动物营养学报 >

2023 , Vol. 35 >Issue 3: 1863 - 1869

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.175

研究论文

不同灵芝菌株发酵小麦秸秆对纤维降解及营养成分变化的影响

  • 高旭红 , 1 ,
  • 毛磊 1 ,
  • 徐立春 2 ,
  • 梁小军 , 1, *
展开
  • 1 宁夏农林科学院动物科学研究所,银川 750002
  • 2 宁夏职业技术学院,银川 750002
*梁小军,研究员,E-mail:

高旭红(1992—),女,宁夏吴忠人,硕士研究生,从事动物营养与饲料资源开发。E-mail:

收稿日期: 2022-09-06

  网络出版日期: 2023-03-16

基金资助

宁夏农林科学院农业高质量发展和生态保护科技创新示范项目(NGSB-2021-12-10)

财政部和农业农村部——国家现代农业(肉牛牦牛)业技术体系资助(CARS-37)

收起

Effects of Different Ganoderma lucidum Strains Fermenting Wheat Straw on Fiber Degradation and Nutrient Change

  • GAO Xuhong , 1 ,
  • MAO Lei 1 ,
  • XU Lichun 2 ,
  • LIANG Xiaojun , 1, *
Expand
  • 1 Institute of Animal Science, Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Yinchuan 750002, China
  • 2 Ningxia Polytechnic, Yinchuan 750002, China
*professor, E-mail:

Received date: 2022-09-06

  Online published: 2023-03-16

Fold

摘要

本试验旨在研究不同灵芝菌株发酵小麦秸秆对纤维降解及营养成分变化的影响。试验组选用泰山赤芝(G1组)、韩芝(G2组)、紫灵芝(G3组)和红灵芝(G4组)发酵处理小麦秸秆,对照组(CON组)小麦秸秆不接种菌株,每个处理3个重复。于23 ℃下避光培养48 d后测定发酵底物中各种营养成分含量,筛选发酵效果最优菌株。结果表明:1)与CON组比较,灵芝真菌发酵小麦秸秆可显著降低pH及乙酸、干物质、酸不溶木质素、粗纤维、中性洗涤纤维和半纤维素含量(P<0.05),显著提高粗蛋白质、粗灰分(G1组除外)、钙、磷和氨基酸含量(P<0.05),对乳酸和酸性洗涤纤维含量无显著影响(P>0.05)。2)各菌株间比较,G1组的pH显著低于G4组(P<0.05),乙酸含量显著高于G3和G4组(P<0.05),精氨酸含量显著高于G4组(P<0.05),干物质含量极著高于G4组(P<0.01),粗脂肪含量极著高于G2、G3和G4组(P<0.01),中性洗涤纤维含量显著低于G3组(P<0.05),半纤维素含量极显著低于G3组(P<0.01);G3组的粗灰分含量显著高于G1组(P<0.05),粗纤维含量极显著低于G4组(P<0.01);霉菌、丙酸和丁酸含量在各组中均未检出。综上所述,灵芝真菌能够有效降解小麦秸秆的纤维物质,提高其营养价值;其中,泰山赤芝菌株的发酵效果最优。

关键词： 灵芝真菌; 小麦秸秆; 纤维素; 营养成分

本文引用格式

高旭红 , 毛磊 , 徐立春 , 梁小军 . 不同灵芝菌株发酵小麦秸秆对纤维降解及营养成分变化的影响[J]. 动物营养学报, 2023 , 35(3) : 1863 -1869 . DOI: 10.12418/CJAN2023.175

