自21世纪以来,随着人民收入水平逐渐提升,对畜产品的需求也日益增加,畜牧行业进入了快速发展阶段。现如今,饲料供应不平衡已成为制约畜牧业高速发展的首要因素。国际市场精饲料原料价格逐年攀升,我国畜牧业也面临着巨大的生产成本压力。大力开发和利用饲料资源、优化现有饲料品质及保障饲料供应是解决我国当前饲料产量不足、品质参差不齐以及精饲料原料严重依赖进口等问题的有效途径[1]。青贮是一种简单、经济且能较好保存原料营养价值和延长贮藏时间的粗饲料加工方式。青贮饲料是反刍动物主要的饲料资源之一,其发酵品质的好坏将直接影响到反刍动物的生长发育及农民的经济效益[2]。同时,通过青贮的方式还能改善饲料品质,长期维持青绿饲料青绿多汁的特性。饲料在青贮之后,柔软多汁,带有芳香的酸味,并且适口性好,能增加反刍动物食欲,解决了秋冬季节缺少鲜青饲料的问题[3]。将玉米秸秆、菌糠及麸皮等农副产品进行青贮处理,还能解决因就地废弃或非燃料性焚烧造成的生态环境污染的问题。但是在饲料青贮的过程中会面临乳酸菌数量过少、无法有效抑制有害菌繁殖和纤维物质得不到有效利用等问题,极大影响了饲料的青贮效果和反刍动物的生产性能。故可以在饲料青贮过程中添加生物性添加剂来提高饲料的青贮效果和反刍动物的生产性能。在苜蓿青贮饲料中添加乳酸菌接种剂,结果表明,与对照组相比,添加乳酸菌降低了苜蓿青贮饲料的pH和氨态氮含量,提高了青贮饲料的乳酸及粗蛋白质含量[4]。添加乳酸菌能提高青贮饲料的发酵效率[5],但是当发酵底物不充分的时候,其发酵效率将会降低。适当添加纤维素酶可以将青贮饲料的结构性多糖降解为单糖,为乳酸菌发酵提供充足的底物,从而提高饲料的青贮品质[6]。若是在低糖并且缺乏足够乳酸菌的青贮饲料中复合添加乳酸菌和纤维素酶,将会获得累积效果,显著改善饲料的青贮品质。
目前,国外对生物性添加剂的应用进行了大量的试验研究和探索,其中乳酸菌制剂和纤维素酶制剂在国外青贮中已广泛应用。在畜牧业发达国家中,对生物性添加剂的研究除了提高发酵品质外,更多精力投向抑制好氧腐败、改善采食性以及提高养分摄取量等热点领域。我国现今对生物性添加剂的利用尚停留在实验室研究和小规模生产阶段,且存在品种单一、效果不稳定等问题,与欧美、日本等畜牧业发达国家相比存在较大差距。生物性添加剂种类丰富,可针对不同的用途及青贮饲料的发酵效果将微生物添加剂及酶制剂进行优化组合,发挥出各自的优势,从而提高青贮饲料的发酵品质和动物的生产性能。基于此,本文归纳分析了目前国内外生物性添加剂在青贮饲料中应用的研究进展,以期为研发出具备高效、环保、低成本等优势的新型复合生物性添加剂提供科学性依据。
1 微生物添加剂
微生物在饲料青贮发酵进程中起着相当重要的作用,参与青贮发酵的微生物种类繁多,主要包括促进饲料发酵的乳酸菌和引起青贮饲料腐败变质的梭菌、霉菌等。乳酸菌作为饲料青贮发酵过程中起主要作用的微生物,可以利用水溶性碳水化合物产生有机酸来降低pH,还能通过竞争营养物质及形成酸性厌氧环境来抑制不良微生物的繁殖生长。乳酸菌按照代谢产物的不同可以分为2类发酵类型,即同型发酵乳酸菌和异型发酵乳酸菌,同型发酵乳酸菌代谢只产生乳酸,而异型发酵乳酸菌可产生多种代谢产物[7]。青贮过程中常用的同型发酵乳酸菌包括屎肠球菌(Enterococcus faecium,Ec. faecium)、牛链球菌(Streptococcus bovis,Sc. bovis)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,L. plantarum);异型发酵乳酸菌包括布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri,L. buchneri)和希尔加迪乳杆菌(Lactobacillus hilgadi,L. hilgadi)。青贮发酵过程中乳酸菌的种类见表1 。
| 属名 Genus name | 种名 Species name | 发酵类型 Fermentation type |
|---|---|---|
| 乳球菌属 Lactococcus | 植物乳球菌 Lc. plantarum | 同型发酵 |
| 格氏乳球菌 Lc. garvieae | 同型发酵 | |
| 乳酸乳球菌 Lc. lactis | 同型发酵 | |
| 链球菌属 Streptococcus | 假肺炎链球菌 Sc. pseudopneumoniae | 同型发酵 |
