动物营养学报 >

2023 , Vol. 35 >Issue 1: 287 - 300

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1006-267x.2023.01.030

研究论文

中草药提取物复合制剂对乳中高体细胞数奶牛生产性能、免疫和抗氧化功能及瘤胃细菌区系的影响

  • 张腾龙 , 1 ,
  • 郭晨阳 2 ,
  • 宋洁 1 ,
  • 敖长金 , 1, * ,
  • 王丽芳 , 2, *
展开
  • 1 内蒙古农业大学动物科学学院,呼和浩特 010018
  • 2 内蒙古自治区农牧业科学院,呼和浩特 010031
* 敖长金,教授,博士生导师,E-mail: ;
王丽芳,研究员,E-mail:

张腾龙(1990—),男,内蒙古呼和浩特人,博士研究生,动物营养与饲料科学专业。E-mail:

收稿日期: 2022-07-03

  网络出版日期: 2023-01-11

基金资助

国家自然科学基金项目(31860663)

内蒙古自治区科技计划项目(2021GG0029)

内蒙古自然科学基金项目(2021LHMS03014)

内蒙古农牧业创新基金项目(2020CXJJM12)

奶牛疾病绿色防控技术应用示范(2022TG16)

收起

Effects of Compound Preparation of Chinese Herbal Extract on Performance, Immune and Antioxidant Function and Ruminal Bacterial Flora of Cows with High Somatic Cell Count In Milk

  • ZHANG Tenglong , 1 ,
  • GUO Chenyang 2 ,
  • SONG Jie 1 ,
  • AO Changjin , 1, * ,
  • WANG Lifang , 2, *
Expand
  • 1 College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
  • 2 Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Hohhot 010031, China
* AO Changjin, professor, E-mail: ;
WANG Lifang, professor, E-mail:

Received date: 2022-07-03

  Online published: 2023-01-11

Fold

摘要

本试验旨在研究中草药提取物复合制剂对乳中高体细胞数(SCC)奶牛生产性能、免疫和抗氧化功能及瘤胃细菌区系的影响。选取10头体况、泌乳期、产奶量相近且乳中SCC高于50万个/mL的经产荷斯坦奶牛,根据乳中SCC相近原则,分为对照组[乳中SCC=(97.48±23.75)万个/mL]和试验组[乳中SCC=(98.78±29.92)万个/mL],每组5头牛,2组奶牛均不进行药物治疗。对照组饲喂全混合日粮(TMR),试验组饲喂TMR+54 g/(d·头)中草药提取物复合制剂。试验期35 d。结果表明:1)与对照组相比,饲粮中添加中草药提取物复合制剂显著降低了乳中高SCC奶牛第14、28天乳中SCC(P<0.05),对产奶量、乳成分和营养物质表观消化率没有影响(P>0.05)。2)与对照组相比,饲粮中添加中草药提取物复合制剂显著提高了乳中高SCC奶牛血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)和干扰素-γ(IFN-γ)含量(P<0.05),显著降低了血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量(P<0.05)。3)与对照组相比,饲粮中添加中草药提取物复合制剂能显著降低乳中高SCC奶牛瘤胃放线菌门、琥珀酸弧菌科_UCG-001(Succinivibrionaceae_UCG-001)和高氏瘤胃球菌群(Ruminococcus_gauvreauii_group)比例(P<0.05),提高普雷沃氏菌科_UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)比例。由此可见,饲粮中添加中草药提取物复合制剂能降低乳中高SCC奶牛乳中SCC,提高免疫功能,改善瘤胃细菌区系组成。

关键词： 中草药提取物; 奶牛; 生产性能; 免疫; 细菌区系

本文引用格式

张腾龙 , 郭晨阳 , 宋洁 , 敖长金 , 王丽芳 . 中草药提取物复合制剂对乳中高体细胞数奶牛生产性能、免疫和抗氧化功能及瘤胃细菌区系的影响[J]. 动物营养学报, 2023 , 35(1) : 287 -300 . DOI: 10.3969/j.issn.1006-267x.2023.01.030

Abstract

The aim of this experiment was to investigate the effects of compound preparation of Chinese herbal extract on performance, immune and antioxidant function and ruminal bacterial flora of cows with high somatic cell count (SCC) in milk. Ten transitional Holstein cows with similar body condition, lactation period, milk yield and milk SCC higher than 500 000 cells/mL were selected and divided into control group [milk SCC=(97.48±23.75) ten thousand cells/mL] and experimental group [milk SCC=(98.78±29.92) ten thousand cells/mL] based on the principle of similar milk SCC, each group contained 5 cows, and cows in 2 groups were not treated with medication. The control group was fed a total mixed ration (TMR), and the experimental was fed the TMR+54 g/(d·head) compound preparation of Chinese herbal extract. The experiment lasted for 35 days. The results showed as follows: 1) compared with the control group, the addition of compound preparation of Chinese herbal extract in the diet significantly decreased the SCC in milk at days 14 and 28 of cows with high SCC in milk (P<0.05), but had no significant effects on milk yield, milk composition and nutrient apparent digestibility (P>0.05). 2) Compared with the control group, the addition of compound preparation of Chinese herbal extract in the diet significantly increased the contents of immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin M (IgM) and interferon-γ (IFN-γ) in serum of cows with high SCC in milk (P<0.05), and significantly decreased the serum tumor necrosis factor-α (TNF-α) content (P<0.05). 3) Compared with the control group, the addition of compound preparation of Chinese herbal extract in the diet significantly decreased the proportions of Actinobacteria, Succinivibrionaceae_UCG-001 and Ruminococcus_gauvreauii_group in rumen of cows with high SCC in milk (P<0.05), and significantly increased the rumen Prevotellaceae_UCG-001 proportion (P<0.05). It is concluded that the addition of compound preparation of Chinese herbal extract in the diet can reduce the SCC in milk, increase the immune function, and improve the rumen bacterial flora composition of cows with high SCC in milk.

