动物营养学报 >

2023 , Vol. 35 >Issue 2: 1349 - 1360

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.127

研究论文

蒲公英中黄酮的响应面法优化提取和同步荧光法检测研究

  • 李军德 , 1 ,
  • 张高瞻 2 ,
  • 刘晓娟 2 ,
  • 宋吉英 , 2, *
展开
  • 1 青岛农业大学校医院，青岛 266109
  • 2 青岛农业大学化学与药学院，青岛 266109
* 宋吉英，高级实验师，E-mail：

李军德（1969—），男，山东烟台人，主治医师，学士，主要从事药物分析研究。E-mail：

Copy editor: 菅景颖

收稿日期: 2021-03-26

  网络出版日期: 2023-02-13

基金资助

国家自然科学基金项目(21775083)

山东省高等学校省级大学生创新创业训练计划项目(S201910435032)

青岛农业大学实验技术研究课题(SYJS202111)

收起

Optimal Extraction of Flavonoid from Dandelion via Response Surface Method and Its Synchronous Fluorescence Method Detection

  • LI Junde , 1 ,
  • ZHANG Gaozhan 2 ,
  • LIU Xiaojuan 2 ,
  • SONG Jiying , 2, *
Expand
  • 1 Hospital of Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China
  • 2 College of Chemistry and Pharmaceutical Sciences， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China
* senior experimentalist， E-mail：

Received date: 2021-03-26

  Online published: 2023-02-13

Fold

摘要

本试验应用响应面法优化超声-微波协同萃取蒲公英中黄酮的提取工艺，并建立测定黄酮含量的同步荧光法。在单因素试验结果的基础上，以提取溶剂乙醇浓度、微波功率、萃取时间和料液比为自变量，提取液的荧光强度为响应值，设计4因素3水平响应面试验，优化蒲公英中黄酮的提取工艺；单因素试验确定同步荧光法的测定条件。结果表明：1）判定系数R2=0.964 8，说明模型与实际结果拟合程度好，所得模型能解释96.48%的响应值改变，校正判定系数（ R A d j 2=0.929 5）与预测判定系数（ R P r e d 2=0.886 0）接近。2）响应面法优化超声-微波协同萃取技术提取蒲公英中的黄酮，其最佳提取条件为乙醇浓度50%，微波功率250 W，萃取时间30 min，料液比1∶30 （g∶mL）。3）同步荧光法的最佳测定条件为波长差值（Δλ）=55 nm，Al（NO3）3浓度0.2%，加入pH=6的醋酸-醋酸钠缓冲液1 mL，室温条件下反应50 min。在最佳测定条件下，测得蒲公英中黄酮的含量为3.52 mg/g。由此可见，响应面法优化提取工艺能较好地用于蒲公英中黄酮的提取，同步荧光法测定黄酮含量的方法干扰少、准确度高。

关键词： 蒲公英; 黄酮; 响应面法; 超声-微波协同萃取; 同步荧光

本文引用格式

李军德 , 张高瞻 , 刘晓娟 , 宋吉英 . 蒲公英中黄酮的响应面法优化提取和同步荧光法检测研究[J]. 动物营养学报, 2023 , 35(2) : 1349 -1360 . DOI: 10.12418/CJAN2023.127

