动物营养学报 >

2023 , Vol. 35 >Issue 4: 2711 - 2720

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.253

研究论文

逐层包埋对丁酸梭菌孢子胃肠耐受及黏附能力的改善作用

  • 李科 , 1 ,
  • 汪乐盛 2 ,
  • 李恒 1 ,
  • 蒋敏 1 ,
  • 史劲松 1 ,
  • 许正宏 3 ,
  • 许泓瑜 , 2, *
展开
  • 1 江南大学生命科学与健康工程学院,无锡 214028
  • 2 江南大学粮食与食品生物制造国家工程研究中心,无锡 214122
  • 3 江南大学生物工程学院,无锡 214022
*许泓瑜,副教授,硕士生导师,E-mail:

李 科(1998—),男,山东滨州人,硕士研究生,从事生物制药研究。E-mail:

Copy editor: 菅景颖

收稿日期: 2022-09-20

  网络出版日期: 2023-04-12

基金资助

国家科技基础资源调查专项资助(2021FY100900)

收起

Improvement Effect of Gastrointestinal Tolerance and Adhesive Ability of Clostridium butyricum Spores by Layer-by-Layer Embedding

  • LI Ke , 1 ,
  • WANG Lesheng 2 ,
  • LI Heng 1 ,
  • JIANG Min 1 ,
  • SHI Jingsong 1 ,
  • XU Zhenghong 3 ,
  • XU Hongyu , 2, *
Expand
  • 1 College of Life Science and Health Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214028, China
  • 2 National Engineering Research Center for Food and Food Biomanufacturing, Jiangnan University, Wuxi 214122, China
  • 3 College of Bioengineering, Jiangnan University, Wuxi 214022, China
*associate professor, E-mail:

Received date: 2022-09-20

  Online published: 2023-04-12

Fold

摘要

为改善丁酸梭菌对肠上皮细胞的黏附效果,使其更好地在肠道内发挥益生作用,本研究采用海藻酸钠与壳聚糖2种带电性相反的多糖,利用静电相互作用对丁酸梭菌孢子进行逐层包埋。通过体外培养,检测包埋后的丁酸梭菌孢子在模拟胃肠液处理后,其耐受能力、黏附能力以及生长与萌发能力的变化。结果表明:相比于未包埋丁酸梭菌孢子,包埋4层多糖的丁酸梭菌孢子对模拟胃肠液的耐受能力得到提高,模拟胃液处理3 h后的存活率提高1.22倍,模拟胃液处理2 h联合模拟肠液处理6 h后的存活率提高1.86倍。模拟胃液处理2 h后再经模拟肠液分别处理2、4、6 h的包埋丁酸梭菌孢子的黏附率较未包埋丁酸梭菌孢子分别提高3.59、3.33和1.71倍。分析发现包埋丁酸梭菌孢子黏附能力的变化与其表面电位呈现相关性,且包埋处理并未影响孢子的萌发和增殖能力。上述试验结果提示,通过逐层包埋技术可增加丁酸梭菌孢子的存活率及其对肠上皮细胞的黏附能力,为其在肠道萌发和定植创造了条件。

关键词： 丁酸梭菌; 孢子; 逐层包埋; 存活率; 细胞黏附

本文引用格式

李科 , 汪乐盛 , 李恒 , 蒋敏 , 史劲松 , 许正宏 , 许泓瑜 . 逐层包埋对丁酸梭菌孢子胃肠耐受及黏附能力的改善作用[J]. 动物营养学报, 2023 , 35(4) : 2711 -2720 . DOI: 10.12418/CJAN2023.253