Abstract

The purpose of this study was to investigate the effects of different Ganoderma lucidum strains fermenting wheat straw on fiber degradation and nutrient change. Taishan Ganoderma lucidum (G1 group), Ganoderma lucidum HG (G2 group), Ganoderma sinense (G3 group) and Hong Ganoderma (G4 group) were selected to ferment wheat straw, and the control group (CON group) was inoculated with strains on wheat straw, 3 replicates per treatment, and all cultured at 23 °C for 48 d in the dark. After the fermentation, determined nutritional indexes of the substrate to screen the best strains. Results showed as follows: 1) compared with CON group, the pH and the contents of acetic acid, dry matter (DM), acid detergent lignin (ADL), crude fiber (CF), neutral detergent fiber (NDF) and hemicellulose (HC) in wheat straw fermented by Ganoderma lucidum fungi were significantly reduced (P<0.05); the contents of crude protein, crude ash (except G1 group), calcium, phosphorus and amino acids were significantly increased (P<0.05), but there was no significant effect on lactic acid and acid detergent fiber (ADF) contents (P>0.05). 2) Comparison among strains, the pH in G1 group was significantly lower than that in G4 group (P<0.05), the content of acetic acid was significantly higher than that in G3 and G4 groups (P<0.05), the content of arginine was significantly higher than that in G4 group (P<0.05), the content of DM was significantly higher than that in G4 group (P<0.01), the content of ether extract was significantly higher than that in G2, G3 and G4 groups (P<0.01), the content of NDF was significantly lower than that in G3 group (P<0.05), and the content of HC was significantly lower than that in G3 group (P<0.01); the content of ash in G3 group was significantly higher than that in G1 group (P<0.05), and the content of CF was significantly lower than that in G4 group (P<0.01); the content of ADL in G4 group was significantly lower than that in G3 group (P<0.01); mold, propionic acid and butyric acid were not detected in each group. The results indicate that Ganoderma lucidum fungi can effectively degrade the fiber content of wheat straw and improve its nutritional quality. Among them, Taishan Ganoderma lucidum has the best fermentation effect.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2023, 35(3):1863-1869]

Key words： Ganoderma lucidum fungi; wheat straw; cellulose; nutrient

秸秆是籽实收获后剩余的富含纤维的植物残留物,具有蛋白质含量低、钙和磷含量低且不平衡、纤维含量高的营养特点,是自然界中数量极大且具有多种用途的可再生生物质资源[1-2]。据统计,世界秸秆的年产量为20亿~30亿t,中国各类农作物秸秆年产量为6亿~8亿t,占全世界秸秆总产量的20%~30%[3]。秸秆饲用化已非常普遍,但多直接饲喂,其中的营养成分未能充分利用,限制了其作为反刍动物饲料的价值。
白腐真菌(white-rot fungi)属真菌门,是一类自然界降解木质素的主要微生物,可合成并分泌多种木质素降解酶类,其种类繁多。其中,灵芝(Ganoderma lucidum)属非褶菌目(Aphyllophorales),是降解木质纤维的典型菌株,其菌丝体含有蛋白质、脂肪、糖类等营养物质,这些营养物质含量均比籽实体高且吸收效果良好,在改善秸秆营养成分上有较好的潜力和应用前景[4-5]。有研究表明,灵芝在含有大量纤维素和木质素的基质中长势更好[6]。因此,利用灵芝发酵来有效降解秸秆中过量的木质纤维素,以达到改善秸秆营养价值的目的是不错的选择。
但就现有报道来看,一些关于真菌处理秸秆的研究集中在抗氧化活性和木质素降解方面,而只有少数研究比较了真菌发酵秸秆前后的营养成分。因此,本试验拟对比4株灵芝菌株对小麦秸秆纤维降解效果及营养成分的影响,旨在筛选出能够改善小麦秸秆营养价值的菌株,为真菌广泛应用于发酵秸秆饲料提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

试验用灵芝菌株均购买自某食用菌研究所,分别为泰山赤芝(G1)、韩芝(G2)、紫灵芝(G3)和红灵芝(G4)。

1.2 培养基及主要试剂

PDA固体培养基(CM0139,OXOID,英国)、碳酸钙(C12286552,麦克林,上海)、无水硫酸钙(C12504641,麦克林,上海)。

1.3 菌种活化及接种前准备

将长满真菌的试管从2 ℃冰箱取出,置于室温(20 ℃)下过夜,后转接至PDA固体培养基上,于23 ℃恒温条件下培养,直至菌丝长满整个琼脂板。将高粱籽浸泡过夜,沸水煮30 min后沥干3 h,与碳酸钙(24 g/kg)和无水硫酸钙(6.8 g/kg)搅拌均匀后,分装至530 mL带滤条的培养瓶(220 g/瓶)中,121 ℃灭菌30 min后置于超净台中冷却过夜。取2块(约1.5 cm2)长满真菌的琼脂块并接种灭菌后的高粱籽上,待真菌长满高粱籽(10 d)后,用于后续接种小麦秸秆。