| 粪链球菌 Sc. faecalis | 同型发酵 | |
| 屎链球菌 Sc. faecium | 同型发酵 | |
| 牛链球菌 Sc. bovis | 同型发酵 | |
| 片球菌属 Pediococcus | 戊糖片球菌 P. pentosaceus | 同型发酵 |
| 有害片球菌 P. damnosus | 同型发酵 | |
| 乳酸片球菌 P. acidilactici | 同型发酵 | |
| 啤酒片球菌 P. cerevisiae | 同型发酵 | |
| 毛足片球菌 P. confusa | 同型发酵 | |
| 意外片球菌 P. inopinatus | 同型发酵 | |
| 小片球菌 P. parvulus | 同型发酵 | |
| 酵母片球菌 P. cerevisiae | 同型发酵 | |
| 魏斯氏菌属 Weissella | 韩国魏斯氏菌 W. koreensis | 异型发酵 |
| 食窦魏斯氏菌 W. cibaria | 异型发酵 | |
| 类肠膜魏斯氏菌 W. paramesenteroides | 异型发酵 | |
| 乳杆菌属 Lactobacillus | 德氏乳杆菌 L. delbrueckii | 同型发酵 |
| 乳酸乳杆菌 L. lactis | 同型发酵 | |
| 唾液乳杆菌 L. salivarius | 同型发酵 | |
| 植物乳杆菌 L. plantarum | 同型发酵 | |
| 詹氏乳杆菌 L. jensenii | 同型发酵 | |
| 属名 Genus name | 种名 Species name | 发酵类型 Fermentation type |
| 同型腐酒乳杆菌 L. homohiochii | 同型发酵 | |
| 嗜酸乳杆菌 L. acidophilus | 同型发酵 | |
| 棒状乳杆菌 L. coryniformis | 同型发酵 | |
| 瑞士乳杆菌 L. helveticus | 同型发酵 | |
| 加氏乳杆菌 L. gasseri | 同型发酵 | |
| 瘤胃乳酸杆菌 L. ruminis | 同型发酵 | |
| 弯曲乳杆菌 L. curvatus | 异型发酵 | |
| 耐酸乳杆菌 L. acetotolerans | 异型发酵 | |
| 戊糖乳杆菌 L. pentosus | 异型发酵 | |
| 沙克乳杆菌 L. saxicola | 异型发酵 | |
| 布氏乳杆菌 L. buchneri | 异型发酵 | |
| 广布乳杆菌 L. divergens | 异型发酵 | |
| 路氏乳杆菌 L. reuteri | 异型发酵 | |
| 果糖乳杆菌 L. fructosus | 异型发酵 | |
| 丘状菌落乳杆菌 L. collinoides | 异型发酵 | |
| 融合乳杆菌 L. confusus | 异型发酵 | |
| 副干酪乳杆菌 L. paracasei | 异型发酵 | |
| 绿色乳杆菌 L. oiridescens | 异型发酵 | |
| 发酵乳杆菌 L. fermenum | 异型发酵 | |
| 草乳杆菌 L. graminis | 异型发酵 | |
| 短乳杆菌 L. brevis | 异型发酵 | |
| 干酪乳杆菌 L. casei | 异型发酵 | |
| 罗伊氏乳杆菌 L. reuteri | 异型发酵 | |
| 鼠李糖乳杆菌 L. rhammosus | 异型发酵 | |
| 肠球菌属 Enterococcus | 鸡肠球菌 Ec. gallinarum | 同型发酵 |
| 粪肠球菌 Ec. faecalis | 同型发酵 | |
| 屎肠球菌 Ec. faecium | 同型发酵 | |
| 铅黄肠球菌 Ec. casseliflavus | 同型发酵 | |
| 蒙氏肠球菌 Ec. mundtii | 同型发酵 | |
| 硫磺肠球菌 Ec. sulphureus | 同型发酵 | |
| 明串珠菌属 Leuconostoc | 肠膜明串珠菌 Leuc. mesenteroides | 异型发酵 |
| 假肠膜明串珠菌 Leuc. pseudomesenteroides | 异型发酵 | |
| 乳脂明串珠菌 Leuc. cremoris | 异型发酵 | |
| 霍氏明串珠菌 Leuc. holzapfelii | 异型发酵 | |