Abstract

In order to improve the adhesion effect of Clostridium butyricum on intestinal epithelial cells and enable it to better play a probiotic role in the intestine, sodium alginate and chitosan, two kinds of polysaccharides with opposite electrification, were used to embed Clostridium butyricum spores layer by layer through electrostatic interaction. The changes of tolerance, adhesion ability, growth and germination of the embedded Clostridium butyricum spores treated with simulated gastrointestinal fluid were measured by in vitro culture. The results showed that, compared with the unembedded Clostridium butyricum spores, the 4-layer embedded Clostridium butyricum spores showed improved tolerance to simulated gastroenteric fluid, and the survival rate to simulated gastroenteric fluid treatment for 3 h was increased by 1.22 times, and the survival rate to simulated gastroenteric fluid treatment for 2 h combined with simulated intestinal fluid treatment for 6 h was increased by 1.86 times. The adhesion rate of the embedded Clostridium butyricum spores which were treated with simulated gastric fluid for 2 h and then treated with simulated intestinal fluid for 2, 4 and 6 h was 3.59, 3.33 and 1.71 times higher than that of the unembedded Clostridium butyricum spores, respectively. It is found that the change of adhesion ability of embedded Clostridium butyricum spores is related to their surface potential, and the embedding treatment do not affect the germination and proliferation ability of spores. These results suggest that the survival rate and adhesion ability of Clostridium butyricum spores to intestinal epithelial cells can be increased by layer-by-layer embedding technique, which benefits their germination and colonization in intestinal tract.

Key words： Clostridium butyricum; spores; layer by layer embedding; survival rate; cells adhesion

丁酸梭菌(Clostridium butyricum)是一种产丁酸并具有内生孢子的严格厌氧细菌[1-2],具有调节肠道微生态平衡、提高动物免疫力等多种生理功能[3-4],已发展成为一种适合畜禽饲粮添加的益生菌[5⇓-7]。然而,实现其益生功能的重要前提是能够耐受胃肠道环境压力,如胃液低pH、消化酶降解作用、胆盐的抗菌活性,同时还应具备良好的肠道上皮细胞黏附和肠道定植能力[8⇓-10]。已有研究表明,相较于其他益生菌剂,丁酸梭菌的孢子具有更好的抗逆性,但其萌发能力及活性仍会在长时间的胃肠道转运过程中受到抑制[11]。另外,孢子型益生菌的功能发挥需要其能够在体内萌发生长,这意味着它们需要更长的肠道滞留时间[12-13],来确保其萌发与定植。
益生菌包埋技术可有效保护其生物学活性,增加肠道上皮的黏附能力,促进在肠道内的定植[14-15]。目前,保护益生菌最常见的包埋方法侧重于使用微胶囊技术[16],但存在微胶囊尺寸过大、无法控制益生菌在肠道的释放以及影响益生菌在肠道内的黏附和生长等问题[17-18],从而限制其实际应用。而细胞包埋法可更加显著地促进益生菌在肠道内的黏附与滞留[19-20],已被广泛应用于益生菌肠道递送,但主要用于乳酸菌之类的益生菌剂,在孢子型益生菌方面的应用研究鲜有报道。
海藻酸盐(sodium alginate,SA)与壳聚糖(chitosan,CTS)因其生物相容性、生物降解性和无毒性被广泛应用于菌体包埋[21⇓-23]。Smart[24]发现,海藻酸钠或壳聚糖包埋均可提高益生菌的肠道黏附性能。本研究利用壳聚糖与海藻酸钠材料荷电性质的差异,通过静电相互作用对丁酸梭菌孢子进行了2种材料交替的逐层包埋,探究最佳包埋pH和最优包埋层数等工艺条件,并基于表面电位测定、体外细胞培养等技术研究包埋工艺对丁酸梭菌孢子在模拟胃肠液中的耐受性、释放情况和对肠道上皮细胞的黏附能力及其自身生长萌发性能的影响,为进一步开发包埋型益生菌饲料添加剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验用丁酸梭菌为江南大学系统发酵与制药工程实验室保藏菌种,人克隆结肠腺癌细胞(Caco-2)购于ATCC细胞库。
DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素双抗溶液、胰酶均购于美国Gibco生物科技公司,RCM梭菌增殖培养基、产孢培养基、胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础培养基均购于青岛海博生物技术有限公司,海藻酸钠购于北京伊诺凯科技有限公司,壳聚糖(脱乙酰度95%)购于北京百灵威科技有限公司,细胞爬片购于上海晶安生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

厌氧培养箱(DWS,英国)、细胞培养箱(赛默飞,美国)、磁力搅拌器(其林贝尔,海门)、恒温摇床(强乐,太仓)、光学显微镜(索尼,日本)、冷场发射扫描电子显微镜(FE-SEM,日立,日本)、Zeta电位/纳米粒度分析仪(马尔文,英国)、离心机(艾本德,德国)、酶标仪(TECAN,瑞士)、高压灭菌锅(ZEALWAY,美国)。

