动物营养学报 >

2023 , Vol. 35 >Issue 1: 611 - 622

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1006-267x.2023.01.058

研究论文

饲粮中添加壳寡糖对犬营养物质表观消化率、抗氧化能力和肠道菌群的影响

  • 杨晓斌 , 1, 2 ,
  • 李瑞国 2, 3 ,
  • 妥强 1, 2 ,
  • 石柏灌 4 ,
  • 杨慧超 1, 2 ,
  • 高巧仙 2, 3 ,
  • 李荣林 5 ,
  • 辛国省 , 2, 3, *
展开
  • 1 宁夏大学农学院,银川 750021
  • 2 宁夏饲料工程技术研究中心,银川 750021
  • 3 宁夏大学生命科学学院,银川 750021
  • 4 宁夏昊标检测服务研究院,银川 750021
  • 5 佩蒂动物营养科技股份有限公司,温州 325405
* 辛国省,教授,博士生导师,E-mail:

杨晓斌(1994—),男,宁夏同心人,硕士研究生,从事动物营养调控与饲料资源开发利用的研究。E-mail:

收稿日期: 2022-07-07

  网络出版日期: 2023-01-11

基金资助

企业委托项目“壳寡糖在犬猫食品中的应用开发”(2022004089011)

收起

Effects of Dietary Supplementing Chitooligosaccharide on Nutrient Apparent Digestibility, Antioxidant Capacity and Intestinal Microflora of Dogs

  • YANG Xiaobin , 1, 2 ,
  • LI Ruiguo 2, 3 ,
  • TUO Qiang 1, 2 ,
  • SHI Baiguan 4 ,
  • YANG Huichao 1, 2 ,
  • GAO Qiaoxian 2, 3 ,
  • LI Ronglin 5 ,
  • XIN Guosheng , 2, 3, *
Expand
  • 1 College of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
  • 2 Ningxia Feed Engineering Technology Research Center, Yinchuan 750021, China
  • 3 College of Life Sciences, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
  • 4 Ningxia Hiby Testing Service Research Institute, Yinchuan 750021, China
  • 5 Patty Animal Nutrition Technology Co., Ltd., Wenzhou 325405, China
* professor, E-mail:

Received date: 2022-07-07

  Online published: 2023-01-11

Fold

摘要

本试验旨在研究饲粮中添加壳寡糖(COS)对犬营养物质表观消化率、血清生化指标、抗氧化能力及肠道菌群的影响。试验选取1~2岁、体重[(5.64±0.26) kg]相近的成年雄性泰迪犬18只,随机分为3组,每组6个重复。各组在基础饲粮中分别添加0(对照组)、1(COS1组)、5 g/kg(COS5组)的壳寡糖。预试期15 d,正试期30 d。结果表明:1)饲粮中添加1 g/kg的COS对犬各营养物质表观消化率均无显著影响(P>0.05);与对照组相比,添加5 g/kg的COS显著增加了犬对粗脂肪表观消化率(P<0.05),对其他营养物质表观消化率无显著影响(P>0.05)。2)与对照组相比,饲粮中添加COS显著提高了犬血清总抗氧化能力(T-AOC)(P<0.05)且COS5组显著高于COS1组(P<0.05),对谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)与超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量无显著影响(P>0.05)。3)与对照组相比,饲粮中添加1 g/kg的COS对犬血清生化指标均无显著影响(P>0.05);添加5 g/kg的COS显著增加了犬血清总蛋白的含量(P<0.05),对其他血清生化指标无显著影响(P>0.05)。4)与对照组相比,饲粮中添加COS对α多样性指数均无显著影响(P>0.05)。在门水平,与对照组相比,添加COS均显著降低了犬肠道放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度(P<0.05)且COS5组显著低于COS1组(P<0.05)。此外,与对照组相比,添加5 g/kg的COS显著提高了厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度(P<0.05)。在属水平,与对照组相比,添加COS均显著降低了犬肠道拟杆菌属(Bacteroides)和柯林斯氏菌属(Collinsella)的相对丰度(P<0.05)且COS5组柯林斯氏菌属的相对丰度显著低于COS1组(P<0.05)。综上所述,饲粮中添加COS可一定程度上改善犬营养物质表观消化率,提高犬的抗氧化能力和免疫力,对肠道菌群的组成也有积极的调节作用。