| 葡聚糖明串珠菌 Leuc. dextranicum | 异型发酵 | |
| 乳酸明串珠菌 Leuc. lactis | 异型发酵 | |
| 酒明串珠菌 Leuc. oenos | 异型发酵 | |
| 类肠膜明串珠菌 Leuc. paramesenteroides | 异型发酵 |
1.1 同型发酵乳酸菌
添加同型发酵乳酸菌能促使青贮饲料较早地进入乳酸发酵状态,改变发酵初期乳酸菌不足的局面,产生大量乳酸降低青贮饲料的pH和氨态氮含量,从而抑制酵母菌和霉菌的生长繁殖,减少营养物质损失。添加L. plantarum提高了枯萎紫花苜蓿青贮饲料的有机酸(丁酸除外)和粗蛋白质含量,有效减少了霉菌、大肠杆菌和酵母菌数量[10]。Marbun等[11]研究表明,制作玉米青贮时,添加L. plantarum组的青贮饲料中的粗蛋白质和干物质含量显著高于对照组,氨态氮含量和真菌数量更低,提高了青贮饲料的发酵品质和营养成分。在探究L. plantarum对羊草青贮饲料发酵品质的影响中,与对照组相比,添加L. plantarum组的青贮饲料有较高的乳酸含量,较低的pH和丁酸含量[12]。Sc. bovis是一种从瘤胃中分离出来的乳酸菌,它作为青贮添加剂的生长速度比其他微生物添加剂的生长速度快得多,在发酵初期能快速地使青贮饲料pH下降[13]。在象草青贮饲料中添加Sc. bovis,结果表明,添加Sc. bovis组青贮饲料的pH和氨态氮含量显著低于对照组,粗蛋白质含量显著高于对照组[14]。还有研究发现,与对照组相比,Sc. bovis与小麦粉复合使用有效降低了豚草青贮饲料的pH和氨态氮含量[15]。酵母菌和霉菌的繁殖生长将导致青贮饲料在有氧暴露期间腐败变质。选择乳酸菌添加剂,能极大地保存青贮饲料的营养成分和减少霉菌毒素的积累。对桑叶进行青贮时添加L. plantarum可以提高有氧稳定性,提高到128 h[16]。研究表明,添加同型发酵乳酸菌制剂的青贮饲料也会出现有氧稳定性效果差的现象[17]。Kleinschmit等[18]研究表明,添加L. plantarum并不能抑制酵母菌的繁殖生长,会导致玉米青贮饲料在有氧暴露期间不稳定。在牧草青贮饲料中添加L. plantarum降低了青贮饲料的氨态氮和丁酸含量,也减少了霉菌和梭菌数量,但是对青贮饲料的有氧稳定性没有任何影响[19]。综上所述,在添加同型发酵乳酸菌制剂的青贮饲料有氧稳定性试验中,影响有氧稳定性的结果不一致,因此还需要对其进行更多的探讨与研究。
在动物生产方面,饲喂添加过同型发酵乳酸菌制剂的青贮饲料能提高奶牛产奶量、日增重和饲料效率[20]。Moran等[21]研究了添加L. plantarum的青贮饲料对肉牛生产性能的影响,结果显示,对照组相比,饲喂添加L. plantarum青贮饲料的肉牛干物质采食量和体增重分别提高了7.5%和11.1%。Weinberg等[22]研究报道,乳酸菌可以在瘤胃液中存活,表明这些细菌可能以提高瘤胃微生物生物量的方式直接影响瘤胃发酵。乳酸菌影响瘤胃发酵的具体表现为使菌群保持生态平衡。Voltan等[23]研究表明,动物肠道内的过氧化物酶-硫氰酸酯反应系统可以被乳酸菌分泌产生的过氧化氢激活,从而抑制大肠杆菌及假单胞菌等过氧化氢酶阳性菌和革兰氏阴性菌。并且,乳酸菌还能产生具有高等电点的热稳定蛋白的细菌素,能够诱导病原菌的细胞膜的通透性增加,使细胞内物质渗出,从而达到杀菌的目的[24-25]。Corr等[26]研究表明,乳酸菌产生的细菌素还能够抑制大肠杆菌DNA的合成,也能达到杀菌的目的。Contreras-Govea等[27]进行了为期48 h的体外瘤胃发酵试验,分析瘤胃液中微生物生物量产量,结果表明,与对照组相比,添加L. plantarum的紫花苜蓿青贮饲料组产生了更多的微生物生物量,改变了瘤胃发酵,可能会对反刍动物的生产性能产生积极影响。并且,瘤胃发酵的这种变化可能与青贮发酵过程中更好地保存饲粮蛋白质有关。
1.2 异型发酵乳酸菌