1.3 试验方法

1.3.1 丁酸梭菌孢子获得与计数

丁酸梭菌接种于RCM梭菌增殖培养基,于37 ℃厌氧培养箱培养24 h,3%的接种量接种,连续活化传代2~3次后,接种于产孢培养基培养72 h获得丁酸梭菌孢子。收集菌液,5 000 r/min离心10 min,洗涤2次,将丁酸梭菌孢子重悬于无菌生理盐水中,并按照亓秀晔等[25]的方法进行孢子计数,使最终活菌数为109 CFU/mL。

1.3.2 细胞培养

Caco-2细胞在含10% FBS的DMEM高糖培养基中,37 ℃、5% CO2条件下培养,待细胞融合至80%左右[26],以50万个/mL的浓度接种于装有细胞爬片的6孔板中,每隔2 d更换1次培养液,培养12 d,直到完全分化。

1.3.3 海藻酸钠与壳聚糖最佳交联pH筛选

将海藻酸钠与壳聚糖分别溶解于去离子水和2%(v/v)乙酸溶液,使其终浓度均为2 mg/mL。将2种溶液按照1∶1混合,用0.1 mol/L NaOH及HCl制成不同pH梯度溶液,测量pH并用紫外可见分光光度计(λ=400 nm)测定溶液的浊度[27],做拟合曲线,确定海藻酸钠与壳聚糖溶液最佳交联pH范围。

1.3.4 丁酸梭菌孢子包埋层数筛选

用NaOH或HCl将壳聚糖和海藻酸钠溶液(2 mg/mL)的pH调节为6.0。丁酸梭菌孢子用无菌水洗涤2次,按照108 CFU/mL的浓度重悬于壳聚糖溶液,在室温下恒定旋转60 min,然后5 000 r/min离心收集沉淀,洗涤1次,再次重悬于海藻酸钠溶液中,重复这一过程,以合成最多4层的逐层包封的丁酸梭菌孢子,分别用CTS、CTS-SA、CTS-SA-CTS、(CTS-SA)2表示。Zeta电位/纳米粒度分析仪用于测量样品在纯水中的表面电位,FE-SEM用于观察冻干样品形态以及未包埋与上述包埋不同层的丁酸梭菌孢子在Caco-2细胞模型上的黏附情况[14]。
黏附率(%)=(黏附后活菌数/原始菌液活菌数)×100。

1.3.5 包埋后丁酸梭菌孢子的模拟胃肠液耐受性测定

将胃蛋白酶溶解于0.2%氯化钠(m/v)中,最终浓度为0.3 g/L,用浓HCl调节pH至2.0,制备模拟胃液(simulated gastric fluid,SGF)[28]。将胰酶、胰蛋白酶和胆汁盐溶于磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L磷酸二氢钠),最终浓度分别为10.0、10.0和3.0 g/L,然后用1.0 mol/L NaOH调节pH至7.0,制备模拟肠液(simulated intestinal fluid,SIF)[29]。
每个样品分别加入10 mL SGF或SIF,置于37 ℃、转速为150 r/min的恒温培养箱中孵育。以未包埋丁酸梭菌孢子作为对照,分别于0 h(初始)、SGF处理2 h、SGF处理2 h后SIF继续处理6 h时取样,计算其存活率。
存活率(%)=(处理后活菌数/初始活菌数)×100。

1.3.6 包埋不同层数丁酸梭菌孢子在不同pH条件下释放评价

选择包埋3层与4层的丁酸梭菌孢子加入不含消化酶的SGF母液(pH=2)与SIF母液(pH=7)中,在温度为37 ℃、转速为150 r/min的恒温培养箱中处理2 h,分别在处理0(初始)、0.5、1.0、2.0 h时取样测定其表面电位变化。