Abstract

This experiment was conducted to optimize the ultrasonic-microwave synergistic extraction process of flavonoids from the dandelion by the response surface method. Furthermore， a synchronous fluorescence method was established for the detection of the flavonoid content. The extraction process was optimized by response surface test of four factors and three levels based on the single factor test results. In this process， ethanol concentration， microwave power， extraction time and solid-liquid ratio were used as the independent variables， while the fluorescent intensity of extraction solution was served as the response value. The measurement conditions of synchronous fluorescence method were determined by conducting a single factor experiment. The results were summarized as follows： 1） the determination coefficient R2=0.964 8 indicated that the model fitted well with the actual results， and the obtained model could explain the 96.48% change of the response value. The predicted determination coefficient （ R P r e d 2=0.886 0） was reasonable consistent with the adjusted determination coefficient （ R A d j 2=0.929 5）. 2） The optimum extraction conditions for ethanol concentration， microwave power， extraction time and solid-liquid ratio were identified as 50% ethanol， 250 W， 30 min， and 1∶30 （g∶mL）， respectively. 3） The optimum detection conditions of synchronous fluorescence method were set as that the wavelength difference value （Δλ） was 55 nm， the concentration of Al（NO3）3 was 0.2%， acetate-sodium acetate buffer solution （pH=6） was 1 mL， and reaction time was 50 min at room temperature. Under the optimum detection conditions， the content of flavonoid in dandelion was 3.52 mg/g. Therefore， the extraction process optimized by the response surface method can be used to extract the flavonoids in dandelion. Moreover， the synchronous fluorescence method possesses the advantages of low interference and high accuracy in terms of flavonoids determination.

Key words： dandelion; flavonoid; response surface method; ultrasound-microwave synergistic extraction; synchronous fluorescence

黄酮类化合物广泛存在于植物中，对哺乳动物和其他类型的细胞具有许多有益的生理效应和药理作用，是多种中草药的有效成分。蒲公英作为一种药食同源的中草药，含有大量的黄酮类物质，对动物有抗炎、抑菌、免疫调节等作用，其功效已成为近些年研究的热点[1]。中草药饲料添加剂是指以中草药为原料制成的饲料添加剂，其作用主要表现在防病保健、提高动物生产性能、改善动物产品质量和改善饲料品质等方面，具有来源天然性、功能多样性、安全可靠性、经济环保性等特点。自2020年起，我国饲料中全面禁止添加抗生素，发现并利用能够有效替代抗生素的药食同源的中草药逐渐成为饲料行业的研究热点。近年来，中草药在替代畜禽饲用抗生素的试验研究中已被证实具有改善动物生长性能、提高机体抗氧化能力、增强免疫功能等良好效果[2-3]。蒲公英作为一种分布广泛、价格低廉、营养价值丰富、生物活性良好的中草药饲料添加剂，可以合理应用于动物生产实践中[4⇓⇓-7]。但蒲公英中黄酮的含量因产地气候、土壤和生长期等客观条件的不同而不同，因此使用时建议对黄酮含量进行测定。蒲公英中黄酮的提取和测定，相关文献报道较多[8⇓⇓⇓⇓-13]，目前的文献对黄酮的提取多是采用单一的超声提取或微波提取，测定方法主要是普通荧光法。用响应面优化超声-微波协同萃取的方法目前尚未见报道，响应面法考虑了试验的随机误差，计算简单，与常用的正交试验相比，其突出优势是在寻找最佳试验条件的过程中，可以连续对试验的各个水平进行分析，而正交试验只能对一个个孤立的试验点进行分析[14-15]。超声-微波协同萃取技术近年来以其萃取时间短、萃取效率高、样品耗量低等突出优点，在天然物质的提取中得到了广泛的应用[16⇓⇓-19]。同步荧光法具有选择性好、灵敏度高、干扰少等优点，是多组分混合物荧光测定的一种有效手段。本试验以烟台某地区的蒲公英为试验对象，采用响应面法优化超声-微波协同萃取黄酮的工艺，主要确定提取溶剂乙醇浓度、微波功率、萃取时间和料液比等提取因素，同时采用同步荧光法测定其中黄酮的含量，特别是确定最佳波长差值（Δλ），从而得到最佳提取工艺和检测方法，为动物饲粮中含黄酮类中草药的添加提供控制依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

