动物营养学报 >

2023 , Vol. 35 >Issue 4: 2557 - 2570

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.239

研究论文

饲粮中添加酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔肠道形态、肠道通透性、盲肠发酵及微生物区系的影响

  • 王国洲 , 1, 2 ,
  • 于志凯 1 ,
  • 吴峰洋 1 ,
  • 夏苗 1 ,
  • 王俊峰 3 ,
  • 刘亚娟 , 2, 4, * ,
  • 陈宝江 , 1, *
展开
  • 1 河北农业大学动物科技学院,保定 071001
  • 2 国家北方山区农业工程技术研究中心,保定 071001
  • 3 江苏奕农生物股份有限公司,宿迁 223600
  • 4 河北农业大学山区研究所,保定 071001
*刘亚娟,副研究员,硕士生导师,E-mail: ;
陈宝江,教授,博士生导师,E-mail:

王国洲(1998—),男,河北邢台人,硕士研究生,研究方向为动物营养与饲料科学。E-mail:

Copy editor: 菅景颖

收稿日期: 2022-10-21

  网络出版日期: 2023-04-12

基金资助

国家兔产业技术体系(CARS-43-B-2)

河北省农业科技园区(基地)建设专项(20536603)

收起

Effects of Dietary Supplemented with Combined Yeast-Bacillus coagulans Fermentation Culture on Intestinal Morphology, Intestinal Permeability, Cecal Fermentation and Microflora of Rex Rabbits

  • WANG Guozhou , 1, 2 ,
  • YU Zhikai 1 ,
  • WU Fengyang 1 ,
  • XIA Miao 1 ,
  • WANG Junfeng 3 ,
  • LIU Yajuan , 2, 4, * ,
  • CHEN Baojiang , 1, *
Expand
  • 1 College of Animal Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China
  • 2 National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas, Baoding 071001, China
  • 3 Jiangsu Yinong Bioengineering Co., Ltd., Suqian 223600, China
  • 4 Mountainous Area Research Institute of Hebei Province, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China
*LIU Yajuan, associate professor, E-mail: ;
CHEN Baojiang, professor, E-mail:

Received date: 2022-10-21

  Online published: 2023-04-12

Fold

摘要

本试验旨在研究饲粮中添加酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔肠道形态、肠道通透性、盲肠发酵及微生物区系的影响。选取160只35日龄体重相近的健康獭兔,随机分为4组,每组8个重复,每个重复5只。对照组饲喂基础饲粮,试验组分别饲喂在基础饲粮中添加0.01%、0.02%和0.04%酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物的试验饲粮,预试期7 d,正试期56 d。结果显示:1)0.02%和0.04%添加组空肠隐窝深度显著低于对照组(P<0.05),0.02%添加组空肠绒隐比显著高于对照组(P<0.05),0.04%添加组回肠绒毛高度较对照组显著提高(P<0.05)。2)0.01%和0.02%添加组血清二胺氧化酶(DAO)活性较对照组显著降低(P<0.05),各组间血清D-乳酸(D-LA)含量无显著差异(P>0.05)。3)各组间空肠、回肠和盲肠pH无显著差异(P>0.05),各组间盲肠中乙酸、丙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸浓度及乙酸、丙酸和丁酸比例无显著差异(P>0.05)。4)0.02%和0.04%添加组Simpson指数较对照组呈提高趋势(0.05≤P<0.10)。在门水平上,疣微菌门相对丰度随酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物添加量的增加呈现先降低后升高的趋势(0.05≤P<0.10);0.02%添加组软壁菌门相对丰度显著高于0.01%和0.04%添加组(P<0.05),但各试验组与对照组间无显著差异(P>0.05)。在属水平上,瘤胃球菌科_UCG-014、艾克曼菌属、dgA-11_gut_group、副室杆菌属和罕见小球菌属相对丰度随酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物添加量的增加出现变化趋势(0.05≤P<0.10)。综上所述,饲粮中添加酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物可改善獭兔肠道形态,降低肠道通透性,对空肠、回肠和盲肠内pH以及盲肠发酵均无显著影响,但能够提高盲肠微生物多样性。结合前期生长性能结果,推荐添加量为0.02%~0.04%。

关键词： 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物; 獭兔; 肠道形态; 肠道通透性; 挥发性脂肪酸; 微生物多样性

本文引用格式

王国洲 , 于志凯 , 吴峰洋 , 夏苗 , 王俊峰 , 刘亚娟 , 陈宝江 . 饲粮中添加酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔肠道形态、肠道通透性、盲肠发酵及微生物区系的影响[J]. 动物营养学报, 2023 , 35(4) : 2557 -2570 . DOI: 10.12418/CJAN2023.239