Key words： Chinese herbal extract; cows; performance; immune; bacterial flora

世界范围内,乳房炎是造成奶牛场直接和间接经济损失的最为流行的奶牛疾病[1],同时对于奶牛的福利和食品安全生产方面还具有负面影响[2]。抗生素是目前防治奶牛乳房炎最主要的方法,但是长时间过度使用和滥用抗生素,使得病原菌耐药性逐渐增加[3]。对抗生素具有耐药性的病原体的出现,会增加发病率和死亡率,并使得奶牛的治疗成本大大提升[4]。目前已经证实,植物提取物具有长期使用而不会诱发耐药性的优势[5-6],成为最具潜力的抗生素替代品。
在反刍动物营养中,植物提取物主要被用作抗氧化剂和抗炎剂[7],也可作为瘤胃发酵的调节剂[8-9]。Wall等[10]研究发现,饲粮中添加肉桂醛和丁香酚的混合物能够增加初产奶牛的干物质采食量和产奶量。Tuzikov等[11]研究发现,橡树叶和桦树皮的提取物能够增加奶牛瘤胃液中拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度,并减少厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)相对丰度。Olagaray等[12]研究发现,饲粮中添加黄芩提取物能够降低牛群的乳房炎发病率。金银花具有抗炎解热、抗衰老、抗氧化等功能[13];蒲公英有广谱抗菌作用[14];连翘能够抑制大肠杆菌、葡萄球菌及链球菌等病原微生物的生长[15];益母草具有提高动物繁殖性能的作用[16]。因此,本试验选择金银花、蒲公英、连翘和益母草的提取物制成中草药提取物复合制剂,研究其对乳中高体细胞数(somatic cell count,SCC)奶牛生产性能、血清免疫和抗氧化指标及瘤胃细菌区系的影响,为植物提取物在乳房炎奶牛上的应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 植物提取物制备

金银花、益母草、连翘、蒲公英的提取物委托南京泽朗生物科技有限公司进行制备,提取工艺条件为:10倍水,60 ℃提取2.5 h,然后8倍水,60 ℃提取2 h。中草药提取物复合制剂按照4种植物提取物重量比1∶1∶1∶1混合制成。4种植物提取物的活性成分含量委托武汉迈特维尔生物科技有限公司采用广泛靶向代谢组学方法进行测定(表1)。
表1 4种植物提取物的活性成分含量

Table 1 Contents of active components in four kinks of plant extracts

项目
Items		 金银花
Honeysuckle		 连翘
Forsythia		 蒲公英
Dandelion		 益母草
Leonurus
黄酮类Flavonoids 39.51 14.80 27.16 25.48
酚酸类Phenolic acids 17.79 21.95 22.03 17.25
核苷酸类Nucleotides 10.04 11.06 8.43
有机酸类Organic acids 6.27 10.54 10.11 11.74
脂质类Lipids 5.95 17.86 9.13 18.68
木质素和香豆素Lignin and coumarin 20.08
其他Others 20.44 14.77 20.51 18.42
合计Total 100.00 100.00 100.00 100.00

1.2 试验设计

试验选取10头体况、泌乳期[(216±57) d]、产奶量相近,且乳中SCC高于50万个/mL的经产荷斯坦奶牛,根据乳中SCC相近原则,分为对照组[CON组,乳中SCC=(97.48±23.75)万个/mL]和试验组[TEST组,乳中SCC=(98.78±29.92)万个/mL],每组5头牛,2组奶牛均不进行药物治疗。试验期35 d,包括7 d的预试期和28 d的正试期。试验期内,TEST组中草药提取物复合制剂的添加剂量为54 g/(d·头),将中草药提取物复合制剂与玉米粉进行预混,饲喂时由专人添加,确保每头奶牛采食到规定剂量;CON组以同等方式给予同等剂量的玉米粉,不添加中草药提取物复合制剂。

1.3 基础饲粮和饲养管理

基础饲粮参照NRC(2001)奶牛饲养标准进行配制,以全混合日粮(TMR)形式进行饲喂,其组成及营养水平见表2。
表2 TMR组成及营养水平(干物质基础)

Table 2 Composition and nutrient levels of the TMR (DM basis)%

项目Items 含量Content
原料Ingredients
玉米青贮Corn silage 28.57
苜蓿干草Alfalfa hay 14.29
全棉籽Whole cottonseed 7.14
玉米Corn 21.43
大豆皮Soybean hull 7.14
大豆Soybean 3.15
豆粕Soybean meal 5.25
棉籽粕Cottonseed meal 4.00
菜籽粕Rapeseed meal 2.10
酒糟Distiller’s grains 4.20
酵母Yeast 0.42
预混料Premix1) 2.31
合计Total 100.00
营养水平Nutrient levels2)
泌乳净能NEL/(MJ/kg) 3.02
干物质DM 53.73
项目Items 含量Content
粗蛋白质CP 18.62
粗脂肪EE 7.30
中性洗涤纤维NDF 36.52
酸性洗涤纤维ADF 15.63
粗灰分Ash 6.05
钙Ca 0.74
磷P 0.23

1)每千克预混料含 One kg premix contained the following: VA 460 000 IU,VE 6 000 IU,VD3 180 000 IU,Fe (as ferrous sulfate) 28 g,Cu (as copper sulfate) 1.1 g,Co (as cobalt chloride) 1.1 g,Ca (as calcium iodate) 0.3 g,Mn (as manganese sulfate) 5.6 g,Zn (as zinc sulfate) 4.6 g,I (as potassium iodide) 200 mg,Se (as sodium selenite) 25 mg,P (as calcium hydrogen phosphate) 75 g。

2)泌乳净能为计算值,其余均为实测值。NEL was a calculated value, while the others were measured values.