异型发酵乳酸菌可产生能抑制酵母菌和霉菌生长繁殖的短链脂肪酸,从而提高青贮饲料的发酵品质和有氧稳定性。L. buchneri和L. hilgadi是2株典型的异型发酵乳酸菌,均能在较大程度上提高青贮饲料的有氧稳定性。Gandra等[28]研究表明,在向日葵青贮饲料中添加L. buchneri能降低霉菌和酵母菌数量,提高乙酸含量,抑制了向日葵青贮饲料的腐败变质。Kleinschmit等[29]在玉米青贮饲料中添加不同剂量的L. buchneri,相比于对照组,当L. buchneri添加量<105 CFU/g时,玉米青贮饲料的氧稳定性为35 h;当L. buchneri添加量>105 CFU/g时,玉米青贮饲料的有氧稳定性提高到503 h。Reis等[30]从甘蔗青贮饲料中分离出L. hilgadi CCMA 0170,并且将其作为玉米青贮饲料的添加剂,结果表明,添加L. hilgadi CCMA 0170提高了玉米青贮饲料的品质;同时,产生的高含量乳酸及乙酸有助于抑制酵母菌和丝状真菌的繁殖生长。Ávila等[31]研究表明,添加L. hilgadi UFLA SIL51和L. hilgadi UFLA SIL52对甘蔗进行青贮可以改善其发酵品质,与对照组相比,产生的乙酸和1,2-丙二醇含量较高,乙醇和丁酸含量较低;在青贮61 d后,添加L. hilgadi UFLA SIL51和L. hilgadi UFLA SIL52组青贮饲料中乳酸菌数最多,酵母菌数较少。因此,推荐L. hilgadi UFLA SIL51和L. hilgadi UFLA SIL52作为甘蔗青贮添加剂。司华哲等[32]在紫花苜蓿青贮饲料中添加L. buchneri H4001,结果表明,添加L. buchneri H4001可显著减少青贮饲料中乳酸和粗蛋白质的损失,显著提高乙酸含量,改善了青贮饲料的有氧稳定性。也有研究表明,在低干物质全株玉米青贮饲料中添加L. buchneri提高了青贮饲料的干物质指数[33]。
在动物生产方面,Nkosi等[34]研究表明,与对照组相比,饲喂添加L. buchneri NCIMB 40788的全株玉米青贮饲料的羔羊干物质、粗蛋白质和有机物的摄入量更高,最终体重和平均日增重更高。饲喂添加L. buchneri 40788的紫花苜蓿青贮饲料提高了奶牛的产奶量[35]。较为合适的解释为,乳酸菌在发酵过程中,能使青贮饲料中的大分子蛋白质降解为游离氨基酸和小分子多肽,为机体提供营养物质和促进胃肠道消化吸收;还能在宿主体内分泌产生多种消化酶分解转化抗营养因子,从而提高动物的生产性能[36-37]。Russell等[38]研究报道,在猪的必需氨基酸中,芽孢杆菌含有其中的49%。Rossi等[39]在玉米青贮饲料中添加L. buchneri,然后向羔羊饲喂添加L. buchneri的玉米青贮饲料,结果表明,L. buchneri不影响发酵的最终产物和玉米青贮后淀粉的利用率,对动物的采食量也没有直接影响。目前,使用添加了异型发酵乳酸菌的青贮饲料饲喂动物,对动物的生产性能的影响还没有统一结论,因此,相关动物试验还需进一步深入研究。
1.3 非乳酸菌微生物添加剂
近年来国内外学者对微生物添加剂的研究不断深入,其中有一大研究方向便是探究非乳酸菌微生物添加剂在青贮饲料上的应用效果。此类微生物添加剂主要包括丙酸杆菌(Propionibacterium)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
Propionibacterium可以将乳酸发酵成乙酸和丙酸,这2种酸有着较强的抗真菌活性,能抑制不良微生物的繁殖生长,进而改善青贮饲料的有氧稳定性[40]。Sawall[40]研究表明,青贮玉米在添加Propionibacterium后pH降低,乙酸和丙酸含量提高,同时在有氧暴露期间,测得的酵母菌数量较低。添加Propionibacterium能提高玉米秸秆青贮饲料的有氧稳定性,具体表现在好氧暴露7 d后,未添加组的pH由3.39升到5.3,添加Propionibacterium组pH由3.5升到4.11[41]。Bacillus subtilis被认为可以通过抑制酵母菌的生长来提升青贮饲料的有氧稳定性[42]。在比较添加或不添加Bacillus subtilis对玉米青贮饲料有氧稳定性影响的研究报告中得出,添加Bacillus subtilis组中的酵母菌数量最少,有氧稳定性最佳[43]。也有研究报道,添加Bacillus subtilis的玉米青贮对于羔羊的生长性能没有表现出相关的联系[44]。Bacillus subtilis能产生复合纤维素酶和淀粉酶,能将结构性多糖降解为单糖,促进乳酸菌发酵,因此在青贮饲料中添加Bacillus subtilis与乳酸菌复合制剂也是今后研究热点。
2 酶制剂