Abstract

This experiment was conducted to investigate the effects of dietary supplemented with combined yeast and Bacillus coagulans fermentation culture on intestinal morphology, intestinal permeability, cecal fermentation and microflora of Rex rabbits. A total of 160 healthy Rex rabbits weaned at 35-day-old with similar body weight were randomly allocated to 4 groups with 8 replicates per group and 5 rabbits per replicate. Rex rabbits in the control group were fed a basal diet, while the others in experimental groups were fed experimental diets supplemented with 0.01%, 0.02% and 0.04% combined yeast and Bacillus coagulans fermentation culture based on the basal diet, respectively. The pretrial period lasted for 7 days and formal period lasted for 56 days. The results showed as follows: 1) the crypt depth of jejunum in the 0.02% and 0.04% added groups was significantly lower than that in the control group (P<0.05), the jejunum villus height/crypt depth ratio in the 0.02% added group was significantly higher than that in the control group (P<0.05), and the ileum villus height in the 0.04% added group was significantly higher than that in the control group (P<0.05). 2) The activity of diamine oxidase (DAO) in serum of 0.01% and 0.02% added groups was significantly lower than that in the control group (P<0.05), but there was no significant difference in the content of D-lactic acid (D-LA) in serum among all groups (P>0.05). 3) There were no significant differences in the pH of jejunum, ileum and cecum among all groups (P>0.05). There were no significant differences in the concentrations of acetic acid, propionic acid, butyric acid and total volatile fatty acid and the ratios of acetic acid, propionic acid and butyric acid in cecum among all groups (P>0.05). 4) Compared with the control group, the Simpson index of 0.02% and 0.04% added groups showed an increasing trend (0.05≤P<0.10). At the phylum level, the relative abundance of Verrucomicrobia showed a trend of decreasing first and then increasing with the combined yeast and Bacillus coagulans fermentation culture increasing (0.05≤P<0.10); the relative abundance of Tenericutes in the 0.02% added group was significantly higher than that in the 0.01% and 0.04% added groups (P<0.05), but there was no significant difference between the added groups and the control group (P>0.05). At the genus level, the relative abundance of Ruminococcaceae_UCG-014, Akkermansia, dgA-11_gut_group, Paramuribaculum and Subdoligranulum showed a trend of change with the combined yeast and Bacillus coagulans fermentation culture increasing (0.05≤P<0.10). In summary, dietary supplemented with combined yeast and Bacillus coagulans fermentation culture can improve the intestinal morphology and reduce intestinal permeability, but has no significant effects on the pH of jejunum, ileum and cecum and cecum fermentation, and can improve the microbial diversity of cecum of Rex rabbits. The recommended addition level is 0.02% to 0.04% based on the previous results of growth performance.

Key words： combined yeast-Bacillus coagulans fermentation culture; Rex rabbits; intestinal morphology; intestinal permeability; volatile fatty acids; microbial diversity

肠道是动物机体重要的消化器官和最大的免疫器官,在消化、吸收、代谢和免疫中发挥着重要作用。动物肠道受到应激、寄生虫、病毒和致病菌入侵等不利因素刺激后,肠绒毛受损、肠道通透性增加及肠道菌群失衡,最终导致动物消化吸收能力降低、免疫力下降、腹泻和生长缓慢[1]。因此,维持肠道健康及优化肠道功能对动物的生长发育、机体代谢和免疫等具有重要意义。益生菌制剂不仅具有绿色健康、安全无污染和不易产生耐药性等特点,且能够改善动物生长性能、增强免疫力、调节肠道菌群、缓解肠道损伤及优化肠道功能[2-3],已成为动物饲用添加剂的研究热点之一。酵母菌作为最早被应用的益生菌,其含有多种活性益生物质[4],而酵母培养物则是在特定工艺条件控制下由酵母菌在特定的培养基上经过充分的厌氧发酵后形成的微生态制品。据相关报道,酵母培养物中的细胞壁多糖、氨基酸、次级代谢产物、维生素和未知促生长因子等有助于改善动物肠道微生态环境,提高肠道有益菌相对丰度,并且在促进肠上皮细胞成熟和改善肠道形态结构方面也具有积极作用[5-6]。凝结芽孢杆菌为同型乳酸发酵菌,可分解糖类生成L-乳酸,其在肠道定植后,发酵可产生凝固素、乳酸、氨基酸、短链脂肪酸和维生素等[7],能够改善肠道形态结构、维持肠道内菌群平衡和提高机体免疫力[8-9]。目前,酵母菌和凝结芽孢杆菌在畜禽生产中应用的报道较多,且在畜禽生产中的应用多为单独使用,但獭兔生产中鲜有报道。酵母菌和凝结芽孢杆菌联合发酵时,由于凝结芽孢杆菌好氧发酵,可以加速酵母菌厌氧发酵过程,使底物发酵更彻底。因此,二者联合发酵在理论上具有相互协同效果叠加作用。本课题组前期的饲养试验结果表明,酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物能够改善獭兔的生长性能,提高营养物质表观消化率,增强免疫力,且推荐添加水平为0.02%~0.04%[10]。在此基础上,本试验从肠道形态、肠道通透性、肠道pH、盲肠发酵与微生物区系等方面研究酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔肠道健康的影响,为其在家兔生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物是酵母菌和凝结芽孢杆菌联合发酵而成,主要成分:酵母菌代谢产物(抑菌活性肽≥6.0%)、凝结芽孢杆菌(≥5.0×108 CFU/g)、凝结芽孢杆菌代谢产物(凝固素含量:0.8 mg/mL、L-乳酸含量:5.5~8.5 g/kg)、葡聚糖(≥0.2%)、甘露聚糖(≥1.0%)。