奶牛饲养管理方式均按照牧场现有方式。每天06:00和17:00进行TMR投料,奶牛自由采食、自由饮水。每天07:00和14:00各挤奶1次,准确记录产奶量。

1.4 样品采集和指标测定

1.4.1 营养物质表观消化率的测定

在试验第28天,采集TMR与粪便样品。TMR样品在刚投料时多点采集,混合均匀。粪便样品使用直肠采粪法收集。
营养物质表观消化率以酸不溶灰分(AIA)为内标,按照内源指示剂法(GB/T 23742—2009)进行测定。干物质(DM)含量测定方法参考GB/T 6435—2014,粗蛋白质(CP)含量测定方法参考GB/T 6432—2018[17],粗脂肪(EE)含量测定方法参考GB/T 6433—2006[18],中性洗涤纤维(NDF)含量测定方法参考GB/T 20806—2006[19],酸性洗涤纤维(ADF)含量测定方法参考NY/T 1459—2007[20],粗灰分(Ash)含量测定方法参考GB/T 6438—2007[21],钙(Ca)含量测定方法参考GB/T 6436—2018[22],磷(P)含量测定方法参考GB/T 6437—2018[23]。营养物质表观消化率计算公式如下:
营养物质表观消化率(%)=100×[1-(A×D/B×C)]。
式中:A为饲粮中AIA含量;B为饲粮中该营养物质含量;C为粪中AIA含量;D为粪中该营养物质含量。

1.4.2 产奶量与乳成分的测定

于试验第1、7、14、21、28天采集奶样,按早∶晚=6∶4混合,取50 mL加入溴硝丙二醇防腐剂,置于4 ℃下保存,用于乳中SCC测定及乳成分分析。其中,乳脂肪、乳蛋白、乳糖、非脂乳固体、总固形物含量采用全自动乳成分分析仪(MikoScan FT120,FOSS公司,丹麦)测定,SCC采用牛奶体细胞计数仪(SCC-100,Chemometec公司,丹麦)测定。

1.4.3 血样的采集与测定

在试验第28天晨饲前,每头牛使用尾静脉采血方式采集血液样品10 mL。室温静止30 min后4 ℃、3 000 r/min离心15 min,取血清于-20 ℃冷冻保存。
血清免疫指标的测定:免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)含量采用酶联免疫吸附法,试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,通过Multiskan FC型酶标仪(赛默飞世尔仪器有限公司)进行测定。
血清抗氧化指标的测定:总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及总抗氧化能力(T-AOC)采用酶联免疫吸附法测定,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性采用二硫代二硝基甲苯酸法测定,丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定,试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.4.4 瘤胃液样品的采集与测定

每组选取4头奶牛,在试验期最后1天晨饲前进行瘤胃液样品的采集,通过瘤胃液口腔采集器采集瘤胃液200 mL,现场测定pH,4层纱布过滤,其中20 mL转移至冻存管,-80 ℃保存,用于瘤胃细菌区系的测定。瘤胃16S rRNA测序委托上海美吉生物医药科技有限公司进行处理与分析 。

1.5 数据统计与分析

试验数据使用Excel 365进行初步整理统计后,使用SPSS 26.0软件中t检验进行差异显著性分析,以P<0.05为差异显著性判断标准,结果以平均值和均值标准误(SEM)表示。使用UPARSE软件,根据97%的相似度对序列进行操作分类单元(OTU)聚类,使用UCHIME软件剔除嵌合体,利用RDP classifie对每条序列进行物种分类注释,比对Silva数据库(SSU138),设置比对阈值为70%。

2 结果

2.1 中草药提取物复合制剂对乳中高SCC奶牛产奶量、乳中SCC、乳成分和营养物质表观消化率的影响

从表3可以看出,饲粮中添加中草药提取物复合制剂对乳中高SCC奶牛产奶量没有显著影响(P>0.05)。
表3 中草药提取物复合制剂对乳中高SCC奶牛产奶量的影响

Table 3 Effects of compound preparation of Chinese herbal extract on milk yield of cows with high SCC in milkkg/d

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
CON TEST
第1天Day 1 23.92 22.16 4.73 0.685
第7天Day 7 21.40 19.01 2.97 0.147
第14天Day 14 16.35 18.72 4.14 0.651
第21天Day 21 18.01 20.50 4.19 0.471
第28天Day 28 16.57 18.33 4.57 0.365
从表4可以看出,与CON组相比,饲粮中添加中草药提取物复合制剂能够显著降低乳中高SCC奶牛第14、28天乳中SCC(P<0.05)。
表4 Effects of compound preparation of Chinese herbal extract on milk SCC of cows with high SCC in milk万个/mL

Table 4

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
CON TEST
第1天Day 1 97.48 98.78 22.30 0.979
第7天Day 7 200.00 83.92 31.58 0.068
第14天Day 14 172.45 42.48 26.02 0.002
第21天Day 21 153.90 37.75 31.78 0.058
第28天Day 28 151.00 30.23 30.84 0.034
从表5可以看出,饲粮中添加中草药提取物复合制剂对乳中高SCC奶牛乳成分没有显著影响(P>0.05)。
表5 中草药提取物复合制剂对乳中高SCC奶牛乳成分的影响

Table 5 Effects of compound preparation of Chinese herbal extract on milk component of cows with high SCC in milk%

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
CON TEST
乳脂率Milk fat 3.67 3.28 0.31 0.567
乳蛋白率Milk protein 3.88 3.75 0.12 0.603
乳糖率Lactose 4.53 4.97 0.14 0.128
总固形物Total solids 13.12 13.12 0.32 1.000
非脂乳固体Nonfat milk solids 9.18 9.44 0.13 0.354
从表6可以看出,饲粮中添加中草药提取物复合制剂对乳中高SCC奶牛营养物质表观消化率没有显著影响(P>0.05)。
表6 中草药提取物复合制剂对乳中高SCC奶牛营养物质表观消化率的影响

Table 6 Effects of compound preparation of Chinese herbal extract on nutrient apparent digestibility of cows with high SCC in milk%

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
CON TEST
粗蛋白质CP 96.14 94.74 0.68 0.338
粗脂肪EE 99.16 99.09 0.12 0.789
粗灰分Ash 90.74 87.18 1.74 0.254
酸性洗涤纤维NDF 90.16 87.45 1.53 0.416
中性洗涤纤维ADF 92.31 90.36 1.21 0.459
钙Ca 84.39 80.13 2.69 0.469
磷P 82.22 73.18 3.45 0.212

