动物营养学报 >

2023 , Vol. 35 >Issue 3: 1976 - 1954

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.185

研究论文

白术多糖缓解环磷酰胺诱导的岭南黄鸡氧化应激和肝脏细胞凋亡

  • 陈浩祥 , 1, 2 ,
  • 杨舒展 3 ,
  • 陆智儿 1 ,
  • 钱隆 1, 2 ,
  • 李冰心 1, 2 ,
  • 李婉雁 1, 2 ,
  • 田允波 1, 2 ,
  • 黄运茂 1, 2 ,
  • 许丹宁 1, 2 ,
  • 曹楠 , 1, 2, *
展开
  • 1 仲恺农业工程学院动物科技学院,广州 510225
  • 2 广东省水禽健康养殖重点实验室,广州 510225
  • 3 广州海关技术中心,广州 510000
*曹 楠,副教授,硕士生导师,E-mail:

陈浩祥(1997—),男,广东佛山人,硕士研究生,从事动物营养免疫研究。E-mail:

收稿日期: 2022-09-15

  网络出版日期: 2023-03-16

基金资助

广东省自然科学基金面上项目(20220501605)

湖南省自然科学基金面上项目(2021JJ30312)

收起

Polysaccharide of Atractylodes macrocephala Koidz Alleviates Cyclophosphamide Induced Oxidative Stress and Apoptosis in Liver of Lingnan Yellow Chickens

  • CHEN Haoxiang , 1, 2 ,
  • YANG Shuzhan 3 ,
  • LU Zhier 1 ,
  • QIAN Long 1, 2 ,
  • LI Bingxin 1, 2 ,
  • LI Wanyan 1, 2 ,
  • TIAN Yunbo 1, 2 ,
  • HUANG Yunmao 1, 2 ,
  • XU Danning 1, 2 ,
  • CAO Nan , 1, 2, *
Expand
  • 1 College of Animal Science and Technology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China
  • 2 Guangdong Province Key Laboratory of Waterfowl Healthy Breeding, Guangzhou 510225, China
  • 3 Technical Center, Guangzhou Customs, Guangzhou 510000, China
*associate professor, E-mail:

Received date: 2022-09-15

  Online published: 2023-03-16

Fold

摘要

本研究旨在探索白术多糖(PAMK)对环磷酰胺(CTX)诱导的岭南黄鸡氧化应激和肝脏细胞凋亡异常的调节作用。选用240只健康1日龄岭南黄鸡,随机分成4个组,每组6个重复,每个重复10只鸡。对照组和环磷酰胺组(CTX组)饲喂基础饲粮,白术多糖组(PAMK组)和白术多糖+环磷酰胺组(PAMK+CTX组)饲喂添加400 mg/kg PAMK的基础饲粮。在20、21、22日龄时,CTX组和PAMK+CTX组的岭南黄鸡腿肌注射20 mg/kg CTX,对照组和PAMK组的岭南黄鸡腿肌注射0.5 mL生理盐水。试验期27 d。结果显示:与CTX组相比,PAMK+CTX组肝脏细胞凋亡现象有所缓解,肝脏细胞状态有所恢复,炎性浸润程度有所降低,点状坏死灶数量明显减少;此外,血清丙二醛(MDA)含量显著下降(P<0.05),血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著升高(P<0.05),肝脏组织半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)的蛋白相对表达量和半胱氨酸蛋白酶9(Caspase9)的mRNA相对表达量显著下调(P<0.05)。由此可见,PAMK能够缓解由CTX引起的岭南黄鸡氧化应激和肝脏细胞凋亡增多的现象。

关键词： 岭南黄鸡; 白术多糖; 环磷酰胺; 肝脏; 氧化应激; 细胞凋亡

本文引用格式

陈浩祥 , 杨舒展 , 陆智儿 , 钱隆 , 李冰心 , 李婉雁 , 田允波 , 黄运茂 , 许丹宁 , 曹楠 . 白术多糖缓解环磷酰胺诱导的岭南黄鸡氧化应激和肝脏细胞凋亡[J]. 动物营养学报, 2023 , 35(3) : 1976 -1954 . DOI: 10.12418/CJAN2023.185