1.2 试验设计及基础饲粮

选取35日龄体重[(613.15±9.57) g]相近的健康獭兔160只,随机分为4组,每组8个重复,每个重复5只(单笼单只饲养)。对照组饲喂基础饲粮,试验组分别饲喂在基础饲粮中添加0.01%、0.02%和0.04%酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物的试验饲粮,预试期7 d,正试期56 d。基础饲粮参照谷子林等[11]和NRC(1977)[12]推荐的家兔饲养标准进行配制,其组成及营养水平见表1。其中消化能测定方法如下:每组选8只试验兔,采用全收粪法进行消化试验,通过测定兔采食量、饲粮总能、排粪量以及粪能,计算能量表观消化率,之后计算并得出消化能。酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物以粉剂的形式添加到基础饲粮中,逐级稀释,混合均匀,制成颗粒饲料。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

项目Items 含量Content
原料Ingredients
玉米Corn 8.00
小麦麸Wheat bran 33.00
米糠Rice bran 5.00
大豆粕Soybean meal 11.00
花生秧Peanut vine 15.00
花生壳Peanut shell 12.50
艾叶粉Artemisia argyi powder 8.00
次粉Wheat middlings 4.00
磷酸氢钙CaHPO4 0.50
石粉Limestone 1.05
食盐NaCl 0.50
L-赖氨酸硫酸盐L-lysine sulfate 0.30
DL-蛋氨酸DL-Met 0.15
预混料Premix1) 1.00
合计Total 100.00
营养水平Nutrient levels2)
消化能DE/(MJ/kg) 9.47
粗蛋白质CP 16.77
粗纤维CF 15.71
中洗洗涤纤维NDF 38.55
酸性洗涤纤维ADF 20.78
酸性洗涤木质素ADL 6.03
粗脂肪EE 2.75
钙Ca 1.43
总磷TP 0.73
项目Items 含量Content
赖氨酸Lys 0.81
蛋氨酸+半胱氨酸Met+Cys 0.60

1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of the diet:Cu (as copper sulfate) 20 mg,Fe (as ferric sulfate) 70 mg,Zn (as zinc sulfate) 70 mg,Se (as sodium sulfate) 0.25 mg,Mn (as manganese sulfate) 10 mg,Co 0.15 mg,I (as potassium iodide) 0.2 mg,VB1 2 mg,VB2 6 mg,VB5 50 mg,VB6 2 mg,VB12 0.02 mg,VB3 50 mg,胆碱 choline 1 000 mg,生物素 biotin 0.2 mg,VA 10 000 IU,VD 900 IU,VE 50 mg,VK 2 mg。

2)营养水平均为实测值。Nutrient levels were all measured values.

1.3 饲养管理

试验前兔舍和笼具彻底清理和消毒,采用3层阶梯式单笼单只饲养,对每只兔笼进行单独编号。自由采食和饮水,每天08:00和18:00各饲喂1次,试验期间进行正常免疫程序。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 肠道通透性测定

试验结束当日,每组挑选8只试验兔(每个重复挑选1只)进行屠宰。屠宰前,心脏采血5 mL,3 500 r/min离心10 min,取上清液,-20 ℃保存备测;采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测定血清中二胺氧化酶(DAO)活性和D-乳酸(D-LA)含量,试剂盒购自北京博锐长远科技有限公司,具体操作步骤按照说明书进行。

1.4.2 肠道形态测定

屠宰后,取2~3 cm空肠和回肠肠段浸入4%多聚甲醛溶液中固定。肠段经修剪、乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、苏木精-伊红染色和中性树胶封片,采用BA210 Digital数码三目摄像显微摄像系统对肠段切片进行图像采集,测量肠道绒毛高度和隐窝深度,并计算绒毛高度与隐窝深度的比值,即绒隐比(V/C)。

1.4.3 肠道pH测定

屠宰后,取空肠、回肠和盲肠,用Testo205型pH计插入肠道内测定pH,每个肠段测定3次取平均值。

1.4.4 盲肠挥发性脂肪酸浓度测定

取0.5 g盲肠内容物3倍稀释,4 ℃下5 400 r/min离心10 min,之后取1 mL上清液,加入0.2 mL含有内标物2-乙基丁酸(2EB)的25%偏磷酸溶液,混匀,冰浴30 min以上,再次离心(4 ℃下10 000 r/min离心10 min),去除样品中蛋白质沉淀物,取上清液使用Agilent 7890A气相色谱仪测定挥发性脂肪酸浓度。

1.4.5 盲肠微生物多样性测定

取盲肠内容物装入5 mL无菌冻存管中,-80 ℃保存备测。由杭州联川生物技术有限公司对样品进行细菌16S rRNA高通量测序分析。

1.5 数据统计分析

试验数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析,并采用Duncan氏法进行多重比较,结果采用“平均值±标准误”表示,采用Graphpad Software非参数检验进行微生物多样性数据显著性分析,以P<0.05表示差异显著,0.05≤P<0.10表示有变化趋势。