2.2 中草药提取物复合制剂对乳中高SCC奶牛血清免疫和抗氧化指标的影响

从表7可以看出,与CON组相比,饲粮中添加中草药提取物复合制剂能够显著提高乳中高SCC奶牛血清IgM、IgA和IFN-γ含量(P<0.05),显著降低血清TNF-α含量(P<0.05)。
表7 中草药提取物复合制剂对乳中高SCC奶牛血清免疫指标的影响

Table 7 Effects of compound preparation of Chinese herbal extract on serum immune indexes of cows with high SCC in milk

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
CON TEST
免疫球蛋白M IgM/(μg/mL) 1 372.98 1 731.35 80.35 0.012
免疫球蛋白G IgG/(mg/mL) 4.84 5.16 0.18 0.406
免疫球蛋白A IgA/(μg/mL) 1 355.22 2 273.63 167.64 <0.001
细胞白介素-2 IL-2/(pg/mL) 900.47 741.04 56.88 0.178
细胞白介素-6 IL-6/(pg/mL) 182.20 158.29 7.70 0.129
肿瘤坏死因子-α TNF-α/(pg/mL) 145.13 96.98 10.85 0.013
干扰素-γ IFN-γ/(pg/mL) 939.80 1 129.09 49.55 0.048
从表8可以看出,饲粮中添加中草药提取物复合制剂对乳中高SCC奶牛血清抗氧化指标无显著影响(P>0.05)。
表8 中草药提取物复合制剂对乳中高SCC奶牛血清抗氧化指标的影响

Table 8 Effects of compound preparation of Chinese herbal extract on serum antioxidant indexes of cows with high SCC in milk

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
CON TEST
总抗氧化能力T-AOC/(mmol/L) 0.47 0.42 0.03 0.447
总超氧化物歧化酶T-SOD/(U/mL) 169.39 174.83 2.33 0.274
过氧化氢酶CAT/(U/mL) 2.18 2.79 0.24 0.236
丙二醛MDA/(nmol/mL) 3.58 3.30 0.40 0.750
谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px/(U/mL) 144.20 140.55 21.42 0.939

2.3 中草药提取物复合制剂对乳中高SCC奶牛瘤胃细菌区系的影响

测序结束后,对优化序列按照97%相似度进行OTU聚类,按照最小样本序列数进行物种分类学注释,比对Silva(silva138/16s_bacteria)数据库,比对阈值为70%。在2组奶牛瘤胃液中共比对出17门、34纲、63目、104科、227属及491种细菌及古菌,OTU数目共1 743个。
根据OTU表格分析聚类信息并绘制韦恩图(Venn graph),发现2组奶牛瘤胃液共有的OTU数为1 430个,CON组和TEST组分别含有1 571和1 603个OTU,CON组独有OTU数为141个,TEST组独有OTU数为173个(图1)。
图1 OTU分布韦恩图

CON:对照组 control group; TEST:试验组 test group。下图同 the same as below。

Fig.1 Venn graph of OTU distribution

从表9可以看出,本试验中,测序覆盖率均为0.99,说明样品采集足以反映瘤胃菌群的情况,满足后续测序分析。2组之间的Shannon指数、Simpson指数、ACE指数、Chao1指数无显著差异(P>0.05)。
表9 中草药提取物复合制剂对乳中高SCC奶牛瘤胃细菌多样性指数的影响

Table 9 Effects of compound preparation of Chinese herbal extract on of rumen bacterial diversity indexes of cows with high SCC in milk

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
CON TEST
Shannon指数Shannon index 5.74±0.21 5.72±0.08 0.82
Simpson指数Simpson index 0.01±0.00 0.01±0.00 0.84
ACE指数ACE index 1 421.00±60.54 1 364.00±23.80 0.13
Chao1指数Chao1 index 1 481.30±65.95 1 395.60±20.61 0.54
覆盖率Coverage 0.99±0.00 0.99±0.00 0.96
基于OTU进行主成分分析(PCA),若样品的物种组成相似度越高,则在PCA图中的距离越接近。通过PCA图能够直观的看出生物学重复的组内相似性及组间差异是否明显。图2展示了丰度标准化情况下,采用ANOSIM检验进行组间差异检验的PCA结果,表明2组在群落组成上具有差异。
图2 主成分分析图

Fig.2 PCA graph

从图3可以看出,在门水平上,共检测到17个差异瘤胃细菌菌门,包括拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门等。其中,拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门等7个细菌菌门相对丰度占到总细菌比例的99%。从图4可以看出,TEST组瘤胃放线菌门(Actinobacteriota)比例显著低于CON组(P<0.05)。
图3 门水平上瘤胃主要菌群分布

Bacteroidota:拟杆菌门;Firmicutes:厚壁菌门;Proteobacteria:变形菌门;Spirochaetota:螺旋体门;Patescibacteria:髌骨细菌门;Actinobacteriota:放线菌门;Others:其他。

Fig.3 Distribution of rumen main flora at phylum level

图4 门水平t检验条形图

Actinobacteriota:放线菌门。

Fig.4 t-test bar plot at phylum level

进一步细化分类到属水平,本试验检测到奶牛瘤胃液中共有227个差异菌属。从图5可以看出,相对丰度较高的25个菌属占到总菌群比例的99%以上。从图6可以看出,TEST组瘤胃琥珀酸弧菌科_UCG-001(Succinivibrionaceae_UCG-001)、高氏瘤胃球菌属群(Ruminococcus_gauvreauii_group)、UCG-001、Shuttleworthia、普雷沃氏菌科_YAB2003群(Prevotellaceae_YAB2003_group)、未排位的硒单胞菌科(norank_f_Selenomonadaceae)、假诺卡氏菌属(Pseudoscardovia)、未排位的红螺菌目(norank_f_norank_o_Rhodospirillales)和未分类的拟杆菌目(unclassified_o_Bacteroidales)比例显著低CON组(P<0.05),普雷沃氏菌科_UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)、Marvinbryantia、普雷沃氏菌科_NK3B31群(Prevotellaceae_NK3B31_group)、经黏液真杆菌属(Blautia)、未分类的颤螺菌科(unclassified_f_Oscillospiraceae)和V9D2013_group比例显著高于CON组(P<0.05)。其中,仅Succinivibrionaceae_UCG-001(CON组3.70%,TEST组0.23%)、Ruminococcus_gauvreauii_group(CON组1.27%,TEST组0.60%)和Prevotellaceae_UCG-001比例(CON组1.15%,TEST组2.20%)较高。
图5 属水平上瘤胃主要菌群分布