1.3.7 包埋后丁酸梭菌孢子在模拟胃肠液中的释放评价

选择包埋4层的丁酸梭菌孢子样品加入10 mL SGF,然后在温度为37 ℃、转速为150 r/min的恒温培养箱中处理2 h,5 000 r/min离心10 min,洗涤2次,加入10 mL SIF,再分别在2、4、6 h时取样,测定其黏附率,并每隔2 h取样测定其表面电位及用FE-SEM观察多糖在丁酸梭菌孢子表面的脱落情况。

1.3.8 丁酸梭菌孢子黏附性测定

在分化后的Caco-2细胞中加入以DMEM高糖培养基重悬的丁酸梭菌孢子液500 μL(1×107 CFU/mL),于细胞培养箱中孵育2 h。去除上清,磷酸盐缓冲液洗涤2次,分别于4%多聚甲醛中固定,在显微镜下观察其黏附情况。同时用胰蛋白酶消化收集丁酸梭菌孢子与细胞的悬液[30],对其进行活菌计数,并计算其黏附率,方法同1.3.4。其中,模拟胃肠液处理不同时间对逐层包埋4层多糖的丁酸梭菌孢子黏附特性的影响的试验分组情况如下:以Caco-2细胞作为空白组;未包埋丁酸梭菌孢子和Caco-2细胞共同孵育2 h作为对照组;逐层包埋4层多糖的丁酸梭菌孢子未经胃肠液处理直接与Caco-2细胞共孵育2 h作为Gut-0组;逐层包埋4层多糖的丁酸梭菌孢子均经过SGF处理2 h后,分别经SIF连续处理2、4、6 h,然后与Caco-2细胞共同孵育2 h,分别作为Gut-4、Gut-6、Gut-8组。

1.3.9 包埋前后丁酸梭菌孢子生长萌发性能测定

以未包埋且未经胃肠液处理的丁酸梭菌孢子作为空白对照,研究SGF 2 h与SIF 6 h连续处理对包埋0、1、2、3、4层多糖的丁酸梭菌孢子生长的影响,以添加2种多糖并在同样处理条件下的未包埋丁酸梭菌孢子作为对照。将模拟胃肠液处理后的不同包埋层数丁酸梭菌孢子接种至RCM梭菌增殖培养基中,于37 ℃厌氧培养箱培养18 h,每隔2 h以酶标仪测定其吸光度(OD)值,并绘制生长曲线。

1.4 数据处理与分析

应用GraphPad Prism 8软件进行分析。计量资料以平均值±标准差表示,组间两两比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同pH对海藻酸钠与壳聚糖交联的影响

当海藻酸钠与壳聚糖水溶液混合后会自发形成聚电解质络合物,形成浑浊的络合物溶液,浊度越大,说明两者交联效果越好。为了探究这2种多糖材料交联的最佳pH条件,对不同pH条件下两者交联的浊度进行了测定,结果如图1所示。随着pH的增加,2种多糖混合后的溶液浊度先增加后下降,在pH=6左右时溶液浊度达到最大值,说明在该pH下二者交联效果最好,故选择该pH作为丁酸梭菌孢子的包埋条件。
图1 海藻酸钠与壳聚糖不同pH条件下的交联浊度

Fig.1 Cross-linking turbidity of sodium alginate and chitosan at different pH conditions

2.2 逐层包埋对丁酸梭菌孢子表面特征及黏附的影响

采用FE-SEM观测多糖包埋前后丁酸梭菌孢子表面形态变化,结果图2-A和图2-B所示。未包埋与包埋4层的丁酸梭菌孢子表面形态存在可观测的差异,包埋后丁酸梭菌孢子明显被多糖覆盖。由于使用的2种多糖材料带电性质不同,每包埋一层多糖其表面电荷的正负性就发生转变,故在包埋过程中对其表面电位进行测定可以验证多糖是否成功逐层包埋于丁酸梭菌孢子表面。包埋过程丁酸梭菌孢子表面电位变化情况如图2-C所示,提示2种多糖利用静电相互作用实现了丁酸梭菌孢子的逐层包埋。
图2 逐层包埋对丁酸梭菌孢子表面特征及黏附的影响

A:未包埋丁酸梭菌孢子FE-SEM图片;B:包埋4层多糖后丁酸梭菌孢子Fe-SEM图片;C:包埋过程中丁酸梭菌孢子表面电位变化情况;D:包埋不同层数丁酸梭菌孢子的黏附率。**:P<0.01。

Fig.2 Effects of layer-by-layer encapsulation on surface characteristics and adhesion of Clostridium butyricum spores

A: FE-SEM image of unembedded Clostridium butyricum spores; B: FE-SEM image of Clostridium butyricum spores after embedding four layers of polysaccharide; C: changes of Clostridium butyricum spore surface potential during embedding; D: adhesion rate of Clostridium butyricum spores embedded in different layers. **: P<0.01.