2 结果与分析

2.1 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔肠道形态的影响

由表2可知,各组间空肠绒毛高度无显著差异(P>0.05);0.01%、0.02%和0.04%添加组空肠隐窝深度分别较对照组降低13.06%(P>0.05)、47.60%(P<0.05)和35.63%(P<0.05);0.01%、0.02%和0.04%添加组空肠绒隐比分别较对照组提高17.40%(P>0.05)、44.93%(P<0.05)和28.68%(P>0.05)。与对照组相比,0.04%添加组回肠绒毛高度显著提高10.71%(P<0.05),0.01%和0.02%添加组略有提高,但差异不显著(P>0.05);各组间回肠隐窝深度无显著差异(P>0.05);回肠绒隐比以0.04%添加组最高,较对照组提高11.98%(P>0.05)。
表2 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔肠道形态的影响

Table 2 Effects of combined yeast and Bacillus coagulans fermentation culture on intestinal morphology of Rex rabbits (n=8)

项目
Items		 对照组
Control
group		 0.01%添加组
0.01% added
group		 0.02%添加组
0.02% added
group		 0.04%添加组
0.04% added
group		 P值
P-value
空肠Jejunum
绒毛高度Villus height/μm 729.97±33.99 736.78±35.83 730.76±49.68 692.15±20.26 0.812
隐窝深度Crypt depth/μm 142.97±13.23a 124.30±9.49ab 96.86±4.27b 105.41±8.94b 0.012
绒隐比V/C 5.23±0.41b 6.14±0.64ab 7.58±0.49a 6.73±0.39ab 0.029
回肠Ileum
绒毛高度Villus height/μm 609.74±11.94b 631.87±9.57ab 612.66±16.80b 675.04±17.53a 0.014
隐窝深度Crypt depth/μm 98.55±9.36 100.97±6.97 102.71±7.63 95.30±4.85 0.889
绒隐比V/C 6.43±0.52 6.52±0.49 6.22±0.55 7.20±0.38 0.524

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),无字母或有相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔肠道通透性的影响

由表3可知,与对照组相比,0.01%和0.02%添加组血清DAO活性分别降低27.29%和29.68%,差异显著(P<0.05),0.04%添加组降低8.40%,差异不显著(P>0.05);0.01%、0.02%和0.04%添加组血清D-LA含量分别较对照组降低9.71%、16.58%和1.67%,差异均不显著(P>0.05)。
表3 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔肠道通透性的影响

Table 3 Effects of combined yeast and Bacillus coagulans fermentation culture on intestinal permeability of Rex rabbits (n=8)

项目
Items		 对照组
Control
group		 0.01%添加组
0.01% added
group		 0.02%添加组
0.02% added
group		 0.04%添加组
0.04% added
group		 P值
P-value
二胺氧化酶DAO/(U/mL) 38.92±1.06a 28.30±3.71b 27.37±0.47b 35.65±2.95ab 0.026
D-乳酸D-LA/(nmol/L) 127.35±2.89 114.99±9.62 106.24±7.41 125.22±9.92 0.255

2.3 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔肠道pH的影响

由表4可知,各组之间空肠、回肠和盲肠pH均无显著差异(P>0.05)。
表4 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔肠道pH的影响

Table 4 Effects of combined yeast and Bacillus coagulans fermentation culture on pH in intestine of Rex rabbits (n=8)

项目
Items		 对照组
Control
group		 0.01%添加组
0.01% added
group		 0.02%添加组
0.02% added
group		 0.04%添加组
0.04% added
group		 P值
P-value
空肠Jejunum 6.62±0.07 6.58±0.09 6.77±0.03 6.73±0.03 0.281
回肠Ileum 6.72±0.08 6.78±0.03 6.95±0.11 6.70±0.12 0.277
盲肠Cecum 5.88±0.08 6.02±0.09 5.98±0.09 6.22±0.13 0.158

2.4 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔盲肠挥发性脂肪酸浓度和比例的影响

由表5可知,与对照组相比,0.01%、0.02%和0.04%添加组盲肠乙酸浓度分别提高6.95%、14.64%和13.65%(P>0.05),丙酸浓度分别提高6.83%、4.17%和13.85%(P>0.05);各组间的盲肠丁酸和总挥发性脂肪酸浓度及乙酸、丙酸和丁酸比例均无显著差异(P>0.05)。
表5 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔盲肠挥发性脂肪酸浓度和比例的影响

Table 5 Effects of combined yeast and Bacillus coagulans fermentation culture on volatile fatty acid concentrations and ratios in cecum of Rex rabbits (n=8)

项目
Items		 对照组
Control
group		 0.01%添加组
0.01% added
group		 0.02%添加组
0.02% added
group		 0.04%添加组
0.04% added
group		 P值
P-value
浓度Concentration/(mmol/L)
乙酸Acetate 31.36±2.02 33.54±2.41 35.95±2.12 35.64±1.33 0.369
丙酸Propionate 5.27±0.32 5.63±0.13 5.49±0.19 6.00±0.13 0.131
丁酸Butyrate 11.08±0.40 10.83±0.57 11.50±0.46 11.63±0.50 0.642
总挥发性脂肪酸TVFA 49.72±1.74 50.07±2.69 52.94±2.31 53.70±1.10 0.435
比例Ratio/%
乙酸Acetate 63.02±2.95 66.72±1.54 67.75±1.20 66.33±1.64 0.378
丙酸Propionate 10.60±0.55 11.39±0.73 10.41±0.39 11.18±0.26 0.511
丁酸Butyrate 22.38±0.97 21.73±0.94 21.84±1.13 21.68±0.95 0.956