1.4 小麦秸秆的预处理

选取贮存良好的宁夏本地风干小麦秸秆作为发酵底物,将其机械切碎至3~5 cm长度后,装入单孔网袋(大小:50 cm×80 cm;孔径:1.5 mm×1.5 mm)中,并置于自来水中浸泡过夜。沥水2~3 h后,将网袋中的小麦秸秆混合均匀,分装至带有滤条的培养袋(PPD50/SEU2/V19-32; Sac O2, Nevele, 比利时)中,每袋分装约270 g湿小麦秸秆。高温高压灭菌(121 ℃,1 h)后,将小麦秸秆置于超净工作台中过夜,使小麦秸秆的温度降至室温。

1.5 试验设计

试验组(G1、G2、G3和G4组)每袋接种7 g(10%风干小麦秸秆重量)长满白腐真菌的高粱籽,用封口机封口后,轻微晃动培养袋,使高粱籽与小麦秸秆混合均匀;对照组(CON组)为未接种真菌、高温高压灭菌后的小麦秸秆,每个处理3个重复。随后将接种真菌后的小麦秸秆置于恒温培养室(23 ℃)中避光培养48 d后,将各袋中的真菌发酵小麦秸秆混合均匀,取部分新鲜样品直接贮存于-20 ℃,用于测定pH、霉菌总数及有机酸含量;剩余样品烘干后用于测定纤维物质含量和营养成分含量。

1.6 pH、营养成分含量测定及计算方法

pH:取4 g发酵小麦酵秸秆新鲜样品,加入40 mL去离子水浸提40 min后用pH酸度计测定;有机酸含量使用离子色谱法测定。霉菌数量按照GB/T 13092—2006的方法测定。
干物质(DM)含量按照GB/T 6435—2014的方法测定;粗灰分(CA)含量按照GB/T 6438—2007的方法测定;粗蛋白质(CP)含量按照GB/T 6432—2018的方法测定;粗脂肪(EE)含量按照GB/T 6433—2006的方法测定;磷(P)含量按照GB/T 6437—2018的方法测定;钙(Ca)含量按照GB/T 6436—2018的方法测定;氨基酸含量按照GB/T 18246—2019的方法测定。
酸性洗涤纤维(ADF)、中性洗涤纤维(NDF)和酸不溶木质素(ADL)含量使用全自动纤维测定仪(A2000i,ANKOM,美国),参考Van Soest等[7]的方法测定;粗纤维(CF)含量按照GB/T 6434—2006的方法测定。
半纤维素(HC)=NDF-ADF;
相对饲喂价值(RFV)=[(88.9-0.779ADF)×120/NDF]/1.29。

1.7 数据统计分析

数据采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),多重比较采用Duncan氏法,结果用“平均值±标准差”表示,P<0.01表示差异极显著,P<0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 不同灵芝菌株对小麦秸秆pH和有机酸含量的影响

由表1可知,与CON组相比,灵芝真菌发酵小麦秸秆可显著降低的pH和乙酸含量(P<0.05),对乳酸含量无显著影响(P>0.05)。各菌株组间比较发现,G1组的pH显著低于G4组(P<0.05),乙酸含量显著高于G3和G4组(P<0.05)。霉菌、丙酸和丁酸在各组中均未检出。
表1 不同灵芝菌株对小麦秸秆pH和有机酸含量的影响

Table 1 Effects of different Ganoderma lucidum strains on pH and organic acid contents of wheat straw

项目
Items		 组别 Groups
CON G1 G2 G3 G4
pH 5.83±0.05c 4.23±0.19a 4.33±0.01ab 4.37±0.10ab 4.47±0.06b
霉菌 Mould/(CFU/g) — — — — —
有机酸 Organic acid/(g/kg)
乳酸 Lactic acid 7.20±0.48 8.03±1.28 8.02±0.90 7.60±2.85 7.70±2.21
乙酸 Acetic acid 66.08±2.46d 16.40±0.56c 17.10±0.72c 10.84±4.58b 5.48±2.30a
丙酸 Propionic acid — — — — —
丁酸 Butyric acid — — — — —