Prevotella:普雷沃氏菌属;Ruminococcus:瘤胃球菌属;Rikenellaceae_RC9_gut_group:理研菌科_RC9肠道群;Succiniclasticum:解琥珀酸菌属;Lachnospiraceae_NK3A20_group:毛螺菌科_NK3A20群;Treponema:密螺旋体属;Succinivibrionaceae_UCG-001:琥珀酸弧菌科_UCG-001;norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014:未排位的梭状芽胞杆菌属_UCG-014;Christensenellaceae_R-7_group:克里斯滕森菌科_R-7群;Prevotellaceae_UCG-001:普雷沃氏菌科_UCG-001;Succinivibrionaceae_UCG-002:琥珀酸菌科_UCG-002;norank_f_Prevotellaceae:未排位的普雷沃氏菌科;Prevotellaceae_UCG-003:普雷沃氏菌科_UCG-003;norank_f_Bacteroidales_RF16_group:未排位的拟杆菌目RF16群;Ruminococcus_gauvreaull_group:高氏瘤胃球菌属群;Others:其他。

Fig.5 Distribution of rumen main flora at genus level

从图7可以看出,相关性分析结果表明,Ruminococcus_gauvreauii_group(r=0.747,P=0.033)和Succinivibrionaceae_UCG_001比例(r=0.787,P=0.020)与乳中SCC呈正相关,Ruminococcus_gauvreauii_group比例与血清IgA(r=-0.817,P=0.013)和IgM含量(r=-0.757,P=0.030)呈负相关,Succinivibrionaceae_UCG_001比例与血清IgA含量(r=-0.732,P=0.039)呈负相关。

3 讨论

3.1 中草药提取物复合制剂对乳中高SCC奶牛生产性能的影响

Hashemzadeh-Cigari等[24]在具有中或高SCC的奶牛饲粮中,将60%迷迭香、18%肉桂皮、18%姜黄和4%丁香芽的混合物作为添加剂进行补饲,对采食量、生产性能、乳房健康、瘤胃发酵和牛奶血浆代谢物进行了研究,结果表明,补饲混合物无论是在中还是高SCC的奶牛中,都显示出乳中SCC的减少和生产性能的提高,从而改善了整体乳腺健康状况。Olagaray等[12]研究发现,短期使用黄芩提取物能够降低奶牛乳房炎的发病率,但不会改变奶牛生产性能。

3.2 中草药提取物复合制剂对乳中高SCC奶牛乳中SCC的影响

奶牛乳房炎是由乳腺内部感染(IMI)所引起的,而SCC是衡量奶牛IMI程度及牛奶质量的主要指标[25]。有学者指出,20万个/mL的SCC可以作为正常奶牛和可能被感染的奶牛的分界值[26]。本试验中所选奶牛乳中SCC均大于50万个/mL,已经患有乳房炎。从试验第7天开始,TEST组奶牛乳中SCC均低于CON组,在第14和28天呈现显著差异;同时,CON组奶牛乳中SCC随着时间变化呈现先上升后下降的趋势,且在整个试验期内均高于试验第1天;TEST组奶牛乳中SCC在整个试验期内均呈现下降趋势。说明中草药提取物复合制剂的添加能够有效控制奶牛乳房炎的发展。同时,本研究的4种中草药的水提取物中都富含黄酮类化合物和酚酸类物质。与黄酮类物质相似的是,酚酸类物质也属于多酚类物质,植物中多为羟基苯甲酸和羟基肉桂酸的衍生物。羟基苯甲酸衍生物以葡萄糖苷形式存在,羟基肉桂酸以奎尼酸或糖的酯类形式存在[27]。酚酸类物质也具有一定的抗菌和抗氧化等特性[28]。课题组前期通过体外抑菌试验发现,中草药提取物复合制剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑制作用[29],从而推测中草药提取物复合制剂具有一定的抗菌活性。在本试验中,奶牛乳中SCC的降低可能是源于中草药提取物复合制剂的添加抑制了病原菌对乳腺的持续侵染,降低了奶牛IMI程度,进而使得奶牛乳中SCC降低。

3.3 中草药提取物复合制剂对乳中高SCC奶牛免疫和抗氧化能力的影响

本试验中,饲粮中添加中草药提取物复合制剂能够显著提高乳房炎奶牛血清IgA、IgM和IFN-γ含量,显著降低血清TNF-α含量,一定程度上提高了血清IgG含量并降低了IL-2和IL-6含量。免疫球蛋白含量的提升预示着机体对病原抵抗能力的提高;IFN-γ具有抗病毒、抗增殖和免疫调节等功能。本试验中观测到的血清免疫球蛋白和IFN-γ含量的提高,预示着机体免疫能力的提升。本试验选取的中草药提取物复合制剂含有黄酮类等生物活性成分,植物黄酮是起始于苯丙烷代谢途径的植物次级代谢产物,能够提高畜禽免疫水平、抗氧化能力和抗炎能力[30]。侯昆等[31]研究发现,饲喂竹叶黄酮能够显著降低隐性乳房炎奶牛血清白细胞介素-1β(IL-1β)、TNF-α含量,并降低血清MDA含量。占今舜等[32]研究发现,奶牛血清IgG含量随苜蓿黄酮添加剂量的升高呈先升高后下降的趋势,血清GSH-Px活性随苜蓿黄酮添加剂量的升高呈线性升高。本试验中,饲粮中添加中草药提取物复合制剂对奶牛血清抗氧化指标没有显著影响,可能是由于饲喂量、中草药种类及提取方式不同所引起。因此,推断中草药提取物复合制剂的添加能够提高机体的免疫水平,减轻机体的炎症反应,进而降低奶牛乳中SCC。
图6 属水平t检验条形图