2.5 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔盲肠微生物区系的影响

2.5.1 微生物试验可行性

采用Illumina NovaSep测序平台对试验兔盲肠内容物样本中16S rDNA的V3~V4区进行检测,20个样本测序共获得1 527 813条Valid Tags,平均每个样品产生76 390条Valid Tags。稀释曲线(rarefaction curve)可直接反映测序数据量的合理性,并间接反映样品中物种的丰富度。由图1可知,各组稀释曲线均达到平缓趋势,表明测序数据量渐进合理且样本的多样性已接近饱和,所测序列足以覆盖微生物群落物种组成,能够真实反映群落各物种间的比例关系。
图1 样品稀疏曲线

Fig.1 Rarefaction curves of samples

2.5.2 特征值分布Venn图

根据特征值操作分类单元(OTU)丰度表,计算各组共有的OTU的数目,并通过Venn图解释各组共有和特有的OTU数目,若OTU只存在于1个分组,则该OTU为该分组特有。Venn图中每个圈代表1个分组,圈和圈重叠部分OTU数目代表不同组的共有OTU数目。由图2可知,对照组以及0.01%、0.02%和0.04%添加组特有的OTU数目分别为3 808、2 505、2 025和2 589个。
图2 特征值分布Venn图

Fig.2 Eigenvalue distribution Venn diagram

2.5.3 alpha多样性分析

由表6可知,各组覆盖度均大于或等于0.99,说明测序结果能真实反映各组獭兔盲肠细菌群落种类和结构多样性;0.02%和0.04%添加组Simpson指数较对照组呈提高趋势(0.05≤P<0.10);各组间OTU数量指数、Shannon指数、Chao1指数均无显著差异(P>0.05)。
表6 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔盲肠微生物alpha多样性指数的影响

Table 6 Effects of combined yeast and Bacillus coagulans fermentation culture on alpha diversity indexes in cecal microbiota of Rex rabbits (n=5)

项目
Items		 对照组
Control
group		 0.01%添加组
0.01% added
group		 0.02%添加组
0.02% added
group		 0.04%添加组
0.04% added
group		 P值
P-value
覆盖度Goods_coverage 0.99±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 0.430
操作分类单元数量指数
OTU number index		 1 455.80±138.77 1 192.20±118.84 1 247.60±90.68 1 162.20±181.94 0.537
Shannon指数Shannon index 8.23±0.22 7.87±0.12 8.28±0.08 8.11±0.16 0.291
Simpson指数Simpson index 0.98±0.00 0.98±0.00 0.99±0.00 0.99±0.00 0.068
Chao1指数Chao1 index 1 531.15±155.67 1 238.20±130.83 1 297.84±99.88 1 212.13±198.37 0.603

2.5.4 beta多样性分析

主坐标分析(PCoA)与非度量多维尺度(NMDS)分析都是基于样品距离矩阵的排序方法。通过PCoA可以观察各组之间的差异,结果中不同颜色代表不同分组,距离越近,说明样品之间的微生物组成结构越相似,差异性越小;NMDS分析的目标是保持样品排序关系不变,如果2个样品距离较近,说明这2个样品物种组成越相似。由图3可知,对照组、0.01%添加组、0.02%添加组和0.04%添加组组内样本聚集度较高,且组与组之间没有出现明显的分离。
图3 盲肠微生物区系构成的主坐标分析图及UniFrac非度量多维尺度分析图

Fig.3 PCoA plot (A) and UniFrac NMDS analysis diagram (B) of caecal microflora composition

2.5.5 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔盲肠微生物物种丰度的影响

2.5.5.1 门水平分析

门水平上以相对丰度前10的菌门作为各组的优势菌门,对其进行显著性分析,结果见表7。0.01%和0.04%添加组拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度分别较对照组提高6.65和4.24个百分点,但差异不显著(P<0.05);疣微菌门(Verrucomicrobia)相对丰度随着酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物添加量的增加呈现先降低后升高的趋势(0.05≤P<0.10);0.02%添加组软壁菌门(Tenericutes)的相对丰度较0.01%和0.04%添加组显著提高(P<0.05),与对照组无显著差异(P>0.05);各组之间的厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、未分类菌门(Unclassified)、髋骨菌门(Patescibacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和互养菌门(Synergistetes)相对丰度均无显著差异(P>0.05)。
表7 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔盲肠微生物门水平相对丰度的影响

Table 7 Effects of combined yeast and Bacillus coagulans fermentation culture on cecal microflora relative abundance at phylum level of Rex rabbits (n=5) %