Abstract

The purpose of this study was to explore the regulatory effects of polysaccharide of Atractylodes macrocephala Koidz (PAMK) on cyclophosphamide (CTX) induced liver oxidative stress and abnormal apoptosis in liver of Lingnan yellow chickens. Two hundred and forty healthy 1-day-old Lingnan yellow chickens were randomly divided into 4 groups with 6 replicates per group and 10 chickens per replicate. Chickens in control group and polysaccharide of Atractylodes macrocephala Koidz group (PAMK group) were fed a basal diet, and the others in cyclophosphamide group (CTX group) and polysaccharide of Atractylodes macrocephala Koidz+cyclophosphamide group (PAMK+CTX group) were fed a basal diet supplemented with 400 mg/kg PAMK. At 20, 21 and 22 days of age, the Lingnan yellow chickens in CTX group and PAMK+CTX group were injected with 20 mg/kg CTX into leg muscles, and the Lingnan yellow chickens in control group and PAMK group were injected with 0.5 mL normal saline into leg muscles. The experiment lasted for 27 days. The results showed that compared with CTX group, the apoptosis of liver in PAMK+CTX group was alleviated and the state of liver cells was restored, the degree of inflammatory infiltration was reduced, and the number of punctate necrotic foci was obviously reduced; in addition, the serum malondialdehyde (MDA) content was significantly decreased (P<0.05), the activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in serum were significantly increased (P<0.05), and the protein relative expression level of cysteinyl aspartate specific proteinase 3 (Caspase3) and mRNA relative expression level of cysteinyl aspartate specific proteinase 9 (Caspase9) in liver tissue were significantly down-regulated (P<0.05). In conclusion, the PAMK can alleviate the oxidative stress and increase of liver cell apoptosis caused by CTX in Lingnan yellow chickens.

Key words： Lingnan yellow chickens; polysaccharide of Atractylodes macrocephala Koidz; cyclophosphamide; liver; oxidative stress; apoptosis

氧化应激是机体中自由基和抗氧化物质之间的氧化还原水平不平衡,抗氧化能力相对不足,活性氧积累,生物大分子遭到破环进而导致的机体损伤[1]。在家禽养殖过程中,天气变化、环境污染、饲粮更换、病原微生物感染等应激源会导致家禽肝脏发生氧化应激,降低生产性能,减少经济效益,影响家禽产业的发展[2]。此外,动物肝脏的氧化应激反应可以直接或者间接地调控凋亡相关基因的表达,影响凋亡信号转导系统,介导细胞发生凋亡[3]。肝脏在动物机体中不仅可以代谢废物、分泌排泄胆汁,还参与固有免疫系统来保障动物健康。因此,异常的氧化应激和肝脏细胞凋亡会对畜禽健康水平产生不良影响[4]。
白术是一种重要的中药材,其主要活性成分白术多糖(polysaccharide of Atractylodes macrocephala Koidz,PAMK)具有抗炎、抗衰老、抗肿瘤等功效。除此之外,已有众多研究证明了PAMK在调节动物免疫机能方面发挥着正向的重要的作用[5-6]。环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)是化疗常用药物,也常用于动物免疫抑制模型的建立。CTX除了可以导致畜禽免疫抑制以外,还能够引起动物机体的氧化应激反应和细胞凋亡现象[7]。为了验证PAMK对CTX引起的动物氧化应激和肝脏细胞凋亡水平异常的调节作用,本试验以岭南黄鸡为试验对象,以CTX制备氧化应激和肝脏细胞凋亡异常模型,探讨PAMK对CTX引起的岭南黄鸡氧化应激和肝脏细胞凋亡异常的缓解作用,为PAMK作为饲料添加剂的进一步开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

PAMK(含量70%)购自西安市某生物制剂厂;注射用CTX(0.2 g/瓶,国药准字H32020857)购自江苏某医药有限公司;过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司;实时荧光定量PCR染料、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Thermo Fisher公司;IP细胞裂解液、蛋白酶抑制剂(PMSF)购自碧云天生物技术研究所;半胱氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase3)、半胱氨酸蛋白酶9(cysteinyl aspartate specific proteinase 9,Caspase9)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体以及二抗均购自英国Abcam公司。