青贮饲料中的纤维素、半纤维素及木质素的含量很高,若在青贮发酵的过程中得不到有效分解,将导致发酵底物不足,影响乳酸菌繁殖生长。在青贮饲料中加入纤维素酶可以促进植物细胞壁的分解,使纤维成分分解为单糖,促进乳酸菌发酵。纤维素酶是一类由多个具有协同促进作用的酶组成的复合酶系,也是催化降解纤维素及其衍生物生成葡萄糖的一组酶的总称[45]。纤维素酶主要由内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成,在催化降解纤维素时,3种酶必须同时参加降解过程,才能够从纤维分子的非还原端破坏纤维素晶体结构,释放简单糖类[46]。同时,纤维素酶在改善青贮饲料青贮品质和提高动物生产性能方面的效果也较为显著[6]。在柱花草青贮饲料中添加纤维素酶,结果表明,添加纤维素酶能显著提升柱花草青贮饲料的干物质和粗蛋白质含量,显著降低pH和纤维含量[47]。Li等[48]研究表明,在王草青贮饲料中添加纤维素酶,添加纤维素酶组的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量低于对照组,干物质体外消化率、代谢能和粗蛋白质含量高于对照组。在苜蓿青贮饲料中添加纤维素酶,与对照组相比,添加纤维素酶组有更低的pH和氨态氮含量,更高的水溶性碳水化合物和乳酸含量[49]。在狼尾草青贮饲料中添加纤维素酶,青贮60 d后,与对照组相比,添加纤维素酶促进了木质纤维素的降解,降低了木质纤维素结晶度,提高了纤维素在狼尾草青贮的转化率,并且酶糖化作用较好,说明添加纤维素酶是一种十分有用的青贮饲料预处理方法[50]。Dehghani等[51]的研究也表明,添加纤维素酶能够直接水解青贮饲料中纤维物质,在降低玉米秸秆青贮饲料的中性洗涤纤维含量方面最有效。Kaewpila等[6]研究了添加纤维素酶对纳麦草青贮饲料的影响,结果显示,与对照组相比,添加纤维素酶组的pH更低,乳酸含量更高,并且添加双倍剂量的纤维素酶提高了青贮饲料的体外干物质消化率和产气动力学参数。也有一些研究表明,高糖分原料添加纤维素酶比低糖分原料添加纤维素酶的青贮效果要好得多[52]。在不同切割高度的玉米青贮饲料中添加纤维素酶,添加纤维素酶组中乙酸、乙醇及酵母菌的含量高于对照组,pH和中性洗涤纤维含量低于对照组,对瘤胃体外降解率无显著影响[53]。纤维素酶对青贮饲料的发酵品质和营养价值不一定全是积极影响。酶的适宜温度和适宜添加量、青贮时间及青贮原料种类等都会影响纤维素的分解,从而影响青贮饲料的青贮效果。
在动物生产方面,Refat等[54]研究报道,在大麦青贮饲料中添加纤维素酶,并饲喂高产奶牛,结果表明,当纤维素酶添加量为0.75 mL/kg时,奶牛的产奶效率、乳脂矫正乳产量及饲料消化率均能得到有效提高。刘文奇[55]研究表明,饲喂添加酶制剂的全株玉米青贮饲料能显著提高奶牛的产奶量。李旭华等[56]研究也表明,饲喂添加复合酶制剂(木聚糖酶+纤维素酶)的稻草与玉米秸秆混合青贮饲料能显著提高奶牛的产奶量。较为合适的解释为,青贮饲料中的纤维素及其衍生物能够被纤维素酶制剂催化降解,打破由纤维素、果胶、半纤维素及木质素共同构成的细胞壁屏障,细胞壁内的营养物质能够得到释放,进而与消化酶作用,提高了饲料消化率,改善了动物生长性能。但也有研究表明,大麦青贮饲料添加复合酶制剂时,虽然pH快速降低,但是对肉牛的生长性能及酮体性能没有任何影响,青贮饲料有氧稳定性的降低可能是导致这种结果的原因[57]。因此,使用添加纤维素酶的青贮饲料饲喂动物,其对动物的生产性能的影响还需进一步研究与探讨。
3 复合生物性添加剂
随着生物性添加剂不断深入的研究,多功能复合生物性添加剂已成为当前的研究热点,复合生物性添加剂能减少青贮步骤,提升青贮效率,在青贮饲料发酵品质和有氧稳定性方面有着显著的改善效果。并且大部分研究表明,复合生物性添加剂的青贮效果好于单一生物性添加剂的青贮效果。
3.1 菌种组合
