,Se 0.2 mg。 3)计算值 Calculated values。 |
在阶段1结束时,每个组随机挑选6只蛋鸡进行翅静脉采血并分离血清,之后屠宰取肝脏和卵巢样品,另以重复为单位收集当日的鸡蛋,使用鸡蛋品质测定仪(以色列奥卡EA-01)对蛋黄颜色评分后将蛋黄匀浆均匀。在阶段2的最后4 d,每日记录产蛋数,对蛋黄颜色评分,并以重复为单位连续收集蛋黄和部分粪便及时冻存于-80 ℃。阶段2结束时,每个重复随机挑选1只蛋鸡采集血清、肝脏和卵巢样品。
1.3 检测指标
饲粮、粪便、血清、肝脏、卵巢和蛋黄中的类胡萝卜素含量使用高效液相色谱(HPLC)仪测定,仪器型号为沃特世E2695,使用Ultimate硅胶柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),流动相为正己烷∶乙酸乙酯∶异丙醇(730∶270∶15),流速设置为1.4 mL/min,运行时间20 min,柱温40 ℃,紫外检测器波长设置为474 nm。样品中的类胡萝卜素含量以叶黄素标准品做单点定量法计算。
饲粮和粪便样品的前处理参考GB/T 23187—2008《饲料中叶黄素的测定 高效液相色谱法》,但样品不进行皂化,即:称取2 g左右的饲粮或10 g左右的粪便置于具塞三角瓶中,加入30 mL的萃取剂(正己烷:丙酮∶无水乙醇∶甲苯=34∶23∶20∶23)超声萃取10 min后,再加入30 mL正己烷和50 mL的10%无水硫酸钠溶液,剧烈振荡1 min后离心(4 000 r/min,5 min),然后抽取上清液经0.22 μm滤膜过滤后上样检测。
血清样品的前处理参考黄旸木等[9]的方法略作修改,即:移取0.5 mL血清至2 mL离心管中,加入0.5 mL的无水乙醇(含0.01%抗坏血酸),涡旋1 min后再加入0.7 mL的正己烷,继续涡旋2 min后3 000 r/min离心7 min,吸取上清液过0.22 μm滤膜后上样检测。
肝脏、卵巢和蛋黄样品前处理参考GB 5009.248—2016《食品安全国家标准 食品中叶黄素的测定》略作修改,即:肝脏、卵巢或蛋黄样品匀浆后,称取5 g左右至50 mL离心管中,加入20 mL混合溶剂(正己烷∶甲醇∶乙酸乙酯=1∶1∶1),2 500 r/min下涡旋20 min,再加入10 mL正己烷和10 mL的10%无水硫酸钠溶液,剧烈振荡后4 000 r/min离心5 min,抽取上清液过滤上样。
叶黄素和叶黄素酯的表观消化率测定采用内源指示剂法,以饲粮和粪便中的盐酸不溶灰分作为内源指示剂,其测定方法按GB/T 23742—2009《饲料中盐酸不溶灰分的测定》执行。
饲粮中叶黄素或叶黄素酯沉积到蛋黄中的效率参考Karadas等[10]的方法计算,计算公式为:
叶黄素或叶黄素酯沉积效率(%)=鸡蛋中的类胡萝卜素(A)总量/饲粮中的类胡萝卜素(B)总量。
式中:A=蛋黄重(g)×[试验组蛋黄中类胡萝卜素含量(mg/kg)-耗竭期蛋黄中类胡萝卜素含量(mg/kg)];B=采食量(g)×饲粮中类胡萝卜素含量×产蛋率(%)。
1.4 数据统计分析
试验数据用平均值±标准差表示,采用SPSS 21.0软件进行统计分析,使用独立样本t检验进行显著性分析,使用回归-线性进行相关性分析和方程拟合,以P<0.05为差异显著标准。
2 结果与分析
2.1 饲粮和粪便中类胡萝卜素含量及表观消化率
叶黄素和玉米黄质标准品在本试验色谱条件下的保留时间分别为10.26和11.39 min;万寿菊来源叶黄素酯的酯基为多种脂肪酸,无标准品,其保留时间需根据叶黄素酯样品皂化前后色谱峰的变化情况确定,在本试验的色谱条件下其保留时间为2.33 min。
2.2 肝脏中类胡萝卜素含量
2.3 血清、卵巢和蛋黄中类胡萝卜素含量
由表2 中数据可知,饲喂添加叶黄素或叶黄素酯饲粮28 d后,其血清、卵巢和蛋黄中类胡萝卜素含量比耗竭期明显提高;正试期内,叶黄素组和叶黄素酯组之间血清中类胡萝卜素含量没有显著差异(P>0.05),但卵巢和蛋黄中类胡萝卜素含量则表现为叶黄素酯组显著高于叶黄素组(P<0.05)。叶黄素组和叶黄素酯组类胡萝卜素沉积到蛋黄中的效率分别是11.27%和16.70%,2组间差异显著(P<0.05)。蛋黄中类胡萝卜素含量(X)和蛋黄色泽评分(Y)的相关系数(R2)为0.912,拟合线性方程为Y=0.182X+1.343(P<0.05)。
表2 不同样品中类胡萝卜素含量以及蛋黄色泽评分、类胡萝卜素表观消化率和沉积效率测定结果Table 2 Determination results of different samples for carotenoids content, yolk color score, apparent digestibility and deposition efficiency of carotenoids |
| 项目 Items | 耗竭期 Exhaustion stage | 正试期Experimental stage | P值 P-value | |
|---|---|---|---|---|
| 叶黄素组 Lutein group | 叶黄素酯组 Lutein ester group | |||
| 类胡萝卜素含量Carotenoids content/(mg/kg) | ||||
| 饲粮Diet | 1.91 | 36.03 | 37.98 | — |
| 粪便Excrement | 0.99±0.10 | 8.58±1.62 | 7.02±1.73 | 0.138 |
| 肝脏Liver | 2.73±0.74 | 19.55±9.36 | 17.51±5.96 | 0.532 |
| 血清Serum | 0.33±0.18 | 3.63±2.43 | 3.73±1.08 | 0.903 |
| 卵巢Ovarium | 4.21±1.67 | 22.28±5.80b | 29.13±4.07a | 0.003 |
| 蛋黄Yolk | 6.10±2.34 | 26.35±1.57b | 38.72±2.13a | <0.001 |
| 蛋黄色泽评分Yolk color score | 2.63±1.69 | 5.76±0.30b | 8.31±0.55a | <0.001 |
| 类胡萝卜素表观消化率Carotenoids apparent digestibility/% | 81.76±6.13 | 84.80±2.91 | 0.480 | |
| 类胡萝卜素沉积效率Carotenoids deposition efficiency/% | 11.27±0.60b | 16.70±0.42a | <0.001 | |
饲粮无平行样品,未进行显著性分析。叶黄素组和叶黄素酯组的同行数据肩标无字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。 |
There were no parallel samples for the diet, and no significance analysis was performed. In the same row, values of lutein group and lutein ester group with no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).