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

2.2 不同灵芝菌株对小麦秸秆常规营养成分含量的影响

由表2可知,与CON组相比,灵芝真菌发酵小麦秸秆可极显著降低DM含量(P<0.01),极显著提高CP、钙和磷含量(P<0.01)。各菌株组间比较发现,G1组的DM含量极显著高于G4组(P<0.01),显著高于G2组(P<0.05),与G3组差异不显著(P>0.05);G1组的EE含量极著高于G2、G3和G4组(P<0.01)。各菌株组间CP、钙和磷含量差异不显著(P>0.05)。
表2 不同灵芝菌株对小麦秸秆常规营养成分含量的影响

Table 2 Effects of different Ganoderma lucidum strains on conventional nutrient contents of wheat straw%

项目
Items		 组别 Groups
CON G1 G2 G3 G4
干物质 DM 23.42±0.59Aa 33.23±0.72Cd 31.47±0.20BCbc 32.57±1.05BCcd 31.09±0.96Bb
粗蛋白质 CP 4.29±0.24Aa 6.95±0.18Bb 6.89±0.36Bb 6.99±0.18Bb 7.00±0.11Bb
粗灰分 Ash 6.60±0.19Aa 9.35±0.29Bb 9.72±0.11Bbc 9.99±0.34Bc 9.87±0.22Bc
粗脂肪 EE 1.27±0.10BCa 1.51±0.24Ca 0.93±0.07ABb 0.89±0.08Ab 0.86±0.13Ab
钙 Ca 0.25±0.03Aa 0.44±0.01Bb 0.43±0.03Bb 0.42±0.03Bb 0.42±0.07Bb
磷 P 0.04±0.01Aa 0.06±0.01Bb 0.06±0.01Bb 0.07±0.01Bb 0.06±0.01Bb

2.3 不同灵芝菌株对小麦秸秆纤维降解效果的影响

由表3可知,与CON组相比,灵芝真菌发酵小麦秸秆可降低ADF含量(P>0.05),极显著降低ADL、CF、NDF、HC含量和RFV(P<0.01)。各菌株组间比较发现,各组间ADF含量与RFV差异不显著(P>0.05);G4组ADL含量极显著低于G3组(P<0.01),与G1和G2组差异不显著(P>0.05);G3组CF含量极显著低于G4组(P<0.01),显著低于G1和G2组(P<0.05);G1组NDF含量显著低于G3组(P<0.05),与G2和G4组差异不显著(P>0.05);G1组的HC含量极显著低于G3组(P<0.01),与G2和G4组差异不显著(P>0.05)。
表3 不同灵芝菌株对小麦秸秆纤维降解效果及相对饲喂价值的影响

Table 3 Effects of different Ganoderma lucidum strains on fiber degradation effect and relative feeding value of wheat straw%

项目
Items		 组别 Groups
CON G1 G2 G3 G4
酸不溶木质素 ADL 9.51±0.99Cc 5.56±1.88ABab 4.41±0.64ABa 7.48±1.62BCbc 4.07±0.21Aa
粗纤维 CF 37.07±1.39Ca 30.99±1.45ABbc 30.21±1.11ABc 27.40±2.36Ad 33.22±0.63BCb
中性洗涤纤维 NDF 80.07±1.33Ac 61.81±1.86Ba 63.76±2.27Bab 66.81±2.76Bb 64.21±0.31Bab
酸性洗涤纤维 ADF 49.27±1.19 46.94±2.86 46.00±1.01 45.95±2.06 49.12±0.60
半纤维素 HC 30.80±0.76Cc 14.87±4.03Aa 17.77±1.26ABab 20.86±0.73Bb 15.09±0.63Aa
相对饲喂价值 RFV 58.72±1.96Aa 78.77±3.12Bb 77.52±3.83Bb 74.10±5.34Bb 73.36±0.82Bb