若使同型发酵乳酸菌和异型发酵乳酸菌联合接种青贮饲料,发挥出不同类型发酵乳酸菌的优势,可以达到快速促进发酵、减少发酵损失、提高青贮饲料有氧稳定性的目的[58]。发酵饲料有氧腐败变质主要是由酵母菌和霉菌等有害微生物增殖引起的[59]。Zhang等[60]研究了L. buchneri与L. plantarum单独或联合使用对紫花苜蓿青贮饲料的影响,结果显示,复合添加组的青贮饲料中醋酸和可溶性碳水化合物含量高于2种乳杆菌单独添加组,氨态氮和酵母菌含量最低;并且,在有氧暴露期间,复合添加组的青贮饲料中二氧化碳和霉菌数量最低,有氧稳定性最佳。Wang等[61]在鞭草青贮饲料中添加L. buchneri和L. plantarum复合制剂,发酵90 d后,与单独添加L. plantarum组相比,复合添加组的青贮饲料中乙酸含量更高,导致霉菌和酵母菌活性降低;同时,在有氧暴露期间,测得复合添加组的青贮饲料中pH、二氧化碳产量以及霉菌和酵母菌数量均低于单独添加L. plantarum组,改善了鞭草青贮饲料的有氧稳定性。Li等[62]研究了添加L. plantarum MTD1和L. buchneri 40788+戊糖片球菌(Pediococcus pentosus)12455对苜蓿青贮饲料的影响,与添加L. plantarum MTD1组相比,复合添加组的青贮饲料中乙酸和1,2丙二醇含量更高,有氧稳定性显著升高。Nkosi等[34]研究表明,在有氧暴露中,与添加L. buchneri NCIMB 40788相比,添加复合菌种(Pediococcus pentosus NDM 12834+L. plantarum DSM 12837+L. buchneri DSM 12856)的全株玉米青贮饲料的有氧稳定性更好,表现为pH和二氧化碳产量更低,乙酸含量更高。Auerbach等[63]在黑麦青贮饲料中添加以L. buchneri CNCM-I 4323和乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)DSM 11673为基础的异型和同型发酵乳酸菌组合,与添加同型发酵乳酸菌组合[L. plantarum DSM 16627+副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)NCIMB 30151]相比,具有更高的乙酸、丙酸和1,2丙二醇含量,并且酵母菌和霉菌数量低于可检测水平;同时,添加异型和同型发酵乳酸菌组合在整个有氧暴露期间保持了青贮饲料的有氧稳定性(>240 h),很大程度上抑制了青贮饲料的有氧变质。因此,相比于单一添加同型发酵乳酸菌或异型发酵乳酸菌,复合添加是一种更为理想的发酵方式。此外,相同发酵类型菌株复合青贮也比单一菌株青贮效果更好。Da Silva等[64]研究了L. hilgadi和L. buchneri单独或联合使用对高水分玉米青贮饲料的影响,青贮30 d后,复合添加组的青贮饲料的中乙酸和1,2丙二醇含量高于对照组和单独添加组。L. hilgadi和L. buchneri联合使用产生的抗真菌化合物对酵母菌具有抑制作用,能在极短的青贮时间内提高高水分含量玉米的有氧稳定性,比单独添加L. hilgadi或L. buchneri的效果更好。Gandra等[28]研究表明,向日葵青贮饲料中复合添加L. buchneri和Bacillus subtilis比单独添加L. buchneri更有效,具体表现在复合添加组的青贮饲料中丁酸含量更低,乙酸含量更高。因此,非乳酸菌微生物添加剂与同型或异型发酵乳酸菌联合使用也为研发新型复合生物性添加剂提供了新思路。
在动物生产方面,大部分研究表明,给动物饲喂添加复合菌种添加剂的青贮饲料,在一定程度上能改善动物的生产性能。Addah等[65]在大麦青贮饲料中添加复合菌剂(L. buchneri LN4017+L. plantarum LP7109+L. casei LC3200),青贮前7 d,复合添加组表现为全乳酸发酵,pH迅速下降,之后乙酸含量显著高于对照组,提高了青贮饲料有氧稳定性;并且,饲喂复合添加组青贮饲料的生长牛的饲料转化率和平均日增重高于对照组。刘晗璐等[66]研究了添加复合菌种[L. plantarum+蒙氏肠球菌(Enterococcus Montessori)]的无芒雀麦青贮饲料对西门塔尔牛生产性能的影响,结果显示,与对照组相比,添加复合菌种可以增加西门塔尔牛干物质采食量、产奶量、乳脂肪及乳蛋白质含量。王栋才等[67]在玉米青贮饲料中添加复合菌种(L. plantarum+Pediococcus pentosus)并饲喂奶牛,结果表明,与对照组相比,饲喂添加复合菌种的玉米青贮饲料提高了乳蛋白率、乳脂率、产奶量和乳糖率,改善了奶牛生产性能和乳品质。Nair等[68]研究了玉米青贮饲料添加L. hilgadi CNCM 1-4785和L. buchneri NCIMB 40788对生长肉牛的影响,结果表明,与对照组相比,复合添加组的青贮饲料具有较低的霉菌和酵母菌数量,较高的乙酸含量和有氧稳定性;但是,给生长肉牛饲喂添加复合制剂的青贮饲料后,对生长肉牛的平均日增重、最终体重和干物质采食量均无显著改善效果。以上结果表明,复合制剂不影响生长肉牛的生长性能,饲喂复合制剂组的肉牛往往比饲喂对照组青贮饲料的肉牛具有更高的饲料效率。