仪器：F-2500荧光分光光度计（Hitachi公司）、GW-2000超声-微波协同萃取反应仪（上海新拓分析仪器科技有限公司）、PB-10酸度计（北京赛多利斯科学仪器北京有限公司）、GL-12B离心机（上海安亭科学仪器厂）、AR124CN电子天平（常州奥豪斯仪器有限公司）。
芦丁，纯度大于98%，上海麦克林生物化学有限公司；乙醇，色谱纯，德国Meker公司；其他试剂为优级纯分；试验用水为超纯水；蒲公英全草购于山东省烟台市市场，粉碎后备用。

1.2 同步荧光光谱参数

狭缝宽度激发波长（Ex）：5 nm，发射波长（Em）：5 nm，扫描范围Ex：400~500 nm，Em：455~555 nm，扫描速度300 nm/min，延迟时间0 s，电压400 V。

1.3 样品前处理方法

称取一定质量的蒲公英全草样品，加入提取溶剂，设置微波功率和萃取时间，进行超声-微波协同萃取，将提取后的混合物离心，上清液旋蒸（50 ℃）至干，加入10 mL色谱纯乙醇溶解旋蒸后的残留物，用0.45 μm的一次性滤膜过滤以除去其中的固体颗粒，滤液中加入Al（NO3）3溶液和醋酸-醋酸钠缓冲溶液，色谱纯乙醇定容至50 mL，待测。

1.4 芦丁同步荧光光谱分析条件的单因素试验设计

准确移取0.5 mg/mL的芦丁标准溶液1 mL于25 mL容量瓶，以Δλ、Al（NO3）3溶液浓度、醋酸-醋酸钠缓冲溶液的pH、反应时间和温度5个因素为单因素，每次改变1个因素分别进行同步荧光光谱分析，考察各个因素对芦丁同步荧光强度的影响。具体试验设计见表1。
表1 同步荧光光谱分析条件的因素和水平

Table 1 Factors and levels for analysis conditions of synchronous fluorescence spectrum

因素 Factors 水平 Levels
波长差值 Δλ/nm 10、20、30、40、45、50、55、60、70
Al（NO3）3溶液浓度 Al（NO3）3 solution concentration/% 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0
pH 3.2、3.4、4.0、4.4、5.0、5.4、6.0、7.0
反应时间 Reaction time/min 10、20、30、40、50、60
温度 Temperature/℃ 25、30、35、40、45

1.5 蒲公英中黄酮提取效果的单因素试验设计

称取2.0 g粉碎的蒲公英全草样品，以乙醇浓度、微波功率、萃取时间、料液比4个因素为单因素，按照1.3的方法对样品进行前处理，每次改变1个因素分别对提取液进行同步荧光光谱分析，考察各个因素对黄酮提取效果的影响。具体试验设计见表2。
表2 黄酮提取效果的因素和水平

Table 2 Factors and levels for extraction effect of flavonoid

因素 Factors 水平 Levels
乙醇浓度 Ethanol concentration/% 30、40、50、60、70、80
微波功率 Microwave power/W 100、200、300、400、500
萃取时间Extraction time/min 10、20、30、40、50
料液比 Solid-liquid ratio （g∶mL） 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50

1.6 响应面试验设计

根据单因素试验结果，以提取溶剂乙醇浓度（A）、微波功率（B）、萃取时间（C）、料液比（D）为自变量，提取液的荧光强度为响应值，设计4因素3水平响应面试验，优化蒲公英中黄酮的提取工艺，确定最佳提取条件。具体试验设计见表3。
表3 响应面试验的因素和水平

Table 3 Factors and levels for response surface test

水平
Levels		 因素 Factors
乙醇浓度
Ethanol concentration
（A）/%		 微波功率
Microwave power
（B）/W		 萃取时间
Extraction time
（C）/min		 料液比
Solid-liquid ratio （D）
（g∶mL）
-1 40 200 20 1∶20
0 50 300 30 1∶30
1 60 400 40 1∶40