关键词： 壳寡糖; 犬; 抗氧化能力; 血清生化指标; 肠道菌群

本文引用格式

杨晓斌 , 李瑞国 , 妥强 , 石柏灌 , 杨慧超 , 高巧仙 , 李荣林 , 辛国省 . 饲粮中添加壳寡糖对犬营养物质表观消化率、抗氧化能力和肠道菌群的影响[J]. 动物营养学报, 2023 , 35(1) : 611 -622 . DOI: 10.3969/j.issn.1006-267x.2023.01.058

Abstract

This experiment was conducted to investigate the effects of dietary supplementing chitooligosaccharide on nutrient apparent digestibility, serum biochemical indices, antioxidant capacity and intestinal microflora of dogs. Eighteen adult male teddy dogs aged 1 to 2 years with similar body weight (5.64±0.26) kg were randomly divided into 3 groups with 6 dogs in each group. The basal diet was supplemented with 0 (control group), 1 g/kg (COS1 group) and 5 g/kg (COS5 group) chitooligosaccharide, respectively. The pre-trial period lasted for 15 days and the formal trial period lasted for 30 days. The results showed as follows: 1) compared with control group, dietary 1 g/kg COS had no significant effects on the apparent digestibility of each nutrient (P>0.05), 5 g/kg COS significantly increased the apparent digestibility of ether extract in dogs (P<0.05), but had no significant effects on the apparent digestibility of other nutrients (P>0.05). 2) Compared with control group, dietary COS supplementation significantly increased serum total antioxidant capacity (P<0.05), but had no significant effects on glutathione peroxidase, superoxide dismutase activity and malondialdehyde content (P>0.05). 3) Compared with control group, dietary 1 g/kg COS had no significant effects on serum biochemical indexes of dogs (P>0.05), 5 g/kg COS significantly increased the content of serum total protein (P<0.05), but had no significant effects on other biochemical indexes (P>0.05).4) Compared with control group, dietary COS had no significant effects on alpha diversity index (P>0.05). At phylum level, different levels of COS significantly decreased the relative abundance of intestinal Actinobacteria in dogs (P<0.05), and COS5 group was significantly lower than COS1 group (P<0.05). In addition, 5 g/kg COS significantly increased the relative abundance of Firmicutes (P<0.05). At genus level, different levels of COS significantly reduced the relative abundance of dog intestinal Bacteroides and Collinsella (P<0.05), and the relative abundance of Collinsella in COS5 group was significantly lower than that in COS1 group (P<0.05). In conclusion, dietary COS can improve nutrient apparent digestibility of dogs to a certain extent, increase antioxidant function and immunity of dog’s serum, and regulate intestinal microflora structure to a certain extent.

Key words： chitooligosaccharide; dog; antioxidant capacity; serum biochemical indices; intestinal microflora

随着经济的发展、人类生活水平的提高和人口老龄化问题的加剧等,宠物犬的需求大幅度增加。传统的犬粮可能会造成宠物犬肥胖、糖尿病、结石等代谢疾病的频繁发生,严重威胁犬的健康。因此,功能性食品开发对犬的生长、健康以及养殖有着重要的意义。壳寡糖(chitooligosaccharide,COS),学名为寡糖,又名葡萄糖胺寡糖,由2~10个氨基葡糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的低聚糖[1]。由自然界中广泛存在于节肢动物和昆虫的外骨骼以及真菌细胞壁中的甲壳素[2]、几丁质[3]与壳聚糖[4]不同程度地脱乙酰和水解得到。COS具有水溶性、无细胞毒性、易被肠道吸收等特点[5]。Walsh等[6]研究发现,饲料中添加COS能显著提升仔猪营养物质表观消化率并显著提高肠道乳酸菌的数量,并显著降低大肠杆菌的数量。苏维发等[7]研究发现,生长育肥猪饲粮中添加COS能显著增强机体的免疫功能。齐敬宇等[8]研究发现,COS可抑制脂多糖诱导奶牛外周血单个核细胞的抗氧化酶活性。温佳颖等[9]研究发现,COS对肠道致病菌有良好的抑制作用。Osho等[10]研究表明,添加1 g/kg的COS能提高地塞米松胁迫下肉鸡的营养物质表观消化率和抗氧化能力。Zhang等[11]研究发现,泥鳅饲料中添加COS能显著提高血清抗氧化酶与肠道消化酶的活性且添加量由1 g/kg增加到5 g/kg时肠道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性呈先增后降的趋势。除此之外,COS还具有抗菌[12]、抗肿瘤[13]、抗炎[2]等多种生物学活性。在医学[14]、食品[15]、农业[16]等领域中得到了较为广泛应用。目前国内外对COS在宠物上的相关研究报道较为罕见。因此,本研究基于COS的良好应用前景,以1~2岁成年雄性泰迪为对象,旨在探究不同添加量下的COS对成年犬营养物质表观消化率、免疫力与抗氧化能力的影响及对肠道菌群的调节作用,评价其对宠物犬的益生作用,确定COS的适宜添加量,为COS在犬功能性食品的科学应用提供理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