3.2 菌酶组合
在饲料原料青贮初期,乳酸菌接种青贮饲料产生大量乳酸,快速引起pH下降,造成酸性厌氧环境,抑制梭菌、霉菌等不良微生物的繁殖生长,从而有效提高饲料的青贮品质。在青贮发酵过程中,纤维素酶在促进乳酸菌大量繁殖发酵方面上发挥着重要作用。Tian等[69]研究了L. plantarum+Pediococcus acidilactici和纤维素酶单独或联合使用对羊草青贮饲料的影响,结果表明,与对照组和单独添加纤维素酶组相比,复合添加组的青贮饲料中乳酸含量最高,pH最低,有效提高了羊草青贮饲料的发酵质量;并且,与单独添加纤维素酶组相比,复合添加组的青贮饲料具有较高的酸性洗涤纤维和酸性洗涤剂木质素含量。复合添加L. plantarum和纤维素酶能显著降低玉米秸秆青贮饲料pH,降低pH的效果比单独添加L. plantarum的效果更强[70]。Zhao等[71]将纤维素酶和乳酸菌[乳酸杆菌(Lactobacillus)+L. plantarum]添加于豆渣和玉米秸秆混合青贮饲料,结果显示,Lactobacillus+L. plantarum和纤维素酶复合添加组的青贮饲料pH和氨态氮含量低于Lactobacillus+L. plantarum单独添加组和纤维素酶单独添加组,乳酸和蛋白质含量更高,提高了青贮饲料的发酵品质;同时,复合添加组的青贮饲料中未检测出酵母菌和霉菌,乳酸菌数量及瘤胃干物质和粗蛋白质降解率最高。菌酶复合添加使青贮饲料的瘤胃降解率和微生物多样性得到了改善,为豆渣和玉米秸秆在乳制品生产中的更好应用提供了新思路。此外,与添加L. plantarum CGMCC10516+L. buchneri BNCC189797或纤维素酶相比,菌酶复合添加显著降低了马铃薯渣与玉米秸秆混合青贮饲料的pH,增加了青贮饲料的水溶性碳水化合物含量,改善了混合青贮饲料的发酵品质和营养价值[72]。因此,在青贮饲料中使用复合菌酶制剂能弥补单一添加剂的缺陷,提高青贮饲料的利用率,有效改善青贮饲料的发酵品质及营养价值。
菌酶制剂对青贮饲料有氧稳定性影响的报道还较少,但部分研究表明,添加复合菌酶制剂比添加单一菌制剂或酶制剂青贮效果更好。Zhang等[73]在湿玉米蛋白质饲料和玉米秸秆全混合日粮青贮饲料中添加乳酸菌(L. plantarum CGMCC10516+L. buchneri BNCC189797)+纤维素酶复合制剂和纤维素酶制剂,结果显示,与单独添加纤维素酶组相比,复合添加菌酶组的乳酸和乙酸含量较高且更稳定,pH升高较慢,酵母菌数较少,降低了微生物多样性,提高了青贮饲料的有氧稳定性。贺婷婷等[74]研究了L. plantarum和纤维素酶对油莎豆青贮饲料有氧稳定性的影响,结果表明,L. plantarum和纤维素酶复合添加组的有氧稳定性显著高于L. plantarum组和纤维素酶组,达到115 h。此外,在玉米秸秆青贮饲料中,L. buchneri和纤维素酶复合添加组的有氧稳定性显著高于L. buchneri组和纤维素酶组,达367 h[75]。然而,在高分水含量苋菜与稻草混合青贮饲料中添加纤维素酶和L. plantarum,结果表明,添加了菌酶制剂的青贮饲料在有氧暴露2 d后出现腐败变质现象,而单独添加L. plantarum或纤维素酶的青贮饲料在4 d后依然保持稳定[76]。因此,菌酶制剂对青贮饲料有氧稳定性的影响还需进一步探讨。
部分研究表明,给动物饲喂添加了复合生物性添加剂的饲粮,相关生产性能均能得到有效改善。张乃锋等[77]研究了L. plantarum+纤维素酶对奶牛生产性能的影响,结果显现,饲喂复合添加青贮饲料组的奶牛的乳脂率、产奶量和乳糖率高于对照组,牛奶体细胞数低于对照组,奶牛生产性能有所提高。Ando等[78]研究表明,在肉羊几内亚草青贮饲料中添加鼠李乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)NGRI0110+纤维素酶,与添加纤维素酶相比,其自主采食量更高。王璐等[79]在全株玉米青贮饲料中添加菌酶制剂和酶制剂,并饲喂泌乳奶牛,结果表明,菌酶制剂组的采食量、产奶量及乳蛋白、乳糖含量高于酶制剂组,改善了泌乳奶牛的生产性能。