2.4 不同灵芝菌株对小麦秸秆氨基酸含量的影响

由表4可知,与CON组对比,灵芝真菌发酵小麦秸秆极显著提高氨基酸(除酪氨酸)含量(P<0.01)。各菌株组间比较发现,各菌株组间的天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸和亮氨酸含量差异均不显著(P>0.05),G1组精氨酸含量显著高于G4组(P<0.05),与G2和G3组差异不显著(P>0.05)。
表4 不同灵芝菌株对小麦秸秆氨基酸含量的影响

Table 4 Effects of different Ganoderma lucidum strains on amino acid contents of wheat straw%

项目
Items		 组别 Groups
CON G1 G2 G3 G4
天冬氨酸 Aspartic acid 0.27±0.01Aa 0.41±0.01Bb 0.41±0.04Bb 0.40±0.01Bb 0.43±0.02Bb
苏氨酸 Threonine 0.14±0.01Aa 0.23±0.01Bb 0.22±0.02Bb 0.23±0.01Bb 0.22±0.01Bb
丝氨酸 Serine 0.14±0.01Aa 0.23±0.01Bb 0.23±0.02Bb 0.23±0.01Bb 0.22±0.00Bb
缬氨酸 Valine 0.18±0.01Aa 0.27±0.02Bb 0.26±0.03Bb 0.29±0.00Bb 0.29±0.00Bb
异亮氨酸 Isoleucine 0.13±0.01Aa 0.20±0.01Bb 0.19±0.01Bb 0.19±0.01Bb 0.19±0.01Bb
组氨酸 Histidine 0.05±0.01Aa 0.10±0.01Bb 0.09±0.00Bb 0.09±0.01Bb 0.09±0.01Bb
酪氨酸 Tyrosine 0.07±0.00a 0.09±0.01b 0.09±0.02b 0.08±0.00ab 0.09±0.01ab
苯丙氨酸 Phenylalanine 0.15±0.01Aa 0.19±0.01Bb 0.18±0.02Bb 0.21±0.01Bb 0.20±0.01Bb
精氨酸 Arginine 0.13±0.03Aa 0.18±0.02ABb 0.18±0.04ABb 0.20±0.01Bbc 0.24±0.01Bc
谷氨酸 Glutamate 0.38±0.02Aa 0.61±0.02Bb 0.61±0.02Bb 0.61±0.02Bb 0.62±0.01Bb
脯氨酸 Proline 0.18±0.06Aa 0.23±0.01Bb 0.24±0.01Bb 0.23±0.01Bb 0.24±0.00Bb
甘氨酸 Glycine 0.18±0.02Aa 0.24±0.02Bb 0.23±0.01Bb 0.24±0.02Bb 0.24±0.01Bb
丙氨酸 Alanine 0.20±0.01Aa 0.29±0.01Bb 0.29±0.01Bb 0.30±0.01Bb 0.29±0.01Bb
赖氨酸 Lysine 0.14±0.01Aa 0.27±0.02Bb 0.26±0.03Bb 0.27±0.02Bb 0.25±0.01Bb
亮氨酸 Leucine 0.25±0.02Aa 0.38±0.02Bb 0.36±0.04Bb 0.38±0.02Bb 0.37±0.01Bb

3 讨论

3.1 不同灵芝菌株对小麦秸秆pH和有机酸含量的影响

环境pH是白腐真菌快速生长及有效降解木质素的重要因素,较低的pH也能有效地防止霉菌和酵母菌等好气性有害微生物的生长,有利于发酵饲料的长期稳定保存[8-9]。灵芝是好氧菌,可以迅速消耗密封环境中的氧气,促进乳酸发酵的起始[10]。丙酸和乙酸可由细菌将乳酸代谢生成,丁酸主要是由梭状芽胞杆菌和霉菌等腐败菌活动产生的,因此它们的生成量与发酵饲料品质呈负相关[11]。本试验结果显示,灵芝真菌能显著降低小麦秸秆的pH(4.50以下)和乙酸含量,提高乳酸含量。其中,G1组乳酸含量最高,比CON组高11.53%。各试验组发酵秸秆均未检出丙酸和丁酸,也未发现霉菌。这说明本试验条件下,灵芝菌株生长良好,发酵小麦秸秆品质良好,未发生腐败变质。