1.2 试验设计及饲养管理

将240只(公母各占1/2)1日龄岭南黄鸡随机分成4个组,每组6个重复,每个重复10只鸡,各重复之间体重差异不显著(P>0.05)。对照组和环磷酰胺组(CTX组)饲喂基础饲粮,白术多糖组(PAMK组)和白术多糖+环磷酰胺组(PAMK+CTX组)饲喂添加400 mg/kg PAMK的基础饲粮,饲喂至试验期结束。在20、21、22日龄时,CTX组和PAMK+CTX组的岭南黄鸡腿肌注射0.5 mL CTX(20 mg/kg),对照组和PAMK组的岭南黄鸡腿肌注射0.5 mL生理盐水。试验期27 d。
饲粮参照《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)配制成颗粒配合饲料,基础饲粮组成及营养水平见表1。采用笼养方式饲养于同一舍内,饲养密度根据雏鸡生长情况酌情进行安排。自由饮水,饲粮现拌现用,采取勤添少喂的方法。试验期间定时定量给料,舍内保持适宜温度、湿度及通风,保持鸡舍内的卫生。全程饲养流程、免疫程序及环境控制标准均按照广东省地方标准《岭南黄鸡Ⅱ号配套系肉鸡生产技术规范》(DB44/T 1129—2013)执行。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)%

项目 Items 含量 Content
原料 Ingredients
玉米 Corn 58.20
小麦麸 Wheat bran 8.35
次粉 Wheat middling 6.00
玉米蛋白粉 Corn protein meal 6.00
豆粕 Soybean meal 16.95
石粉 Limestone 1.55
预混料 Premix1) 2.55
合计 Total 100.00
营养水平 Nutrient levels2)
代谢能 ME/(MJ/kg) 12.60
粗蛋白质 CP 21.27
钙 Ca 1.01
总磷 TP 0.60
蛋氨酸 Met 0.50
赖氨酸 Lys 1.15

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of the diet:Cu 4.0 mg,Fe 40.0 mg,Mn 50.0 mg,I 0.2 mg,Se 0.2 mg,Zn 37.6 mg,VA 5 000 IU,VD3 10 000 IU,VE 75.0 mg,VK3 18.8 mg,VB1 9.8 mg,VB2 28.8 mg,VB6 19.6 mg,VB12 0.1 mg,烟酸 niacin 196.5 mg,D-泛酸 D-pantothenic acid 7.5 mg,叶酸 folic acid 4.8 mg,生物素 biotin 2.5 mg,氯化胆碱 choline chloride 800 mg。

2)代谢能为计算能,其余为实测值。ME was a calculated value, while the others were measured values.

1.3 样品采集和指标测定

1.3.1 样品采集与处理

27日龄时宰杀取样,宰杀前12 h对岭南黄鸡禁食。岭南黄鸡颈静脉放血处死,迅速采集肝脏组织放于液氮中保存,随后转移至-80 ℃冰箱保存备用。全血从心脏采出,于37 ℃放置30 min,3 000 r/min离心5 min后收集血清。

1.3.2 肝脏组织超微结构观察

透射电镜切片制作步骤如下:将固定在2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中的岭南黄鸡肝脏组织块固定在1%四氧化三锇中2 h,脱水、浸透、包埋、固化、制备切片,醋酸双氧铀和柠檬酸铅分别染色,观察岭南黄鸡肝脏组织超微结构。

1.3.3 肝脏组织病理学检测

剪取肝脏组织置于10%中性福尔马林固定液中,石蜡包埋,切割成5 μm切片,烤片,脱蜡,苏木精-伊红(HE)染色,风干后中性树脂封片,显微镜下观察。

1.3.4 血清氧化应激指标检测

按照南京建成生物工程研究所试剂盒的说明,检测血清CAT(泪酸胺法)、GSH-Px(比色法)、SOD(羟胺法)、iNOS活性和MDA(TBA法)含量。

1.3.5 肝脏组织Caspase3、Caspase9基因表达检测

采用Trizol法提取岭南黄鸡肝脏组织中的总RNA。严格按照TaKaRa反转录说明书将RNA反转录为cDNA,得到的cDNA于-20 ℃保存备用。以反转录的cDNA为模板,根据PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix试剂盒说明书进行操作,配制相应反应体系的溶液,使用ABI PRISM 7500系统进行检测。以GAPDH为内参,采用2-ΔΔCt方法分析Caspase3、Caspase9 mRNA相对表达量。
通过Primer 5分别设计Caspase3、Caspase9和GAPDH的引物,引物序列如表2所示。引物均由华大基因科技有限公司合成。
表2 引物序列