COS,聚合度为2~10,分子质量≤2 000 Da,脱乙酰度90%,纯度80%。

1.2 试验动物与试验设计

试验选用1~2岁、体重[(5.64±0.26 ) kg]相近的成年雄性泰迪试验犬18只(犬只来自宠物犬养殖场),采用单因子完全随机试验设计,随机分为3组,每组6个重复,其中对照组饲喂基础饲粮,不添加COS,COS1组在每千克基础饲粮中添加1 g的COS,COS5组在每千克基础饲粮中添加5 g的COS。试验期45 d,其中预试期15 d,正试期30 d。

1.3 试验饲粮

参照NRC(2006)[17]犬猫营养需要、成年犬维持营养需要量配制基础饲粮,其组成及营养水平见表1。
表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

项目Items 含量Content
原料Ingredients
鸡骨粉Chicken bone meal 10.20
鸡肉粉Chicken powder 11.82
鸡肝粉Chicken liver powder 1.00
玉米粉Corn flour 18.95
小麦粉Wheat flour 20.04
燕麦粉Oatmeal 22.99
酵母提取物Yeast extract 1.00
鸡油Chicken oil 5.00
大豆油Soybean oil 5.00
预混料Premix1) 4.00
合计Total 100.00
营养水平Nutrient levels2)
粗蛋白质CP 25.46
粗脂肪EE 14.04
粗纤维CF 2.02
灰分Ash 3.08
钙Ca 1.09
磷P 0.73
代谢能ME/(MJ/kg) 16.44

1)每千克预混料含有 One kg premix containted:Fe 1 500 mg,Cu 300 mg,Zn 3 000 mg,Mn 240 mg,I 44 mg,Se 17.5 mg,VE 1 500 IU,VA 227 250 IU,VD3 27 600 IU,VB1 112.5 mg,VB3 850 mg,VB2 262.5 mg,VB6 75 mg,VB4 85 mg,VB12 1.75 mg,Ca 19 000 mg,Na 40 000 mg,Cl 60 000 mg,Mg 30 000 mg。

2)代谢能为计算值,其余为实测值。ME was a calculated value, while the others were measured values.

1.4 饲养管理

试验犬采用单笼饲养,自由饮水。试验开始前对犬笼全面清洗、消毒,对试验犬按常规程序进行防疫、驱虫。试验期间定期对试验场所进行清扫,消毒。于每天08:00、16:00进行饲喂,饲喂量按年轻成年试验犬每日维持代谢能需要[ME(MJ/d)=140×BW0.75/239]确定。

1.5 样品采集

1.5.1 粪样采集

试验结束前7 d采用全粪法收集粪样。挑拣毛发及杂物,将每天收集的粪便样本称重后,取总量的10%,装入自封袋中,加10%的硫酸混匀后置于-20 ℃冰箱冷冻保存。待粪样收集完成后,将7 d的粪样混匀,于105 ℃烘干,冷却后粉碎,过40目筛,装入样品袋保存,待测。

1.5.2 血样采集

试验最后1 d采用臂前静脉采血。用不含抗凝剂的5 mL采血管采集血样4 mL,2份。室温静置30 min,将采血管放入离心机内,4 ℃条件下3 000 r/min离心15 min,取上清装于1.5 mL离心管,保存于-80 ℃备用。

1.5.3 肠道内容物等样品采样

在试验最后1 d,用无菌直肠棉拭子经生理盐水湿润后旋转插入肛门,收集粪便,插入无菌冻存管内,放入液氮罐中保存,用于肠道菌群结构检测。

1.6 指标测定

1.6.1 营养物质表观消化率的测定

测定指标包括干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、钙(Ca)和磷(P),其含量按照杨胜[18]主编的《饲料分析及饲料质量检测技术》中的方法进行测定。营养物质表观消化率的计算公式如下:
营养物质表观消化率(%)=[(营养物质的摄入量-营养物质的排出量)/营养物质的摄入量]×100。