项目
Items		 对照组
Control
group		 0.01%添加组
0.01% added
group		 0.02%添加组
0.02% added
group		 0.04%添加组
0.04% added
group		 P值
P-value
厚壁菌门Firmicutes 79.17±1.37 76.09±3.81 80.90±1.56 76.92±3.00 0.760
拟杆菌门Bacteroidetes 9.82±1.85 16.47±4.14 9.85±1.62 14.06±3.16 0.537
放线菌门Actinobacteria 4.29±0.52 3.05±0.66 3.77±0.65 2.21±0.27 0.115
疣微菌门Verrucomicrobia 3.21±1.63 0.91±0.20 1.19±0.39 3.76±0.84 0.087
变形菌门Proteobacteria 1.40±0.18 1.67±0.44 2.01±0.25 1.62±0.14 0.174
未分类菌门Unclassified 0.85±0.18 0.87±0.27 0.51±0.15 0.70±0.11 0.428
软壁菌门Tenericutes 0.55±0.15ab 0.40±0.12b 1.27±0.34a 0.37±0.17b 0.046
髌骨菌门Patescibacteria 0.51±0.13 0.36±0.06 0.37±0.07 0.20±0.10 0.129
蓝细菌门Cyanobacteria 0.09±0.04 0.08±0.03 0.07±0.02 0.04±0.01 0.523
互养菌门Synergistetes 0.06±0.04 0.05±0.03 0.00±0.00 0.07±0.03 0.743

2.5.5.2 属水平分析

在属水平上选取相对丰度>1%的25个菌属进行显著性分析。由表8可知,瘤胃球菌科_UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)、艾克曼菌属(Akkermansia)、dgA-11_gut_group、副室杆菌属(Paramuribaculum)和罕见小球菌属(Subdoligranulum)的相对丰度随着酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物添加量的增加呈现出变化趋势(0.05≤P<0.10),其他20种菌属的相对丰度均无显著变化(P>0.05)。
表8 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔盲肠微生物属水平相对丰度的影响

Table 8 Effects of combined yeast and Bacillus coagulans fermentation culture on cecal microflora relative abundance at genus level of Rex rabbits (n=5) %

项目
Items		 对照组
Control
group		 0.01%添加组
0.01% added
group		 0.02%添加组
0.02% added
group		 0.04%添加组
0.04% added
group		 P值
P-value
瘤胃球菌科_NK4A214_群
Ruminococcaceae_NK4A214_group		 12.25±1.54 12.96±1.29 12.81±0.64 13.02±2.86 0.862
厚壁菌门未分类菌属
Firmicutes_unclassified		 10.13±2.42 10.07±2.59 8.93±1.38 10.12±1.68 0.988
梭菌目_vadinBB60_群未分类菌属
Clostridiales_vadinBB60_group_unclassified		 7.04±1.40 5.27±1.60 8.42±1.23 7.76±1.44 0.537
克里斯滕森菌科_R-7_群
Christensenellaceae_R-7_group		 8.12±1.29 7.38±0.82 6.10±1.32 5.55±1.04 0.374
瘤胃球菌科_V9D2013_群
Ruminococcaceae_V9D2013_group		 4.23±2.16 6.28±1.47 4.96±0.84 6.41±1.94 0.472
Muribaculaceae未分类菌属
Muribaculaceae_unclassified		 2.17±0.35 6.79±3.09 2.17±1.43 4.64±2.51 0.716
瘤胃梭菌属_6
Ruminiclostridium_6		 4.40±1.59 3.19±0.65 4.14±0.81 4.00±1.15 0.854
瘤胃球菌科_UCG-013
Ruminococcaceae_UCG-013		 3.72±0.45 3.34±0.36 3.07±0.30 2.95±0.43 0.578
瘤胃球菌属_1
Ruminococcus_1		 3.19±0.41 2.52±0.47 2.89±0.30 2.49±0.47 0.774
毛螺菌科未分类属
Lachnospiraceae_unclassified		 2.83±0.40 2.38±0.39 2.57±0.24 2.96±0.70 0.804
红蝽菌科_UCG-002
Coriobacteriaceae_UCG-002		 3.11±0.43 2.03±0.51 2.54±0.56 1.49±0.18 0.153
瘤胃球菌科_UCG-014
Ruminococcaceae_UCG-014		 2.08±0.23 2.01±0.28 3.60±0.97 1.43±0.16 0.091
项目
Items		 对照组
Control
group		 0.01%添加组
0.01% added
group		 0.02%添加组
0.02% added
group		 0.04%添加组
0.04% added
group		 P值
P-value
艾克曼菌属
Akkermansia		 3.21±1.63 0.91±0.20 1.19±0.39 3.76±0.84 0.087
瘤胃球菌科未分类菌属
Ruminococcaceae_unclassified		 2.52±0.45 2.06±0.29 1.71±0.15 2.54±0.72 0.407
毛螺菌科_NK4B4_群
Lachnospiraceae_NK4B4_group		 1.84±0.54 1.36±0.70 2.54±0.81 0.92±0.21 0.355
梭菌属
Clostridium		 1.61±0.30 1.27±0.23 1.91±0.33 1.60±0.19 0.721
瘤胃球菌科_UCG-010
Ruminococcaceae_UCG-010		 1.43±0.26 1.28±0.19 2.03±0.16 1.62±0.19 0.109
dgA-11_gut_group 2.20±1.13 0.24±0.08 0.95±0.76 2.83±1.28 0.082
巴恩斯氏菌科未分类菌属
Barnesiellaceae_unclassified		 1.42±0.34 1.22±0.42 1.52±0.65 1.67±0.61 0.914
另支菌属Alistipes 1.70±0.75 1.39±0.42 1.51±0.30 0.79±0.21 0.413
拟杆菌属Bacteroides 0.76±0.15 1.43±0.50 1.42±0.36 1.18±0.32 0.641
副室杆菌属Paramuribaculum 0.17±0.15 2.26±1.83 0.13±0.06 1.93±0.97 0.050
瘤胃球菌科_UCG-005
Ruminococcaceae_UCG-005		 0.83±0.31 0.88±0.30 1.07±0.33 1.06±0.21 0.843
毛螺菌科_NK4A136_群
Lachnospiraceae_NK4A136_group		 0.67±0.16 1.00±0.31 0.48±0.09 1.49±0.67 0.506
罕见小球菌属Subdoligranulum 1.04±0.31 0.61±0.25 1.16±0.40 0.26±0.05 0.091