Table 2 Primer sequences

基因
Genes		 引物序列
Primer sequences (5'—3')		 序列号
Accession number		 产物长度
Product length/bp
甘油醛-3-磷酸脱氢酶
GAPDH		 F:TGAAAGTCGGAGTCAACGGAT
R:ACGCTCCTGGAAGATAGTGAT		 NM_204305.2 230
半胱氨酸蛋白酶3
Caspase3		 F:GCCAGGAAACTTGAACTCAT
R:GCATAGACACAATGCATGGA		 XM_046915477.1 124
半胱氨酸蛋白酶9
Caspase9		 F:TTGCCGACGTTCCATAGAGT
R:TACGCTGTCCAAGGTTTCCA		 XM_046931415.1 190

1.3.6 肝脏组织Caspase3、Caspase9蛋白表达检测

利用IP细胞裂解液及蛋白酶抑制剂提取肝脏组织总蛋白,根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书操作步骤检测蛋白浓度。根据聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶快速制备试剂盒(上海雅酶生物医药科技有限公司)制备蛋白电泳凝胶。上样电泳,转膜封闭,一抗、二抗孵育,显色后用凝胶成像系统对蛋白条带进行曝光拍照。使用ImageJ 1.8.0分析软件分析拍摄图像中灰度值。以GAPDH作为参照蛋白,蛋白相对表达量以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示。

1.4 数据统计分析

使用GraphPad Prism 5.0软件对试验数据作图,使用SPSS 20.0软件进行统计学分析。数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并通过Tukey检验进行组间多重比较,数据均表示为“平均值±标准差”,P<0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。

2 结果

2.1 PAMK对CTX处理下岭南黄鸡肝脏组织超微结构的影响

如图1所示,对照组和PAMK组雏鸡肝脏细胞形态良好,细胞器含量丰富,结构正常;另外,PAMK组雏鸡肝脏细胞浆内含有较多糖原和脂滴。CTX组雏鸡肝脏细胞凋亡现象严重,细胞器缺失现象明显,线粒体嵴结构模糊,但未见肿胀。PAMK+CTX组雏鸡肝脏细胞状态恢复良好,胞浆中线粒体嵴结构可见,但不如对照组和PAMK组清晰,粗面内质网数量也增多,糖原含量减少。
图1 PAMK对CTX处理下岭南黄鸡肝脏组织超微结构的影响

A:对照组;B:白术多糖组;C:环磷酰胺组;D:白术多糖+环磷酰胺组。图2同。

黄色箭头:细胞核凋亡;红色箭头:凋亡小体;蓝色箭头:线粒体嵴。

Fig.1 Effects of PAMK on liver tissue ultra-microstructure of Lingnan yellow chickens treated with CTX

A: control group; B: PAMK group; C: CTX group; D: PAMK+CTX group. The same as Fig.2.

Yellow arrow: nuclear apoptosis; red arrow: apoptotic body; blue arrow: mitochondrial ridge.

2.2 PAMK对CTX处理下岭南黄鸡肝脏组织病理学的影响

如图2所示,对照组和PAMK组肝脏组织结构完整,肝索清晰,呈迷路样结构,肝脏细胞排列整齐有序,形态良好,胞浆染色均匀。CTX组肝脏组织较对照组发生了明显的病理变化,肝索排列乱而无序,胞浆稀薄,出现较多点状坏死灶,肝脏细胞内出现大泡性脂滴,汇管区周围纤维增生,周围肝脏细胞坏死数量多,并有炎性细胞浸润。与CXT组相比,PAMK+CTX组肝索相对清晰可见,点状坏死灶明显减少,同时胞浆浓稠,肝脏细胞中大泡性脂滴也有所减少。
图2 PAMK对CTX处理下岭南黄鸡肝脏组织病理学的影响

□:放大部分;★:汇管区;▲:中央静脉;􀲕:异嗜性粒细胞。

Fig.2 Effects of PAMK on liver histopathology of Lingnan yellow chickens treated with CTX

□: enlarged part; ★: manifold area; ▲: central vein; 􀲕: heterophile cells.