1.6.2 血清生化指标的测定

将制备的血清送于宁夏迪安乐嘉医学检验中心(有限公司)进行血清生化指标的测定,主要指标包括干扰素-γ(IFN-γ)、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TC)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、球蛋白(GLB)、白蛋白(ALB)与总蛋白(TP)的含量。

1.6.3 血清抗氧化指标的测定

将制备好的血清送往宁夏昊标检测服务研究院,进行血清抗氧化指标的测定。指标包括总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性以及丙二醛(MDA)的含量。

1.6.4 肠道菌群的测定

将冻存管中的粪样置于干冰中,送于北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行16SrDNA V3~V4区测序和生物信息学分析。

1.7 数据统计与分析

利用Excel 2021软件进行数据初步整理,采用SPSS 23.0统计软件进行单因素方差分(one-way ANOVA),并进行Duncan氏法多重比较,结果以平均值±标准误表示,P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 COS对犬营养物质表观消化率的影响

由表2可知,与对照组相比,饲粮中添加1 g/kg的COS对各营养物质表观消化率均无显著影响(P>0.05),添加5 g/kg的COS显著增加了犬对EE的表观消化率(P<0.05),对其他营养物质表观消化率无显著影响(P>0.05)。
表2 COS对犬营养物质表观消化率的影响

Table 2 Effects of COS on apparent digestibility of nutrients of dogs%

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
对照Control COS1 COS5
干物质DM 93.73±0.21 95.00±0.52 95.27±0.69 0.131
粗蛋白质CP 91.68±0.25 92.95±0.65 93.74±1.04 0.184
粗脂肪EE 98.57±0.06a 98.87±0.09ab 99.16±0.13b 0.006
钙Ca 34.39±2.39 45.44±6.13 45.38±7.96 0.363
磷P 47.93±1.81 50.81±5.69 58.40±5.15 0.293

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 COS对犬血清抗氧化能力的影响

由表3可知,与对照组相比,饲粮中添加COS显著提高了血清T-AOC(P<0.05)且COS5组显著高于COS1组(P<0.05),其中COS1组较对照组提升了23.48%,COS5组较对照组提高了37.95%,COS5组较COS1组提高了18.35%;饲粮中添加COS对血清GSH-Px与SOD活性及MDA的含量没有显著影响(P>0.05)。
表3 COS对犬血清抗氧化能力的影响

Table 3 Effects of COS on serum antioxidant capacity of dogs

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
对照Control COS1 COS5
总抗氧化能力T-AOC/(U/mL) 4.77±0.11a 5.56±0.16b 6.58±0.08c <0.001
超氧化物歧化酶SOD/(U/mL) 15.69±0.24 15.41±1.08 15.93±0.38 0.862
丙二醛MDA/(nmol/mL) 7.05±0.35 7.48±0.74 6.90±0.56 0.806
谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px/(U/mL) 1 563.10±36.90 1 641.55±17.10 1 634.83±27.60 0.143

2.3 COS对犬血清生化指标的影响

由表4可知,与对照组相,饲粮中添加1 g/kg的COS对犬血清生化指标均无显著影响(P>0.05),添加5 g/kg的COS显著增加了犬血清总蛋白的含量(P<0.05),对其他血清生化指标无显著影响(P>0.05)。
表4 COS对犬血清生化指标的影响

Table 4 Effects of COS on serum biochemical indices of dogs

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
对照Control COS1 COS5
干扰素-γ IFN-γ/(g/L) 24.94±1.54 28.14±1.61 26.12±2.30 0.487
葡萄糖GLU/(mmol/L) 5.02±0.25 4.83±0.15 4.50±0.27 0.300
总胆固醇TC/(mmol/L) 5.67±0.87 5.70±0.67 5.25±0.25 0.871
低密度脂蛋白胆固醇LDL-C/(mmol/L) 0.91±0.36 0.99±0.30 0.64±0.09 0.663
免疫球蛋白G IgG/(g/L) 3.91±0.17 3.76±0.25 4.06±0.28 0.694
免疫球蛋白M IgM/(g/L) 1.04±0.15 1.12±0.14 1.30±0.18 0.497
球蛋白GLB/(g/L) 20.80±0.70 21.88±0.76 22.51±1.10 0.426
白蛋白ALB/(g/L) 34.64±0.97 37.12±2.10 38.52±1.48 0.248
甘油三酯TG/(g/L) 0.57±0.06 0.83±0.13 0.67±0.05 0.173
总蛋白TP/(g/L) 55.44±0.75a 59.00±2.04ab 61.03±1.25b 0.045