1.7 蒲公英中黄酮含量的测定

准确吸取样品待测溶液1 mL于25 mL容量瓶，加入一定量的Al（NO3）3溶液，pH=6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液1 mL，乙醇定容，反应50 min，同步荧光法测定其荧光强度。样品中的黄酮以芦丁标准品作为表述，根据标准工作曲线求出所测溶液中芦丁的含量，按照下列公式求出样品中黄酮的含量。
w=c×V1×V2×10-3/m。
式中：w为样品中黄酮的含量（mg/g）；c为根据标准工作曲线计算的所测溶液的浓度（μg/mL）；V1为所测溶液的体积（mL）；V2为样品处理后所得待测溶液的体积（mL）；m为样品的质量（g）。

1.8 数据处理与分析

优化提取工艺试验采用Box-Behnken设计（BBD），利用数据处理软件Design-Expert 10.0.4、Origin Pro 2018C和Excel 2017进行数据统计及图表绘制。

2 结果与分析

2.1 芦丁同步荧光光谱分析条件单因素试验结果

由图1-a可知，不同的Δλ对芦丁的同步荧光强度是有影响的，随着Δλ的增大，同步荧光强度逐渐增强，当Δλ=55 nm时，芦丁的光谱图规范且同步荧光强度最大。由图1-b可知，当Al（NO3）3溶液浓度为0.2%时，芦丁的同步荧光强度最大。由图1-c可知，当pH<6.0时，芦丁的同步荧光强度基本不变；pH=6.0时，芦丁的同步荧光强度最大；pH>6.0时，芦丁的同步荧光强度下降。由图1-d可知，随着反应时间的增加，芦丁的同步荧光强度逐渐增强，当反应时间超过50 min时，同步荧光强度基本保持不变。由图1-e可知，随着温度的升高，芦丁的同步荧光强度呈现下降的趋势，当温度为25 ℃时，芦丁的同步荧光强度最大，因此试验在室温下进行即可。对同步荧光光谱分析条件单因素试验结果进行方差分析，Δλ、Al（NO3）3溶液浓度、pH、反应时间、温度对应的F值分别为4.08、48.74、1.93、2.19、4.74，显著性水平α=0.05时，查得其临界值分别为2.51、2.39、2.66、3.11和3.48，其P值分别为0.006、<0.001、0.130、0.120和0.020，以上结果说明Δλ和Al（NO3）3溶液浓度对结果的影响极其显著，温度对结果的影响显著，而pH和反应时间对结果的影响不显著。根据单因素试验结果，确定同步荧光法测定芦丁的最佳光谱条件为：Δλ=55 nm，Al（NO3）3溶液浓度为0.2%，加入醋酸-醋酸钠缓冲液使溶液pH=6，室温下反应50 min。在以上最佳测定条件下，得到芦丁的同步荧光光谱图，如图2所示。
图1 各因素对芦丁同步荧光强度的影响

Fig.1 Effects of various factors on synchronous fluorescence intensity of rutin

图2 芦丁的同步荧光光谱图

Fig.2 Synchronous fluorescence spectrum of rutin

2.2 芦丁标准工作曲线的线性方程

用作图法绘制芦丁工作标准曲线，得出芦丁标准工作曲线的线性方程为F=15.14c+13.54，线性相关系数（R2）=0.991 8，c为芦丁的浓度（μg/mL），F为同步荧光强度。

2.3 蒲公英中黄酮提取效果的单因素试验结果

由图3-a可知，低浓度范围内提取液的荧光强度随乙醇浓度的增加而增大，当乙醇浓度超过50%时，荧光强度开始降低。由图3-b可知，提取液的荧光强度随着微波功率的增加而增大，当微波功率超过300 W时，荧光强度开始下降。由图3-c可知，提取液的荧光强度随着萃取时间的增加而增大，当萃取时间超过30 min时，荧光强度开始下降。由图3-d可知，萃取剂量少时荧光强度随着料液比的增加而增大，当料液比超过1∶30（g∶mL）时，荧光强度基本趋于稳定。对蒲公英中黄酮提取效果的单因素试验结果进行方差分析，乙醇浓度、微波功率、萃取时间和料液比4个因素对应的F值分别为13.53、4.22、1.70和4.59，显著性水平α=0.05时，查得其临界值分别为3.11、3.48、3.48、3.48，其P值分别为<0.001、0.029、0.226、0.023，说明乙醇浓度对提取效果的影响极显著，微波功率和料液比对提取效果的影响显著，而萃取时间对提取效果的影响不显著。根据单因素试验结果，确定超声-微波协同萃取蒲公英中黄酮的最佳提取条件为：50%乙醇水溶液作为提取溶剂，微波功率300W，萃取时间30min，料液比1∶30 （g∶mL）。
图3 各因素对黄酮提取效果的影响