2.3 PAMK对CTX处理下岭南黄鸡血清氧化氧化应激指标的影响

如图3所示,与对照组相比,PAMK组血清MDA含量和SOD、CAT、GSH-Px、iNOS活性无显著差异(P>0.05)。与对照组相比,CTX组血清SOD、GSH-Px、iNOS活性显著降低(P<0.05),血清MDA含量和CAT活性无显著差异(P>0.05)。与CTX组相比,PAMK+CTX组血清MDA含量显著下降(P<0.05),血清CAT、iNOS活性无显著差异(P>0.05),血清SOD、GSH-Px活性显著升高(P<0.05)。与对照组相比,PAMK+CTX组血清MDA含量显著降低(P<0.05),血清SOD、CAT、GSH-Px、iNOS活性无显著差异(P<0.05)。
图3 PAMK对CTX处理下岭南黄鸡血清氧化应激指标的影响

Control:对照组;PAMK:白术多糖组;CTX:环磷酰胺组;PAMK+CTX:白术多糖+环磷酰胺组。数据柱标无字母或相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

Fig.3 Effects of PAMK on serum oxidative stress indexes of Lingnan yellow chickens treated with CTX

Control: control group;PAMK: PAMK group;CTX: CTX group;PAMK+CTX: PAMK+CTX group. Value columns with no letter or the same small letter mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.4 PAMK对CTX处理下岭南黄鸡肝脏组织Caspase3、Caspase9的mRNA相对表达量的影响

如图4所示,与对照组相比,PAMK组肝脏组织Caspase3、Caspase9的mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)。与对照组相比,CTX组肝脏组织Caspase3的mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05),Caspase9的mRNA相对表达量显著上调(P<0.05)。与CTX组相比,PAMK+CTX组肝脏组织Caspase3的mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05),Caspase9的mRNA相对表达量显著下调(P<0.05)。与对照组相比,PAMK+CTX组肝脏组织Caspase3、Caspase9的mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)。
图4 PAMK对CTX处理下岭南黄鸡肝脏组织Caspase3、Caspase9的mRNA相对表达量的影响

Fig.4 Effects of PAMK on mRNA relative expression levels of Caspase3 and Caspase9 in liver tissue of Lingnan yellow chickens treated with CTX

2.5 PAMK对CTX处理下岭南黄鸡肝脏组织Caspase3、Caspase9蛋白相对表达量的影响

如图5所示,与对照组相比,PAMK组肝脏组织Caspase3的蛋白相对表达量显著下调(P<0.05),Caspase9的蛋白相对表达量上调(P<0.05)。与对照组相比,CTX组肝脏组织Caspase3的蛋白相对表达量无显著差异(P>0.05),Caspase9的蛋白相对表达量显著上调(P<0.05)。与CTX组相比,PAMK+CTX组肝脏组织Caspase3的蛋白相对表达量显著下调(P<0.05),Caspase9的蛋白相对表达量无显著差异(P>0.05)。与对照组相比,PAMK+CTX组肝脏组织Caspase3的蛋白相对表达量显著下调(P<0.05),Caspase9的蛋白相对表达量上调(P<0.05)。
图5 PAMK对CTX处理下岭南黄鸡肝脏组织Caspase3、Caspase9蛋白相对表达量的影响

Fig.5 Effects of PAMK on protein relative expression levels of Caspase3 and Caspase9 in liver tissue of Lingnan yellow chickens treated with CTX