2.4 COS对犬肠道菌群结构的影响

2.4.1 测序数据的处理、序列聚类及物种注释情况

基于Illumina Nova测序平台测序,构建PCR-free文库,然后进行双末端(paired-end)测序。通过对reads拼接,平均每个样品测得102 703条tags,经过质控,平均得到98 209条有效数据,质控有效数据量达65 074,质控有效率达63.39%,结果如表5所示。以97%的一致性(identity)将序列聚类成为操作分类单元(OTUs),共得到1 393个OTUs,然后对OTUs序列与Silva138数据库进行物种注释。注释结果中,共有671个(48.17%)OTUs注释到属水平。
表5 测序数据预处理

Table 5 Preprocessing of sequencing data

项目
Items		 组别Groups 平均值
Mean
对照Control COS1 COS5
Raw PE 101 912 102 999 103 198 102 703
Raw Tags 97 656 99 229 97 739 98 209
Clean Tags 95 066 96 603 94 612 95 427
Effective Tags 64 775 64 484 65 964 65 074
Q20 98.54 98.59 98.40 98.51
Q30 95.14 95.27 94.79 95.07
GC/% 50.41 50.25 50.28 50.31
Effective/% 63.55 62.65 63.97 63.39

Raw PE表示原始下机的PE reads;Raw Tags是拼接得到的Tags序列;Clean Tags是Raw Tags过滤低质量和短长度后的序列;Effective Tags是过滤嵌合体后,最终用于后续分析的Tags序列;Q20和Q30是Effective Tags中碱基质量值大于20(测序错误率小于1%)和30(测序错误率小于1 g/kg)的碱基所占的百分比;GC表示Effective Tags中GC碱基的含量;Effective表示Effective Tags的数目与Raw PE数目的百分比。

Raw PE indicates original PE reads; raw Tags are spliced sequences of Tags; clean Tags are Raw Tags that filter low quality and short length sequences; Effective Tags is the sequence of Tags that are finally used for subsequent analysis after filtering chimeras. Q20 and Q30 are the percentages of bases with base quality values greater than 20 (sequencing error rate less than 1%) and 30 (sequencing error rate less than 1 g/kg) in Effective Tags. GC represents the content of GC bases in Effective Tags; Effective represents the percentage of the number of Effective Tags to the number of Raw PES.

2.4.2 Alpha多样性指数

对不同样本在97%一致性阈值下的Alpha多样性分析指数进行统计分析。由表6可知,各组粪便菌群测序覆盖均在0.999以上,说明得到的OTUs序列对于试验结果具有代表性。各组间Observed species、Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数差异不显著(P>0.05),说明饲粮中添加COS对犬肠道菌群组成的物种丰富度和物种多样性无显著影响。
表6 Alpha多样性指数

Table 6 Alpha diversity indexes

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
对照Control COS1 C0S5
观察物种数Observed species 323.00±60.13 241.67±21.63 365.50±12.34 0.092
Shannon指数Shannon index 4.01±0.17 3.95±0.17 4.28±0.16 0.328
Simpson指数Simpson index 0.82±0.03 0.81±0.02 0.85±0.02 0.504
Chao1指数Chao1 index 340.10±64.15 257.72±23.23 394.70±12.23 0.082
ACE指数ACE index 347.90±64.94 262.60±24.53 404.64±11.91 0.075
覆盖率Goods coverage 0.999 5 0.999 5 0.999 0

2.4.3 物种多样性曲线

以抽取的测序数据量与对应的物种(OTUs)数来构建组别稀释曲线图,如图1所示。以OTUs的排序编号与OTUs中的相对丰度绘制成等级聚类曲线,如图2所示。由图1可知,各组在测序量为1 000时出现明显转折,曲线均趋于平缓,说明测序深度已满足试验需求。由图2可知,各组OTUs中的相对丰度在10-4以下时,曲线趋于平缓,说明测序数据量已趋于合理,物种分布比较均匀。
图1 稀释曲线

横坐标为从某个样本中随机抽取的测序条数,纵坐标为基于该测序条数能构建的OTUs数量,用来反映测序深度情况,不同组用不同颜色的曲线表示。

Fig.1 Rarefaction curve

The horizontal coordinate is the number of sequencing lines randomly selected from a sample, and the vertical coordinate is the number of OTUs that can be constructed based on the number of sequencing lines to reflect the sequencing depth. Different groups are represented by curves of different colors.