3 讨论
3.1 叶黄素酯在蛋鸡体内的消化
一般认为,叶黄素酯会在消化道脂肪酶的作用下水解成叶黄素单体和脂肪酸而被吸收,但叶黄素酯与叶黄素单体的吸收效率孰高还存在争议。惠伯棣等[7]的研究认为,大鼠对叶黄素酯的生物利用度是叶黄素单体的18.55%。Hencken[11]评估叶黄素酯在肉仔鸡的吸收效率为叶黄素单体的40%~60%。但是在蛋鸡上的一些研究显示,不论是从利用率还是蛋黄色泽,都表明蛋鸡对叶黄素酯的吸收效率更高,至少是与叶黄素单体没有明显差异[8,12]。在本研究中,叶黄素酯组蛋鸡的类胡萝卜素表观消化率及血清中类胡萝卜素含量与叶黄素组相比均没有显著差异。由此可见,动物对叶黄素酯的利用率与动物种类和动物生长阶段有关,成年家禽可以充分消化吸收叶黄素酯。
3.2 叶黄素在蛋鸡组织里的沉积
饲料中的叶黄素或叶黄素酯在体内的吸收可分为4个阶段,即从食物中被消化释放、与脂类形成水溶性胶束、被小肠上皮细胞吸收、通过淋巴系统运输至血液。但因家禽的淋巴系统不发达,包含类胡萝卜素的乳糜微粒可能直接进入肠系膜静脉汇至门静脉运送至肝脏,微粒粒径太大不会通过肝区毛细血管直接沉积,而由血液循环至其他组织[13⇓⇓-16],在人上的研究显示运输载体是高密度脂蛋白和低密度脂蛋白[17],而在禽上则可能是极低密度脂蛋白[18]。Breithaupt等[12]总结认为,叶黄素在血液中以单体形式运输,但在沉积部位会被该组织的酶重新酯化。对产蛋家禽而言,卵巢不合成脂类物质[16],故蛋鸡血清、卵巢和蛋黄中的类胡萝卜素种类一致,以叶黄素单体形式为主。相反,肝脏是体内主要的叶黄素及其代谢物的储存器官[17,19]。对产蛋家禽而言,肝脏的脂肪合成最为活跃[20]。本研究也证实,蛋鸡肝脏中叶黄素酯为优势形式。此外,本研究还发现,蛋鸡肝脏的类胡萝卜素HPLC图谱比饲粮类胡萝卜素HPLC图谱在3~5 min多3个出峰物质,推测应是叶黄素的代谢产物。叶黄素在体内可发生C-3和C-3’氧化形成酮式类胡萝卜素,按氧化程度和异构划分主要有3种,即:3-羟基-β,ε-3’酮基类胡萝卜素、3-羟基-ε,ε-3’酮基类胡萝卜素、ε,ε-3,3’二酮基类胡萝卜素[19]。
3.3 叶黄素或叶黄素酯对蛋黄色泽的影响
同时比较叶黄素和叶黄素酯在蛋鸡中沉积效率的定量研究尚缺乏。有研究表明,添加12 mg/kg的叶黄素可使蛋黄中类胡萝卜素含量分别达到37.87和39.01 mg/kg,其沉积效率分别为38%和36%[10,21]。在本研究中,添加40 mg/kg的叶黄素其蛋黄中类胡萝卜素含量为26.35 mg/kg,沉积效率只有11.27%。Islam等[22]研究表明,饲喂添加40 mg/kg叶黄素酯的小麦型饲粮的蛋鸡,蛋黄中总类胡萝卜素含量为18.01 mg/kg。而本研究中相同添加剂量的叶黄素酯则使蛋黄中类胡萝卜素含量达到了38.72 mg/kg。叶黄素或叶黄素酯的沉积效率受色素原料、使用剂量、试验动物品种、日龄、饲粮配方等的影响[10,22],使不同研究的结果可比性较差。
4 结论
① 叶黄素在蛋鸡血液、卵巢和蛋黄中主要以单体的形式存在,而在肝脏中则主要以酯的形式存在。
② 叶黄素酯可以被蛋鸡充分利用,且应用效果不差于叶黄素单体。
③ 蛋黄中类胡萝卜素含量与蛋黄颜色评分有显著的线性关系。
京公网安备 11010802041926号