3 讨论

3.1 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔肠道形态的影响

肠道是动物营养物质消化吸收的主要场所,良好的肠道形态是保障消化吸收的重要前提。本试验发现,饲粮中添加酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物可降低獭兔空肠隐窝深度,提高回肠绒毛高度及空肠和回肠的绒隐比。通常,肠绒毛越高,肠道的消化吸收能力越强,而隐窝深度越浅,肠上皮组织分泌消化液的能力就越强,绒隐比则与肠道的消化吸收功能成正比关系[13]。本课题组在前期饲养试验中发现,饲粮中添加酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物能够显著提高獭兔的平均日增重,且提高试验末重;同时,营养物质表观消化率提高,料重比降低[10]。獭兔肠道形态结构的改善,将有利于营养物质在肠道内的消化吸收,这不仅促进了机体生长发育,也提高了饲料报酬。吴宇梁[14]研究发现,仔猪饲粮中添加β-葡聚糖能激活Dectin-1信号通路和抑制核因子-κB(NF-κB)信号通路,降低促炎因子表达及肠道炎症反应,从而缓解脂多糖(LPS)诱导的肠道组织病理学损伤,改善肠道形态。陈勇江等[15]研究表明,甘露聚糖能够有效修复阿司匹林诱导的大鼠肠道损伤,改善肠道形态结构。陈德林[16]研究发现,饲粮中添加凝结芽孢杆菌后肉兔十二指肠绒毛高度和绒隐比提高,隐窝深度降低,分析原因认为:凝结芽孢杆菌在进入消化道后,通过吸附和定植能够刺激并促进肠黏膜发育,肠上皮细胞的不断分化和成熟导致隐窝深度变浅,从而提高了绒隐比,同时凝结芽孢杆菌还可以通过竞争性抑制、分泌抑菌物质和乳酸等代谢产物,抑制有害菌在胃肠道内的定植和生长,减少肠道黏膜细胞的死亡并保护肠黏膜的完整,对肠道黏膜功能的发育和完善有间接地促进作用。并且,还有研究发现,凝结芽孢杆菌代谢产物——L-乳酸和凝固素均具体抑菌作用,能够在肠道中抑制有害菌的繁殖,从而减轻有害菌对肠道造成的损伤[17-18]。因此,本试验结果产生原因可能是酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物中的葡聚糖、甘露聚糖和凝结芽孢杆菌及其代谢产物共同促进了肠绒毛和肠上皮细胞的发育及杯状细胞的增加,并且也能够抑制肠道有害菌定植和缓解肠道炎症,减轻肠道损伤[19⇓⇓-22];同时添加物中的多种有益物质也可改善肠道微生态环境,为肠道黏膜细胞增殖与更新创建良好环境[5,23]。

3.2 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔肠道通透性的影响

血清中DAO活性和D-LA含量是反映肠道通透性的重要指标,能够反映肠道机械屏障的完整性和黏膜受损伤程度[24]。本研究发现,饲粮中添加酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物后獭兔血清中DAO活性和D-LA含量降低,表明肠道通透性降低。Han等[25]研究发现,酵母β-葡聚糖通过抑制炎症介质的表达和增强紧密连接蛋白的表达,改善肠道屏障,降低肠道通透性。Wu等[26]研究发现,饲粮中添加凝结芽孢杆菌后仔猪空肠绒毛蛋白和闭锁蛋白的表达明显增加,同时肠道形态明显得到改善,血浆中DAO活性显著降低,表明凝结芽孢杆菌在降低肠道通透性及改善肠道机械屏障完整性方面具有积极作用。分析本试验认为,一方面可能是因为酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物具备了酵母培养物、酵母代谢产物及凝结芽孢杆菌的共同功能,可抑制炎性细胞因子分泌(如肿瘤坏死因子-α),缓解肠道炎症,加强肠道细胞间的紧密连接性,从而降低了肠道通透性[27-28];另一方面可能是因为酵母菌代谢产物——抑菌活性肽、甘露聚糖和凝固素可以抑制病原菌在肠壁上的黏附和繁殖,减轻肠道损伤,甘露聚糖又可促进肠上皮细胞和杯状细胞增殖,提高肠黏膜间的紧密连接性,同时抑菌活性肽和甘露聚糖能够加速受损肠道黏膜修复[15,29-30]。