图2 等级聚类曲线

横坐标为按OTUs丰度排序的序号,纵坐标为对应的OTUs的相对丰度,用来反映样本中物种的丰富度和均匀度,不同的组用不同的颜色的折线表示。

Fig.2 Rank abundance curve

The horizontal coordinate is the serial number sorted by OTUs abundance, and the vertical coordinate is the relative abundance of corresponding OTUs, which is used to reflect the richness and evenness of species in the sample. Different groups are indicated by broken lines of different colors.

2.4.4 物种分布情况

2.4.4.1 门水平粪便菌群结构组分分析

选取各组在门水平上相对丰度排名前10的物种,生成物种相对丰度柱形累加图。如图3所示,本试验条件下,犬粪便菌群相对丰度前10的菌群由梭杆菌门(Fusobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、未鉴定菌门(unidentified_Bacteria)、脱氧杆菌门(Deferribacteres)、螺旋体门(Spirochaetota)、酸杆菌门(Acidobacteriota)、绿湾菌门(Chloroflexis)组成。由表7可知,相对丰度大于1%的优势菌群有5个:梭杆菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门。占主导地位的物种有梭杆菌门、厚壁菌门、拟杆菌门,占前10物种总体的90%以上。在门水平,与对照组相比,添加COS均显著降低了犬肠道放线菌门的相对丰度(P<0.05)且COS5组显著低于COS1组(P<0.05);此外,添加5 g/kg的COS显著提高了厚壁菌门的相对丰度(P<0.05)。对照组与试验组之间绿湾菌门的相对丰度差异不显著(P>0.05),但COS1组显著低于COS5组(P<0.05),相对于COS5组降低了83.33%。
图3 门水平物种相对丰度

Fusobacteriota:梭杆菌门;Firmicutes:厚壁菌门;Bacteroidota:拟杆菌门;Actinobacteriota:放线菌门;Proteobacteria:变形菌门;Unidentified_Bacteria:未鉴定菌门;Deferribacteres:脱氧杆菌门;Spirochaetota:螺旋体门;Acidobacteriota:酸杆菌门;Chloroflexi:绿湾菌门;Others:其他。

Fig.3 Relative abundance of phylum level species

表7 门水平相对丰度

Table 7 Relative abundance of phylum levels %

门
Phylum		 组别Groups P值
P-value
对照Control COS1 COS5
梭杆菌门Fusobacteriota 40.31±4.44 42.46±3.66 35.29±3.66 0.483
厚壁菌门Firmicutes 16.39±2.51a 27.61±6.05ab 33.87±6.05b 0.041
拟杆菌门Bacteroidota 35.95±3.37 25.85±2.56 27.85±2.56 0.092
放线菌门Actinobacteriota 4.85±0.57a 2.14±0.86b 0.32±0.86c 0.000
变形菌门Proteobacteria 1.37±0.46 0.97±0.20 1.48±0.20 0.558
未鉴定菌门Unidentified_Bacteria 0.67±0.15 0.54±0.11 0.54±0.11 0.609
脱氧杆菌门Deferribacteres 0.01±0.01 0.11±0.09 0.02±0.09 0.344
螺旋体门Spirochaetota 0.01±0.01 0.07±0.06 0.01±0.06 0.364
酸杆菌门Acidobacteriota 0.07±0.04 0.02±0.01 0.10±0.01 0.151
绿湾菌门Chloroflexi 0.03±0.02ab 0.02±0.01a 0.12±0.01b 0.002
其他Others 0.34±0.06 0.22±0.06 0.41±0.06 0.067

2.4.4.2 属水平粪便菌群结构组分分析

选取各组在属水平上相对丰度排名前10的物种,生成物种相对丰度柱形累加图。如图4所示,犬粪便中属水平相对丰度前10的菌群有:梭菌属(Fusobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、乳杆菌属(Lactobacillus)、艰难梭菌属(Peptoclostridium)、拟普氏菌属(Alloprevotella)、布劳特氏菌属(Blautia)、普氏菌属(Prevotella)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、副杆菌属(Parabacteroides)、柯林斯氏菌属(Collinsella)。由表8可知,占主导地位的主要有梭菌属、拟杆菌属,占前10物种的50%左右。在属水平,与对照组相比,添加COS均显著降低了犬肠道拟杆菌属和柯林斯氏菌属相对丰度(P<0.05)且柯林斯氏菌属相对丰度在COS5组显著低于COS1组(P<0.05)。其中COS1组拟杆菌属相对丰度较对照组降低了37.93%,COS5组较对照组降低了35.42%,COS1组柯林斯氏菌属相对丰度较对照组降低了55.50%,COS5组较对照组降低了97.25%且COS5组相较于COS1组降低了93.81%。
图4 属水平物种相对丰度