3 讨论

CTX是没有前体活性的抗肿瘤药物,也因为其免疫抑制作用而被用于治疗自身免疫性疾病。CTX的使用与机体发生氧化应激有密切联系。文献报道,CTX在肝脏中经过细胞色素CYP酶的作用形成4-羟基环磷酰胺,随后形成有细胞毒性的磷酰胺氮芥和丙烯醛,而谷胱甘肽(GSH)不仅可以与丙烯醛结合消除丙烯醛的毒性,还能和磷酰胺氮芥产生硫醚产物[8]。同时大量文献表明,CTX能引起动物机体的氧化应激。CTX能诱导产生大量活性氧(ROS),耗竭GSH,抑制GSH-Px、CAT、SOD活性,减弱机体抗氧化能力,破环氧化系统和抗氧化系统的平衡,促进脂质过氧化产物MDA的生成,引发机体的氧化应激[2,9⇓-11]。
中草药或者植物中多糖成分的抗氧化效应有广阔的研究前景。张莉[12]研究发现,益气养血的芪归补血颗粒能够增加小鼠SOD、CAT、GSH-Px活性和减少MDA含量,同时增加iNOS活性和减少一氧化氮(NO)产生,展示了芪归补血颗粒的抗氧化作用。PAMK是白术中的有效活性物质,研究者们通过现代生物学技术证明了PAMK对畜禽机体免疫系统的正向调节作用。曹楠等[13]通过给雏鸡饲喂含有400 mg/kg PAMK的基础饲粮21 d,发现其平均日采食量和料重比显著降低,总增重、平均日增重、屠宰率、半净膛率、全净膛率有所提高,并增加了肝脏中双核细胞的数量,促进了肝脏的生长发育。Li等[14]研究发现,PAMK可以通过调节体液免疫和细胞免疫进而缓解CTX诱导的雏鹅免疫抑制。钱隆等[15]研究发现,PAMK可能通过Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子88(MyD88)/核因子-κB抑制蛋白激酶ε(Ikkε)-核因子κB抑制蛋白α(IκBα)信号通路缓解CTX引起的雏鹅肝脏损伤。在本试验中,饲喂含有400 mg/kg PAMK的饲粮不会影响岭南黄鸡的氧化水平和抗氧化水平。CTX处理能导致岭南黄鸡发生脂质过氧化,过多地产生脂质过氧化产物MDA,并抑制机体内抗氧化酶SOD、GSH-Px活性。MDA含量是脂质过氧化程度的重要指标,SOD、GSH-Px、CAT活性是机体抗氧化能力的体现,CTX处理下MDA含量的增多和SOD、GSH-Px活性的抑制提示着雏鸡发生氧化应激。而PAMK的治疗能减少CTX导致的脂质过氧化产物的积累,提高体内抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT活性,证明了PAMK能增强CTX处理下的抗氧化能力,减少脂质过氧化程度,缓解由CTX引起的氧化应激。
凋亡又称为细胞程序性死亡,是由基因控制的主动的细胞死亡过程。细胞凋亡会发生典型的形态学变化,如:出现凋亡小体、细胞皱缩、核固缩、DNA有序片段化等[16-17]。在凋亡的分子信号通路中,Caspase9负责启动细胞凋亡,Caspase3负责实施细胞凋亡,且Caspase3的活化,意味着细胞凋亡处于不可逆的状态。而氧化应激和细胞凋亡有着密切的联系。吴畏等[18]通过过氧化氢(H2O2)处理内皮细胞并制备氧化应激模型,发现氧化应激状态会促进内皮细胞的凋亡程度,且促凋亡基因细胞色素C(CytC)、Caspase3、Caspase9的mRNA相对表达量增加。另有文献表明,糖尿病小鼠视网膜中的Caspase3大量活化,而这种活化能被抗氧化剂所抑制;同时抗氧化剂能抑制高糖诱导的视网膜毛细血管细胞Caspase3活性增加的情况[19]。
中草药及其多糖成分不仅具有抗氧化效果,还能抑制细胞凋亡,修复组织细胞损伤。Feng等[20]研究发现,红景天苷可以通过下调B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(B-cell lymphoma-2-associated X protien,Bax)且上调B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表达来减少刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)诱导的BALB/c小鼠肝脏细胞凋亡。王霄等[21]研究发现,丹参多糖能有效缓解脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)联合D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GaIN)诱导的小鼠肝脏细胞凋亡,上调Bcl-2的表达并下调Fas配体(Fas ligand,Fas-L)和Caspase3的表达进而缓解了肝脏损伤。车金营等[22]研究发现,五味子多糖能下调小鼠肝脏磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)、Bax、Caspase3的蛋白表达,同时上调Bcl-2的蛋白表达,抑制了对乙酰氨基酚(paracetamol)诱导的肝脏细胞凋亡。在本研究中,饲喂含有400 mg/kg PAMK的饲粮不会影响岭南黄鸡肝脏细胞的凋亡水平;但注射了CTX后,上调了肝脏中Caspase9和Caspase3的mRNA相对表达量,透射电镜下也发现了凋亡小体的存在,提示着CTX的处理可能激活了内源性凋亡途径,引起岭南黄鸡肝脏细胞凋亡。在PAMK的保护作用下,岭南黄鸡肝脏组织Caspase9和Caspase3的表达都被抑制,透射电镜下未发现凋亡小体,提示凋亡相关分子信号通路被抑制,表明PAMK能够缓解CTX引起的岭南黄鸡肝脏细胞凋亡现象。

4 结论

饲粮中添加400 mg/kg PAMK可以有效降低CTX处理下岭南黄鸡的脂质过氧化程度,增强其抗氧化能力,并减少肝脏细胞的凋亡,缓解由CTX导致的岭南黄鸡氧化应激和肝脏细胞凋亡现象。

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