Fig.3 Effects of various factors on extraction effect of flavonoid

2.4 响应面法优化超声-微波协同萃取条件

2.4.1 响应面试验模型和数据

响应面试验模型设计以提取溶剂乙醇浓度（A）、微波功率（B）、萃取时间（C）、料液比（D）为自变量，提取液的荧光强度为响应值，设计4因素3水平响应面试验，共29组，所得数据如表4所示。
表4 响应面法Box-Behnken设计和结果

Table 4 Box-Behnken design and results for response surface method

试验号 Test number A B C D 荧光强度 Fluorescence intensity
1 0 1 1 0 96.23
2 1 0 1 0 88.40
3 -1 0 1 0 79.00
4 0 0 -1 -1 90.57
5 -1 0 -1 0 81.72
6 0 0 0 0 110.00
7 0 -1 0 -1 88.67
8 1 0 -1 0 85.83
9 -1 0 0 1 83.25
10 0 0 1 -1 85.04
11 0 0 0 0 118.31
12 0 1 0 -1 94.00
13 0 -1 -1 0 92.34
14 0 -1 1 0 90.45
15 -1 1 0 0 81.32
16 -1 0 0 -1 78.13
17 1 -1 0 0 86.00
18 0 0 -1 1 93.49
试验号 Test number A B C D 荧光强度 Fluorescence intensity
19 0 1 -1 0 94.00
20 1 1 0 0 88.28
21 1 0 0 1 86.17
22 0 0 0 0 109.00
23 0 0 1 1 92.48
24 0 0 0 0 110.11
25 -1 -1 0 0 80.03
26 0 -1 0 1 88.32
27 0 0 0 0 116.47
28 1 0 0 -1 80.03
29 0 1 0 1 98.55

A：乙醇浓度；B：微波功率；C：萃取时间：D：料液比。表5同。

A： ethanol concentration； B： microwave power； C： extraction time； D： solid-liquid ratio. The same as Table 5.

2.4.2 响应面试验结果

通过回归分析，得出以荧光强度为响应值的二次多项回归方程：F=112.78+2.61A+2.21B-0.53C+2.15D+0.25AB+1.32AC+0.25AD+1.03BC+1.23BD+1.13CD-19.21A2-9.21B2-10.29C2-11.65D2。
式中：F为提取液中黄酮的荧光强度；A、B、C、D分别为乙醇浓度、微波功率、萃取时间和料液比。
响应面法数据的方差分析结果如表5所示，由分析结果可知，模型的P值<0.000 1，说明回归模型极显著，失拟项数值表明其差异不显著；因素的显著性分析结果显示，单因素萃取时间对试验结果的影响不显著，其他各项对试验结果的影响均达到显著水平；同时可以看出，乙醇浓度对提取效果的影响最大，其次是微波功率和料液比，萃取时间对提取效果的影响较小，这和单因素试验结果基本一致。
表5 响应面法数据方差分析