Fusobacterium:梭菌属;Bacteroides:拟杆菌属;Lactobacillus:乳杆菌属;Peptoclostridium:艰难梭菌属;Alloprevotella:拟普氏菌属;Blautia:布劳特氏菌属;Prevotella:普氏菌属;Phascolarctobacterium:考拉杆菌属;Parabacteroides:副杆菌属;Collinsella:柯林斯氏菌属;Others:其他。

Fig.4 Relative abundance of genus level species

表8 属水平相对丰度

Table 8 Relative abundance of genus levels %

属
Genus		 组别Groups P值
P-value
对照组Control COS1 COS5
梭菌属Fusobacterium 37.59±4.09 40.83±3.42 33.61±4.38 0.457
拟杆菌属Bacteroides 22.70±2.42a 14.09±1.49b 14.66±2.68b 0.028
乳杆菌属Lactobacillus 0.65±0.45 3.00±2.70 8.11±4.76 0.267
艰难梭菌属Peptoclostridium 1.37±0.28 5.90±1.96 5.36±1.88 0.119
拟普氏菌属Alloprevotella 3.16±1.86 2.85±0.96 3.44±1.39 0.961
布劳特氏菌属Blautia 1.04±0.19 4.16±1.50 3.88±1.08 0.108
普氏菌属Prevotella 1.51±0.67 0.89±0.31 2.98±0.91 0.112
考拉杆菌属Phascolarctobacterium 3.60±0.89 3.59±0.73 3.04±0.65 0.839
副杆菌属Parabacteroides 2.60±0.83 3.92±0.91 2.61±0.69 0.438
柯林斯氏菌属Collinsella 4.36±0.61a 1.94±0.84b 0.12±0.07c 0.001
其他Others 21.41±3.02 18.84±1.89 22.20±1.86 0.574

3 讨论

3.1 COS对犬营养物质表观消化率的影响

营养物质表观消化率是反映动物对饲粮中营养物质消化吸收的重要指标[19],能反映营养物质的消化吸收状况,也可反映饲粮营养是否平衡[20]。Huang等[21]研究发现,饲粮中添加COS能够显著提高肉鸡干物质、钙、磷、粗蛋白质和所有氨基酸的回肠表观消化率。Harikrishnan等[22]研究发现,饲粮中添加COS具有提升鲢鱼消化酶活性的作用。本研究发现,添加5 g/kg的COS对犬粗脂肪表观消化率有显著的提升效果,说明犬饲粮中添加5 g/kg COS对犬脂质代谢有很好的改善作用。除此之外,犬饲粮中添加COS对干物质、粗蛋白质、粗脂肪、钙和磷表观消化率作用在统计学上虽然没有达到显著差异,但均较对照组有一定程度的增加,并且对干物质、粗蛋白质、粗脂肪和磷的表观消化率的作用随COS添加量的增加呈现有规律的增强趋势。这可能与COS刺激犬胃、肠黏膜促进消化酶的分泌作用,进而促进了犬对各营养物质的吸收有关。

3.2 COS对犬血清抗氧化能力的影响

动物机体抗氧化能力与机体的健康有着密切的联系。Xie等[23]研究表明,妊娠猪饲粮中添加COS可以显著提高妊娠母猪血浆SOD的活性。Osho等[10]研究表明,地塞米松胁迫下雄性肉鸡饲粮中添加1 g/kg的COS能显著增加血浆中SOD与GSH-Px的活性。Chang等[24]研究发现,饲粮中添加COS能显著降低黄羽肉鸡肌肉中MDA含量并增加肌肉SOD和GSH-Px的活性。Qi等[25]研究发现,COS能够增加硫代乙酰胺诱导的肝性脑病(HE)Wistar大鼠肝脏组织中GSH-Px表达并降低MDA含量。Zhang等[11]研究发现,泥鳅饲料中添加1与5 g/kg的COS均能显著增加泥鳅血清SOD、GSH-Px的活性。在本试验中,饲粮中添加COS显著增加了犬血清T-AOC,并且5 g/kg组显著高于1 g/kg组。在机体防御体系中,T-AOC的作用主要是维持内环境活性氧的动态平衡,清除过高的活性氧,使机体处于氧化还原相对稳定的状态,代表体内酶类和非酶类抗氧化物的总体水平,能全面反映动物机体的抗氧化状态[26]。有研究表明,COS清除自由基的能力会随着COS添加量的提高而增强,可能是由于COS分子中的铵根离子提供的单电子是清除自由基的根源。而饲粮中添加COS对犬血清SOD、GSH-Px活性及MDA的含量无显著影响,说明COS对机体抗氧化功能的影响作用可能与COS添加量以及试验动物有关。