Succinivibrionaceae_UCG-001:琥珀酸弧菌科_UCG-001;Prevotellaceae_UCG-001:普雷沃氏菌科_UCG-001;Ruminococcus_gauvreauii_group:高氏瘤胃球菌属群;Prevotellaceae_YAB2003_group:普雷沃氏菌科_YAB2003群;Prevotellaceae_NK3B31_group:普雷沃氏菌科_NK3B31群;norank_f_Selenomonadaceae:未排位的硒单胞菌科;Pseudoscardovia:假诺卡氏菌属;Blautia:经黏液真杆菌属;unclassified_f_Oscillospiraceae:未分类的颤螺菌科;norank_f_norank_o_Rhodospirillales:未排位的红螺菌目;unclassified_o_Bacteroidales:未分类的拟杆菌目。

Fig.6 t-test bar plot at genus level

3.4 中草药提取物复合制剂对乳中高SCC奶牛瘤胃细菌区系的影响

Zhong等[33]研究表明,乳中低SCC奶牛与乳中高SCC奶牛瘤胃细菌群落组成不同。Hu等[34]研究发现,瘤胃菌群的改变与奶牛乳房炎的发生密切相关。本试验对瘤胃液进行16S测序发现,与CON组相比,TEST组瘤胃液内菌群α多样性指数没有显著变化,说明中草药提取物复合制剂对瘤胃内菌群丰度没有显著影响。利用主成分分析对2组奶牛的β多样性进行分析,发现中草药提取物复合制剂能够改变瘤胃内菌群的β多样性,说明饲粮中添加中草药提取物复合制剂能够改变奶牛瘤胃内细菌群落组成。将测序结果与Silva数据库进行比对,发现在门水平上,TEST组瘤胃放线菌门比例显著低于CON组;在属水平上,TEST组瘤胃Succinivibrionaceae_UCG-001和Ruminococcus_gauvreauii_group比例显著低于CON组,Prevotellaceae_UCG-001比例显著高于CON组。
同时,本试验将奶牛乳中SCC和奶牛血清免疫指标与瘤胃细菌进行了Pearson相关性分析,发现Ruminococcus_gauvreauii_group和Succinivibrionaceae_UCG-001比例与SCC及血清免疫球蛋白含量具有相关性。Wan等[35]研究发现,Ruminococcus_gauvreauii_group可能是造成小鼠高血脂症的关键肠道微生物。Xu等[36]在小鼠上的研究表明,Ruminococcus_gauvreauii_group比例与小鼠体内脂多糖(LPS)、TNF-α、IL-1β和IL-6含量有较强的正相关性。本试验中发现,Ruminococcus_gauvreauii_group与奶牛乳中SCC具有显著正相关性,推测中草药提取物复合制剂的使用能够抑制乳房炎奶牛瘤胃内Ruminococcus_gauvreauii_group的繁殖,降低奶牛体内LPS的积累,从而减轻乳房炎奶牛的炎症反应,进而降低奶牛乳中SCC。Succinivibrionaceae_UCG-001与瘤胃内琥珀酸的产生密切相关[37],其主要代谢终产物是乙酸、琥珀酸和乳酸。但其与机体炎症和机体免疫的相关性未见报道。本研究发现,瘤胃内Succinivibrionaceae_UCG-001含量与奶牛乳中SCC呈正相关,与血清IgA含量呈负相关,具体机制还有待进一步研究。
图7 属水平奶牛瘤胃细菌相对丰度与乳中SCC和血清免疫指标的Pearson相关热图

norank_f_Bacteroidales_RF16_group:未排位的拟杆菌目_RF16群;Prevotella:普雷沃氏菌属;Succiniclasticum:解琥珀酸菌属;Prevotellaceae_YAB2003_group:普雷沃氏菌科_YAB2003群;Olsenella:欧鲁森氏菌属;unclassified_f_Lachnospiraceae:未分类的毛螺菌科;Ruminococcus_gauvreauii_group:高氏瘤胃球菌属群;Succinivibrionaceae_UCG-001:琥珀酸弧菌科_UCG_001;Bifidobacterium:双歧杆菌属;norank_f_norank_o_Bacteroidales:未排位的拟杆菌目;Succinivibrionaceae_UCG-002:琥珀酸弧菌科_UCG-002;Rikenellaceae_RC9_gut_group:理研菌科_RC9肠道群;Christensenellaceae_R-7_group:克里斯滕森菌科_R-7群;Prevotellaceae_UCG-001:普雷沃氏菌科_UCG-001;Ruminococcus:瘤胃球菌属;Colidextribacter:大肠埃希菌属;Prevotellaceae_UCG-003:普雷沃氏菌科_UCG-003;norank_f_Eubacterium_coprostanoligenes_group:未排位的产粪甾醇真杆菌属群;Treponema:密螺旋体属;Butyrivibrio:丁酸弧菌属;Prevotellaceae_UCG_004:普雷沃氏菌科_UCG-004;norank_f_Lachnospiraceae:未排位的毛螺菌科UCG-014;norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014:未排位的梭状芽胞杆菌属_UCG-014;Lanchnospiraceae_NKA20_group:毛螺旋菌科_NKA20群;Candidatus_Saccharimonas:白念珠菌属;Fibrobacter:纤维杆菌属;Eubacterium_ruminantium_group:反刍动物真杆菌属群;Pseudobutyrivibrio:假丁酸弧菌属;Acetitomaculum:聚乙酸菌属;Anaeroplasma:厌氧支原体属。

相关系数(r)以不同颜色表示,图例位于右侧;*表示0.01<P≤0.05,**表示0.001<P≤0.010。

Fig.7 Pearson correlation heatmap between rumen bacteria relative abundance at genus level with milk SCC and serum immune indexes of dairy cows

Correlation coefficient (r) was indicated by different colors, and the legend was located on the right side; * indicated 0.01<P≤0.05, ** indicated 0.001<P≤0.01.