3.3 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔肠道pH及盲肠挥发性脂肪酸浓度和比例的影响

肠道内适宜的pH是肠道生理功能正常发挥的重要条件之一,正常状态下,家兔小肠内的pH接近7.0,盲肠内的pH为5.4~6.8[31]。家兔的盲肠特别发达,被称为“发酵罐”,在对饲粮营养物质的消化利用中起着重要作用。相关报道称,当家兔盲肠内pH较低时,后肠中的渗透压会增加,从而增加家兔腹泻的风险[32];而且盲肠内pH高于或低于正常范围,淀粉分解菌和纤维分解菌的活性都将受到抑制[33-34]。本次试验中,试验组獭兔的空肠、回肠及盲肠内pH与对照组均无显著差异,且各组均在正常范围内,表明添加酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物未对獭兔肠道内pH产生较大影响。
家兔盲肠内容物中的挥发性脂肪酸主要包括乙酸、丙酸和丁酸。本研究发现,各试验组盲肠内乙酸和丙酸浓度较对照组均有一定提高,而盲肠内pH则无显著变化。这与周雪飞[35]的研究结果类似,其表示,添加酵母培养物能够显著提高绵羊瘤胃中乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸的浓度,但瘤胃pH仍保持稳定状态,这可能是因为在提高挥发性脂肪酸浓度的情况下,乳酸生成机制发生了变化,从而稳定了pH。分析本试验结果认为,酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物中含有的酵母细胞壁多糖(葡聚糖和甘露聚糖)能够被肠道微生物发酵产生挥发性脂肪酸,同时甘露聚糖和凝结芽孢杆菌又可提高盲肠中微生物的活性[36-37],因此,试验组獭兔盲肠内容物中乙酸和丙酸浓度在一定程度上得到提高。正常情况下,盲肠中乙酸、丙酸和丁酸比例关系为60%~70%∶10%~15%∶15%~20%,这种比例会因饲粮成分的变化而变化[38]。本试验中,各组盲肠中乙酸、丙酸和丁酸比例均在正常范围内,且各组间无显著差异,这是因为各组獭兔饲喂相同的基础饲粮(饲粮组成及营养水平一致),发酵底物相同。

3.4 酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔盲肠微生物区系的影响

通常肠道微生物区系相对稳定,这种稳态可有效地维持动物机体的正常生理活动,同时也是动物健康高效生长的重要保障之一。本试验中,0.02%和0.04%添加组Simpson指数有提高趋势,表明添加一定量的酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物对獭兔盲肠微生物多样性的提高具有积极作用。有研究表明,饲粮中添加酵母培养物可有效调节肠道菌群紊乱[39],提高肠道微生物多样性和有益菌丰度[40]。Zhang等[41]和Liu等[42]的研究均表明,凝结芽孢杆菌对肉鸡肠道微生物多样性无显著影响,但能够显著增加有益菌丰度和减少潜在致病菌的丰度,这可能是因为凝结芽孢杆菌及其代谢产物(L-乳酸和凝固素)具有抑菌作用,因此减少了肠道内有害菌的增殖。分析本试验结果,可能是因为酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物的添加在减少了肠道有害菌的同时,也改善了盲肠内微生态环境,从而使得微生物多样性提高。在门水平上,0.01%和0.04%添加组拟杆菌门的相对丰度较对照组有一定提高,0.02%添加组软壁菌门的相对丰度最高。拟杆菌门的主要功能是吸收和降解多糖,同时还能够促进碳水化合物发酵,产生甲酸、乙酸和丙酸[43],而本试验中拟杆菌门相对丰度的提高与乙酸和丙酸比例的提高一致,这可能是酵母细胞壁多糖(葡聚糖和甘露聚糖)被拟杆菌门利用后的结果;据报道,软壁菌门在动物生长和抑制致病菌方面具有积极作用[44-45],0.02%添加组软壁菌门相对丰度的提高将有益于獭兔的生长。在属水平上,各菌属相对丰度未出现显著性变化,但通过观察发现,艾克曼菌属相对丰度呈现的变化趋势与肠道通透性的变化趋势相一致。艾克曼菌属是一种极具潜力的候选益生菌,广泛存在于肠道黏膜中,在黏膜层定植并降解黏液,也以黏液为主要能量来源[46]。然而,艾克曼菌属也被证明能够导致黏液层变薄和肠道通透性增加,破坏肠黏膜屏障[47]。因此分析认为,本试验中肠道通透性与艾克曼菌属相对丰度的变化存在着一定联系。dgA-11_gut_group与脂质代谢紊乱相关[48],而0.01%和0.02%添加组dgA-11_gut_group相对丰度较低,说明添加适量酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物可降低獭兔脂质代谢紊乱的风险。

4 结论

饲粮中添加酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物可改善獭兔肠道形态,降低肠道通透性,对空肠、回肠和盲肠内pH以及盲肠发酵均无显著影响,但能够提高盲肠微生物多样性。结合前期生长性能结果,獭兔饲粮中酵母菌-凝结芽孢杆菌联合发酵培养物推荐添加量为0.02%~0.04%。

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