Table 5 Analysis of variance for response surface method data

方差来源
Sources of variation		 平方和
Sum of squares		 自由度
df		 均方
Mean square		 F值
F-value		 P值
P-value		 显著性
Significant
模型 Model 3 337.90 14 238.42 27.37 <0.000 1 **
A 81.43 1 81.43 9.35 0.008 5 **
B 58.83 1 58.83 6.75 0.021 0 *
C 3.36 1 3.36 0.39 0.544 5 NS
D 55.56 1 55.56 6.38 0.024 2 *
AB 0.25 1 0.25 0.03 0.869 2 NS
AC 7.00 1 7.00 0.80 0.385 3 NS
AD 0.26 1 0.26 0.03 0.865 3 NS
BC 4.24 1 4.24 0.49 0.496 6 NS
BD 6.00 1 6.00 0.69 0.420 4 NS
CD 5.11 1 5.11 0.59 0.456 5 NS
A2 2 394.87 1 2 394.87 274.97 <0.000 1 **
B2 550.34 1 550.34 63.19 <0.000 1 **
C2 686.96 1 686.96 78.87 <0.000 1 **
D2 879.96 1 879.96 101.03 <0.000 1 **
方差来源
Sources of variation		 平方和
Sum of squares		 自由度
df		 均方
Mean square		 F值
F-value		 P值
P-value		 显著性
Significant
残差 Residual 121.94 14 8.71
纯误差Lack of ft 48.59 10 4.86 0.27 0.959 7 NS
纯误差Pure error 73.34 4 18.34
所有项 Cor total 3 459.84 28

“**”：极显著（P<0.01）；“*”：显著（P<0.05）；“NS”：不显著（P>0.05）。

“**”： extremely significant （P<0.01）； “*”： significant （P<0.05）； “NS”： not significant （P>0.05）.

由表6可知，优化提取试验的二次多项式拟合分析中，变异系数（CV）为3.21%，说明变异总量只有3.21%，不能用此模型解析；判定系数（R2）=0.964 8，说明模型与实际结果拟合程度好，所得模型能解释96.48%的响应值改变；校正判定系数（ R A d j 2=0.929 5）和预测判定系数（ R P r e d 2=0.886 0）接近，说明该模型可以用来指导提取试验。
表6 黄酮提取的二次多项式拟合分析

Table 6 Fitting analysis of quadratic polynomial for flavonoid extraction

标准偏差
Standard deviation		 变异系数
CV/%		 判定系数
R2		 校正判定系数
R A d j 2		 预测判定系数
R P r e d 2		 精密度
Adeq precision
2.95 3.21 0.964 8 0.929 5 0.886 0 16.661

2.4.3 各因素交互作用响应面分析

响应面图是响应值对各试验因素所构成的三维空间曲面图，曲线走势越陡，影响越显著，曲线走势平滑，则影响较小；等高线椭圆形状能反映出交互作用的强弱，等高线呈椭圆形说明交互作用显著，呈圆形则反之[20-21]。
从图4可以看出，在交互项的相互影响中，乙醇浓度与微波功率、萃取时间、料液比之间的交互作用显著，而其他因素之间的交互作用不显著，这与方差分析的结果一致。根据建立的模型，得到蒲公英中黄酮的最佳提取条件：乙醇浓度51.64%，微波功率251.4 9 W，萃取时间29.03 min，料液比1∶32.08 （g∶mL）。结合试验情况，确定最佳提取条件为：乙醇浓度50%，微波功率250 W，萃取时间30 min，料液比1∶30 （g∶mL），这也与单因素试验结果基本一致。在此最佳提取条件下，所得蒲公英中黄酮的含量为3.52 mg/g。
图4 各因素交互作用响应面图