4 结论

① 饲粮中添加中草药复合制剂对乳中高SCC奶牛产奶量、乳成分和营养物质表观消化率没有显著影响,但能降低乳中SCC。
② 饲粮中添加中草药提取物复合制剂提高了乳中高SCC奶牛免疫功能。
③ 饲粮中添加中草药提取物复合制剂能够降低乳中高SCC奶牛瘤胃放线菌门、Succinivibrionaceae_UCG-001和Ruminococcus_gauvreauii_group比例,提高瘤胃Prevotellaceae_UCG-001比例。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序
[1]
CASTELANI L, ARCARO J R P, BRAGA J E P, et al. Short communication:activity of nisin,lipid bilayer fragments and cationic nisin-lipid nanoparticles against multidrug-resistant Staphylococcus spp. isolated from bovine mastitis[J]. Journal of Dairy Science, 2019, 102(1):678-683.

DOI

[2]
HEIKKILÄ A M, LISKI E, PYÖRÄLÄ S, et al. Pathogen-specific production losses in bovine mastitis[J]. Journal of Dairy Science, 2018, 101(10):9493-9504.

DOI PMID

[3]
WHITE D G, MCDERMOTT P F. Emergence and transfer of antibacterial resistance[J]. Journal of Dairy Science, 2001, 84(Suppl):E151-E155.

[4]
LHERMIE G, GRÖHN Y T, RABOISSON D. Addressing antimicrobial resistance:an overview of priority actions to prevent suboptimal antimicrobial use in food-animal production[J]. Frontiers in Microbiology, 2017, 7:2114.

[5]
OHNO T, KITA M, YAMAOKA Y, et al. Antimicrobial activity of essential oils against Helicobacter pylori[J]. Helicobacter, 2003, 8(3):207-215.

DOI

[6]
DOMADIA P, SWARUP S, BHUNIA A, et al. Inhibition of bacterial cell division protein FtsZ by cinnamaldehyde[J]. Biochemical Pharmacology, 2007, 74(6):831-840.

DOI PMID

[7]
JUNGBAUER A, MEDJAKOVIC S. Anti-inflammatory properties of culinary herbs and spices that ameliorate the effects of metabolic syndrome[J]. Maturitas, 2012, 71(3):227-239.

DOI PMID

[8]
KHIAOSA-ARD R, ZEBELI Q. Meta-analysis of the effects of essential oils and their bioactive compounds on rumen fermentation characteristics and feed efficiency in ruminants[J]. Journal of Animal Science, 2013, 91(4):1819-1830.

DOI

[9]
OH J, HRISTOV A N. Effects of plant-derived bio-active compounds on rumen fermentation,nutrient utilization,immune response,and productivity of ruminant animals[M]// JELIAZKOVV D, CANTRELLC L. Medicinal and aromatic crops: production,phytochemistry,and utilization.Washington,D.C.: American Chemical Society, 2016:167-186.

[10]
WALL E H, DOANE P H, DONKIN S S, et al. The effects of supplementation with a blend of cinnamaldehyde and eugenol on feed intake and milk production of dairy cows[J]. Journal of Dairy Science, 2014, 97(9):5709-5717.

DOI PMID

[11]
TUZIKOV R, NURZHANOV B, RYSAEFF A, et al. PSXV-7 the mixture of herbal extracts that change the microbiome of the cattle rumen[J]. Journal of Animal Science, 2021, 99(Supplement_3):261-262.

[12]
OLAGARAY K E, BROUK M J, MAMEDOVA L K, et al. Dietary supplementation of Scutellaria baicalensis extract during early lactation decreases milk somatic cells and increases whole lactation milk yield in dairy cattle[J]. PLoS One, 2019, 14(1):e0210744.

DOI

[13]
赵国玲, 刘佳佳, 林丹, 等. 金银花化学成分及药理研究进展[J]. 中成药, 2002, 24(12):973-976.

ZHAO G L, LIU J J, LIN D, et al. Studies on the chemical constituents in Flos lonicerae[J]. Chinese Traditional Patent Medicine, 2002, 24(12):973-976. (in Chinese)

[14]
洪金锁, 闵继光, 刘建雷. 中草药添加剂(蒲公英流浸膏)对奶牛乳房炎及其生产性能的影响[J]. 当代畜牧, 2018(6):13-17.

HONG J S, MIN J G, LIU J L. Effect of herbal additive (dandelion fluid infusion) on mastitis and its production performance in dairy cows[J]. Contemporary Animal Husbandry, 2018(6):13-17. (in Chinese)

[15]
周艳, 张涛, 郑勤琴, 等. 连翘有效成分提取及提取物对奶牛乳房炎致病菌的抑制效果[J]. 生物技术进展, 2014, 4(4):292-295,305.

ZHOU Y, ZHANG T, ZHENG Q Q, et al. Extracting active components of Forsythia suspensa and the extract’s inhibitory effect on cow mastitis pathogens[J]. Current Biotechnology, 2014, 4(4):292-295,305. (in Chinese)

[16]
郭希萍, 纪新花, 张燕, 等. 益母草在奶牛产科病中的应用[J]. 中国牛业科学, 2015, 41(4):98.

GUO X P, JI X H, ZHANG Y, et al. The use of motherwort in dairy cows with obstetric disease[J]. China Cattle Science, 2015, 41(4):98. (in Chinese)

[17]
中国国家市场监督管理总局, 中国国家标准化管理委员会. 饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法:GB/T 6432—2018[S]. 北京: 中国标准出版社, 2018.

State Administration for Market Regulation, Standardization Administration of the People’s Republic of China. Determination of crude protein in feeds—Kjeldahl method:GB/T 6432—2018[S]. Beijing: Standards Press of China, 2018. (in Chinese)

[18]
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. 饲料中粗脂肪的测定:GB/T 6433—2006[S]. 北京: 中国标准出版社, 2006.

General Administration of Quality Supervision,Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China, Standardization Administration of the People’s Republic of China. Determinaiion of crude fat in feeds:GB/T 6433—2006[S]. Beijing: Standards Press of China, 2006. (in Chinese)

[19]
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. 饲料中中性洗涤纤维(NDF)的测定:GB/T 20806—2006[S]. 北京: 中国标准出版社, 2007.