3.3 转基因菌酶组合
随着生物技术不断运用在青贮饲料添加剂上,研发具有新性状特点的微生物菌株成为当前一大热点。例如,使乳酸菌含有纤维素酶基因,可以有效降解纤维素、木质素、半纤维素等结构性碳水化合物为单糖或二糖。Liu等[80]从里氏木霉(Trichoderma reesei)中分离出高效表达的纤维素酶基因并转移至乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MG1363中,与对照组相比,具有纤维素酶基因的Lactococcus lactis MG1363能促进高水分紫花苜蓿青贮饲料中木质纤维的降解。Rossi等[81]研究了对重组L. plantarum作为微生物添加剂用于紫花苜蓿青贮发酵的影响,利用无载体克隆技术,对L. plantarum LP80和L. plantarum B41进行了基因改造,获得了编码Bacillus subtilis的碱性β-1,4-葡聚糖内切酶基因;在青贮试验中向紫花苜蓿青贮饲料添加重组菌种,结果显示,只有L. plantarum B41AC1在青贮饲料中表现出更高的酸化能力,显著降低了青贮饲料pH,证明了利用纤维素酶重组菌株作为青贮添加剂的优势。王智伟[82]从白蚁体内筛选出产高活性纤维素酶的菌株,然后克隆其纤维素酶基因,同时构建乳杆菌表达载体,使纤维素酶基因能在乳杆菌上表达,最终形成重组菌种;在青贮试验中向玉米秸秆、苜蓿添加重组菌种,与野生菌种发酵相比,玉米秸秆、苜蓿的粗纤维含量分别降低了12%和11.8%。Ozkose等[83]通过聚合酶链反应扩增从厌氧瘤胃真菌(Neocallimastix sp)中获得纤维素酶基因的编码区,然后将该基因转化到pCT载体系统中,并通过电穿孔将构建的重组质粒导入到2种Lactococcus lactis(Lactococcus lactis IL403和Lactococcus lactis MG1363S)中,使转基因Lactococcus lactis作为青贮添加剂,结果表明,添加2种转基因Lactococcus lactis均降低了青贮饲料的酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量。Liu等[84]通过分泌和表面表达技术从麦氏喙枝孢霉(Rhinocladiella mackenziei)CBS 650.93中分离出乳糖水解酶(Lactonohydrolase),并使其在罗氏乳杆菌(Lactobacillus rogosae)中表达;在体外消化模型系统中,Lactobacillus rogosae能有效降解玉米粉中的玉米赤霉烯酮,成为一种发展潜力巨大的玉米赤霉烯酮降解剂。利用转基因技术很容易获得具有纤维素酶基因的菌株,生产应用效果也十分显著,但在实际生产中我们也需要考虑转基因菌株对环境和动物健康的影响。
4 小结
随着畜牧业的快速发展以及对青贮饲料的需求不断增加,生物性添加剂由于其具有高效、环保等特性被广泛运用在青贮饲料生产上,从而改善青贮饲料品质以满足反刍动物对饲料营养的需求。并且,生物性添加剂种类繁多,仅乳酸菌种类就达200多种,可见生物性添加剂在保障饲料供应和推动畜牧业可持续发展方面上具有重大意义。综上所述,未来生物性添加剂可以从以下几方面进行探索研究:1)生物性添加剂应着重向提高饲料利用率、防止青贮饲料有氧腐败、保证青贮饲料饲喂品质及安全3方面开展研究。总而言之,生物性添加剂要以高效、环保和低成本的方式解决饲料供应不平衡的问题,进而推动畜牧业可持续发展。2)目前,生物性添加剂对动物生产性能的改善还很难解释,因此未来生物性添加剂应着重对动物生长繁殖等过程产生作用的机理和机制展开研究。3)大部分复合生物性添加剂的青贮效果好于单一添加剂的青贮效果,可针对不同效果将多种菌株或酶进行优化组合,发挥出其各自优点,形成协同作用减少青贮步骤,提高青贮饲料的发酵品质和有氧稳定性及反刍动物的生产性能。4)利用转基因、酶工程等生物技术结合相关交叉学科将纤维素酶基因转入到乳酸菌中,使乳酸菌具有纤维素酶基因,获得有效降解结构性碳水化合物的能力,为自身生长繁殖提供充足的发酵底物。
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