3.3 COS对犬血清生化指标的影响

血清生化指标可以反映动物机体的免疫功能与健康状况[27]。Katiyar等[28]研究发现,COS能降低糖尿病小鼠血清低密度脂蛋白、葡萄糖、胆固醇和甘油三酯含量。Xu等[29]在建立的小鼠肉瘤180肿瘤模型中,使用100 mg/kg COS能显著提高小鼠血清中IFN-γ的含量。本研究发现,饲粮中添加5 g/kg的COS显著增加了犬血清总蛋白的含量,对血清其他指标均无显著影响。血清总蛋白作为机体蛋白质代谢的重要指标,为白蛋白和球蛋白的总和[30]。本研究结果中,虽然各组之间血清白蛋白和球蛋白含量差异未达到显著水平,添加COS血清白蛋白和球蛋白含量均有所提高,这可能与COS提高了犬对蛋白质的消化率有关,并且球蛋白与机体的免疫密切相关,这说明COS一定程度上提升了犬的代谢功能和免疫力。连国琦等[31]研究发现,环江香猪饲粮添加0.5%的COS能显著提升血浆碱性磷酸酶的活性,对其他血清生化参数均无显著影响。这说明COS对动物机体生化指标的影响也与COS的添加量和试验动物有密切关系。

3.4 COS对犬肠道菌群结构的影响

肠道菌群能够调节动物机体代谢、免疫等功能,影响机体的生长及健康状况。肠道菌群结构受到宿主遗传、饮食、生活环境、年龄、健康状况、药物等影响[32]。肠道菌群的结构和数量在一定范围处于动态平衡状态。肠道菌群异常改变可能会导致肥胖、糖尿病和自身免疫性疾病以及神经精神疾病[33]。对粪便菌群分析可以准确地反映肠道菌群的变化。本试验通过高通量测序技术,对18只泰迪犬新鲜粪便菌群测序分析。结果显示,各组菌群丰富度Observed species、Chao1、ACE指数与菌群多样性Shannon、Simpson指数均无显著差异,说明添加COS对犬的肠道菌群结构丰富度、多样性没有显著效果。
本试验从门、属2个水平对饲粮中添加COS的犬肠道菌群结构与多样性的变化进行了分析。在门水平,犬肠道中的优势菌门有梭杆菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门与变形菌门,这与陆江等[34]的研究结果相同。本研究发现,添加5 g/kg的COS显著增加了厚壁菌门的相对丰度。厚壁菌门是人与多种哺乳动物中的优势菌门,与机体肠道屏障的保护功能有关[35]。Fábrega等[36]报道,厚壁菌门的比例与胃肠道炎症呈负相关。Wang等[37]报道,COS对肠道健康有积极作用,能有效保护炎性肠病(IBD)的肠道屏障。因此,犬饲粮中添加5 g/kg的COS能增加犬的肠道抗炎和肠道保护作用。也有研究发现,厚壁菌门相对丰度与动物肠道中脂肪、蛋白质的消化有关,具有促进饲粮营养消化吸收的作用[38]。这与本试验中添加不同水平的COS促进了犬对粗蛋白质、粗脂肪的表观消化率的结果一致。在属水平,犬饲粮中添加COS显著降低了犬肠道中柯林斯氏菌属的相对丰度。Astbury等[39]报道,柯林斯氏菌属与非酒精性脂肪肝、肥胖和动脉粥样硬化有关,并且表明该微生物属中存在的一些途径可能影响宿主的脂质代谢。这表明饲粮中添加COS可能有降低犬非酒精性脂肪肝、肥胖和动脉粥样硬化的风险。除此之外,饲粮中添加COS对犬肠道放线菌门、绿湾菌门与拟杆菌属的作用可能与COS增强犬代谢、改善犬肠道内环境的作用有关。

4 结论

COS可作为犬饲粮的补充剂,能一定程度上改善犬营养物质消化率、提升犬的抗氧化功能和免疫力,对肠道菌群的结构也有积极的调节作用,并且这些积极的作用随着COS添加量的增加均呈现增强趋势。本试验条件下,5 g/kg的COS添加量优于1 g/kg。然而,关于COS在犬上的最适添加量还需进一步确定。

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