General Administration of Quality Supervision,Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China, Standardization Administration of the People’s Republic of China. Determination of neutral detergent fiber in feedstuffs:GB/T 20806—2006[S]. Beijing: Standards Press of China, 2007. (in Chinese)

[20]
中华人民共和国农业部. 饲料中酸性洗涤纤维的测定:NY/T 1459—2007[S]. 北京: 农业出版社, 2008.

Ministry of Agriculture of the PRC. Determination of acid detergent fiber in feedstuff (ADF):NY/T 1459—2007[S]. Beijing: Agricultural Publishing House, 2008. (in Chinese)

[21]
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. 饲料中粗灰分的测定:GB/T 6438—2007[S]. 北京: 中国标准出版社, 2007.

General Administration of Quality Supervision,Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China, Standardization Administration of the People’s Republic of China. Animal feeding stuffs—determination of crude ash:GB/T 6438—2007[S]. Beijing: Standards Press of China, 2007. (in Chinese)

[22]
中国国家市场监督管理总局, 中国国家标准化管理委员会. 饲料中钙的测定:GB/T 6436—2018[S]. 北京: 中国标准出版社, 2018.

State Administration for Market Regulation, Standardization Administration of the People’s Republic of China. Determination of calcium in feeds:GB/T 6436—2018[S]. Beijing: Standards Press of China, 2018. (in Chinese)

[23]
中国国家市场监督管理总局, 中国国家标准化管理委员会. 饲料中总磷的测定分光光度法:GB/T 6437—2018[S]. 北京: 中国标准出版社, 2018.

State Administration for Market Regulation, Standardization Administration of the People’s Republic of China. Determination of phosphorus in feeds—spectrophotometry:GB/T 6437—2018[S]. Beijing: Standards Press of China, 2018. (in Chinese)

[24]
HASHEMZADEH-CIGARI F, KHORVASH M, GHORBANI G R, et al. Effects of supplementation with a phytobiotics-rich herbal mixture on performance,udder health,and metabolic status of Holstein cows with various levels of milk somatic cell counts[J]. Journal of Dairy Science, 2014, 97(12):7487-7497.

DOI

[25]
SCHUKKEN Y H, WILSON D J, WELCOME F, et al. Monitoring udder health and milk quality using somatic cell counts[J]. Veterinary Research, 2003, 34(5):579-596.

DOI PMID

[26]
SCHWARZ D, KLEINHANS S, REIMANN G, et al. Investigation of dairy cow performance in different udder health groups defined based on a combination of somatic cell count and differential somatic cell count[J]. Preventive Veterinary Medicine, 2020, 183:105123.

DOI

[27]
RASHMI H B, NEGI P S. Phenolic acids from vegetables:a review on processing stability and health benefits[J]. Food Research International, 2020, 136:109298.

DOI

[28]
RICE-EVANS C A, MILLER N J, PAGANGA G. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids[J]. Free Radical Biology and Medicine, 1996, 20(7):933-956.

DOI

[29]
钟华晨, 王丽芳, 张三粉, 等. 复合植物水提物对奶牛乳房炎致病菌的体外抑制效果[J]. 饲料工业, 2020, 41(18):17-22.

ZHONG H C, WANG L F, ZHANG S F, et al. In vitro inhibitory effect of compound plant water extract on pathogenic bacteria of dairy cow mastitis[J]. Feed Industry, 2020, 41(18):17-22. (in Chinese)

[30]
LEAL A E B P, DE OLIVEIRA A P, SANTOS R F D, et al. Determination of phenolic compounds, in vitro antioxidant activity and characterization of secondary metabolites in different parts of Passiflora cincinnata by HPLC-DAD-MS/MS analysis[J]. Natural Product Research, 2020, 34(7):995-1001.

DOI

[31]
侯昆, 童津津, 楚康康, 等. 竹叶黄酮与青蒿提取物对患隐性乳房炎奶牛产奶性能、乳中体细胞数及血清免疫和抗氧化相关指标的影响[J]. 动物营养学报, 2019, 31(9):4286-4295.

HOU K, TONG J J, CHU K K, et al. Effects of bamboo leaf flavonoids and Artemisia annua extract on milk performance,milk somatic cell count and serum immune and antioxidant related indexes of dairy cows with subclinical mastitis[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2019, 31(9):4286-4295. (in Chinese)

[32]
占今舜, 苏效双, 刘明美, 等. 日粮中添加苜蓿黄酮对奶牛血液生化指标、抗氧化性能和免疫的影响[J]. 中国农业大学学报, 2017, 22(5):66-74.

ZHAN J S, SU X S, LIU M M, et al. Effects of diet added alfalfa flavonoids on blood biochemical indexes,oxidation resistance and immunity of dairy cow[J]. Journal of China Agricultural University, 2017, 22(5):66-74. (in Chinese)

[33]
ZHONG Y F, XUE M Y, LIU J X. Composition of rumen bacterial community in dairy cows with different levels of somatic cell counts[J]. Frontiers in Microbiology, 2018, 9:3217.

DOI PMID

[34]
HU X Y, LI S, MU R Y, et al. The rumen microbiota contributes to the development of mastitis in dairy cows[J]. Microbiology Spectrum, 2022, 10(1):e0251221.

DOI

[35]
WAN X Z, AI C, CHEN Y H, et al. Physicochemical characterization of a polysaccharide from green microalga Chlorella pyrenoidosa and its hypolipidemic activity via gut microbiota regulation in rats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2020, 68(5):1186-1197.

DOI

[36]
XU T, GE Y M, DU H, et al. Berberis kansuensis extract alleviates type 2 diabetes in rats by regulating gut microbiota composition[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2021, 273:113995.

DOI

[37]
HOLMAN D B, GZYL K E. A meta-analysis of the bovine gastrointestinal tract microbiota[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2019, 95(6):fiz072.

DOI

Options
文章导航

/

〈 〉

    联系我们

  • 地址：北京市海淀区圆明园西路2号
    　　　中国农业大学动科动医大楼153室
  • 邮编：100193
  • 电话：010－62817823
  • 网址：http://www.chinajan.com
  • E-mail：cjan@chinajan.com
京公网安备 11010802041926号    京ICP备17050989号-2