3.2 不同灵芝菌株对小麦秸秆常规营养成分含量的影响

在真菌生长后,真菌菌丝体也有助于提高固态发酵材料的营养价值。灵芝有着系统的理论背景,传统中药和研究已证实其含有400多种生物活性化合物,可用于改善反刍动物饲料的营养价值[12]。王雨琼等[13]用3种白腐真菌处理青稞秸秆21 d,使CP、EE含量分别增加5.50%~44.25%、13.66%~40.09%,但粗灰分含量将有所降低。El-Fallal等[14]用白腐真菌P. sajorcaju、P. columbinus和P. floridanus混合处理小麦秸秆后,CP含量提高了3.5倍,EE含量提高了33.33%。本试验中,通过灵芝真菌的处理,小麦秸秆的DM含量提高了32.75%~41.89%,CP含量提高了60.61%~63.17%,这可能是由于灵芝菌丝体生长导致的结果。粗灰分、钙和磷含量分别提高了41.67%~56.36%、68.00%~76.00%和50.00%~75.00%,只有G1组的EE含量增加了18.90%。这说明灵芝真菌能将小麦秸秆中不可利用的木质纤维素有效转化为动物可利用的其他营养成分。

3.3 不同灵芝菌株对小麦秸秆纤维降解效果的影响

众所周知,利用微生物处理秸秆具有耗能小、成本低、安全无污染的优点。而白腐真菌破坏秸秆木质纤维素结构的能力十分强大,能够在纯培养的条件下将木质素完全降解为二氧化碳和水,这对于秸秆资源的利用具有重要意义[15]。Nur-Nazratul等[16]在油棕空果串上接种灵芝菌株12周后,使木质素、纤维素和半纤维素分别降解了41.00%、20.50%和26.70%。张芳芳等[17]在玉米秸秆上接种白腐真菌(B.fumosa ZT-307)30 d对纤维素和木质素的降解效率分别为4.50%和21.87%。张爱武等[18]使用白腐真菌B681发酵玉米秸秆7 d后其粗纤维含量下降了14.14%。本试验结果表明,灵芝真菌在降解小麦秸秆纤维成分,尤其是木质素上效果非常显著,其中G1组ADL、CF、ADF、NDF和HC分别降解了41.54%、16.40%、4.73%、22.81%和51.72%,RFV显著提高。这是由于灵芝菌株分泌的木质素和纤维素降解酶是一种胞外酶,能穿入木质细胞腔内获取营养,以达到降解木质纤维的目的[19]。

3.4 不同灵芝菌株对小麦秸秆氨基酸含量的影响

补充必需氨基酸可提高动物生产效率,尤其是必需氨基酸只能从饲粮中额外摄取,因此在饲粮配方中需要考虑添加富含氨基酸的饲料原料,以确保满足家畜的营养需求[20]。已有研究表明,白腐真菌生长过程中能提高培养基中氨基酸含量。Wang等[21]在(25±5) ℃条件下,使用侧耳真菌P. sajorcaju发酵玉米秸秆21 d后,必需氨基酸含量增加了1.25~2.14倍。Shrivastava等[22]在(30±2) ℃条件下,使用白腐真菌Crinipellis sp.RCK-1发酵水稻秸秆5 d后,氨基酸含量显著提高大约2倍。罗莹等[23]发现,灵芝固态发酵的黄豆培养基和黑豆培养基相对未发酵原料具有更好的营养价值,能提高氨基酸和必需氨基酸总量。本试验结果表明,灵芝菌株均能提高试验组小麦秸秆的氨基酸含量,其中G1菌株的效果较好,可使各氨基酸含量提高67%~100%,效果十分显著。这说明小麦秸秆能够为灵芝菌株生长过程中合成微生物蛋白提供充足的营养,导致氨基酸含量的增加。

4 结论

灵芝真菌能够有效降解小麦秸秆的纤维物质含量,提高其营养价值。其中,泰山赤芝菌株的发酵效果较好,可用于改善小麦秸秆的饲用价值。

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