Fig.4 Response surface plots showing the interaction of various factors

3 讨论

3.1 测定条件对芦丁同步荧光强度的影响

同步荧光法近几年在黄酮的分析测定中得到了一定的应用[22⇓-24]。在恒波长同步荧光法中，Δλ的选择十分重要，这将直接影响到同步荧光光谱的形状、带宽和信号强度[25⇓-27]，它是同步荧光检测方法中最重要的检测参数，本试验从Δλ=10 nm开始，每隔5~10 nm进行设置，讨论Δλ对芦丁同步荧光强度的影响，当荧光强度有明显增强时，细化Δλ的数值，每隔5 nm进行讨论，结果发现Δλ=55 nm时，芦丁的光谱图规范且同步荧光强度最大。相关文献[22⇓-24]对Δλ的数值讨论基本是间隔10 nm，数值相对粗略。黄酮类化合物能与Al3+反应形成荧光络合物[28⇓-30]，从而使化合物的荧光强度增强，当芦丁的荧光强度最大时，说明络合反应达到饱和，因此可以确定溶液中Al（NO3）3的适宜浓度为0.2%；本试验采用醋酸-醋酸钠缓冲溶液调整溶液为弱酸性，发现酸性环境对荧光强度的影响一般，pH=7.0时同步荧光强度开始有下降趋势，这可能是因为黄酮类化合物在偏中性环境中与钠盐生成了螯合物[11]，从而造成荧光强度减弱；芦丁与Al3+的络合反应需要一定的时间，当反应时间超过50 min时，荧光强度基本保持不变，说明Al3+与芦丁已反应充分；络合反应与温度有直接的关系，随着温度的升高，芦丁的荧光强度呈现下降的趋势，这可能是因为随着温度的升高，荧光络合物的解离反应趋势增大[23]，本试验显示在室温条件芦丁的荧光强度最大，相关文献几乎没有对温度这一影响因素进行讨论。

3.2 不同因素对蒲公英中黄酮提取效果的影响

蒲公英中黄酮的提取采用超声-微波协同萃取法，影响提取效果的主要因素有乙醇浓度、微波功率、萃取时间和料液比。不同浓度的乙醇溶液对黄酮的提取效果不同，低浓度范围内提取液的荧光强度随乙醇浓度的增加而增大，当乙醇浓度超过50%时荧光强度开始降低，这可能是因为乙醇浓度过高时，蒲公英中的脂溶性物质的析出量也会增加，从而抑制了黄酮的进一步溶解，导致荧光强度下降。微波功率对提取效果也有影响，随着微波功率的增加，荧光强度增强，说明黄酮类化合物溶出量增多，当微波功率超过300 W时，荧光强度开始下降，这是因为微波功率过大，提取液的温度会有明显的提升，温度过高会造成部分黄酮类化合物的分解[31-32]，从而导致黄酮含量降低，荧光强度下降。荧光强度随着萃取时间的增加而增大，说明蒲公英中的黄酮随着萃取时间的延长溶出量增多，但超过30 min时荧光强度开始下降，这可能是因为超声波的热效应能使黄酮类化合物分子的溶出加剧，但是时间过长，微波的高能作用和超声波振动的空化作用加剧，使得提取液产生的热量过多，温度升高；同时，超声波的机械作用可能也会使部分黄酮类化合物分子结构遭到破坏，甚至加剧其分解，从而造成溶液中黄酮含量的减少。荧光强度随着料液比的增加而增大，这是因为料液比较小时，黄酮类化合物分子与溶剂的接触不充分，溶出速度慢而且溶出不彻底，所以黄酮的溶出量少；随着料液比的逐渐增加，提取溶剂的量增多，蒲公英样品与溶剂充分接触，溶解效果增强，当料液比达到一定数值时荧光强度基本趋于稳定，说明黄酮的溶出量已达到饱和；料液比过高，样品处理过程中旋蒸浓缩耗时多，试验成本也会增加。

4 结论

① 响应面法优化超声-微波协同萃取技术提取蒲公英中的黄酮，其最佳提取条件为乙醇浓度50%，微波功率250 W，萃取时间30 min，料液比1∶30 （g∶mL）。
② 同步荧光法测定黄酮具有选择性好、灵敏度高、干扰少、检测结果准确度高的优点，最佳测定条件为Δλ=55 nm，Al（NO3）3浓度0.2%，加入pH=6的醋酸-醋酸钠缓冲液1 mL，室温条件下反应50 min。

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