通过Caco-2细胞体外黏附模型试验探究了包埋不同层数且带不同电性丁酸梭菌孢子的黏附能力,结果如图2-D所示。未包埋丁酸梭菌孢子的黏附率为(2.70±0.56)%,包埋1和3层的丁酸梭菌孢子的黏附率分别为(26.78±6.87)%、(16.20±4.33)%,包埋2和4层的丁酸梭菌孢子的黏附率分别为(2.52±0.42)%和(1.96±0.57)%,可见外层包裹多糖的带电性质差异显著影响丁酸梭菌孢子的黏附率。

2.3 逐层包埋对丁酸梭菌孢子耐受胃肠液的影响

分别考察SGF处理3 h,以及先SGF处理2 h后SIF继续处理6 h对包埋不同层数丁酸梭菌孢子存活率的影响,结果如图3-A和图3-B所示。随着包埋层数的增加,丁酸梭菌孢子的存活率呈现出上升趋势。包埋4层多糖的丁酸梭菌孢子经SGF处理3 h后存活率可达(96.28±3.13)%,比未包埋的丁酸梭菌孢子提高1.22倍;经过SGF处理2 h继续SIF处理6 h后存活率为(87.79±3.41)%,相较于未包埋的丁酸梭菌孢子提高1.86倍。在包埋4层后丁酸梭菌孢子存活率已大幅度提高,继续包埋虽然理论上可以进一步提高但是提升空间不大,考虑到工艺成本,后续试验均将丁酸梭菌孢子最多逐层包埋至4层多糖为止。下面进一步对包埋3和4层多糖丁酸梭菌孢子经过模拟胃肠液处理后其表面多糖的崩解情况进行探究。
图3 逐层包埋丁酸梭菌孢子经模拟胃肠液处理后的存活率

A:逐层包埋丁酸梭菌孢子经模拟胃液处理3 h的存活率;B:逐层包埋丁酸梭菌孢子经模拟胃液处理2 h继续经模拟肠液处理6 h的存活率。*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001。

Fig.3 Survival rate of layer-by-layer embedded Clostridium butyricum spores treated with SGF and SIF

A: the survival rate of layer-by-layer embedded Clostridium butyricum spores treated with SGF for 3 h; B: the survival rate of layer-by-layer embedded Clostridium butyricum spores treated with SGF for 2 h and continuously treated with SIF for 6 h. *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001.

2.4 逐层包埋丁酸梭菌孢子在不同pH环境下表面多糖的崩解

分别考察pH=2的SGF母液与pH=7的SIF母液处理2 h对包埋3和4层的丁酸梭菌孢子表面平均电荷的影响,以探究多糖崩解情况,结果如图4-A和图4-B所示。图4-A显示,外层为壳聚糖的3层包埋丁酸梭菌孢子在pH=2的SGF母液内,表面平均电荷在0.5 h内由初始时的正电位先下降后上升,在2 h时重新变为带电性较高的正电位,该结果提示多糖包衣迅速崩解,根据其表面电位变化情况推测在2 h后仅剩最内层的壳聚糖;而外层为海藻酸钠的包埋4层的丁酸梭菌孢子在SGF母液中处理2 h后电位呈现正电荷,表面多糖也表现出快速崩解的特点,但较前者速度减慢,推测可能仅最外层的海藻酸钠完全崩解。图4-B显示,包埋3层的丁酸梭菌孢子在pH=7的SIF母液内,表面平均电荷由初始正电位变为表面平均电位为0左右,并在2 h内基本保持稳定;而包埋4层的丁酸梭菌孢子在2 h内表面平均电荷变化较小,并始终保持负电位,说明在该条件下海藻酸钠层崩解缓慢。考虑到后续应用于动物体内转运过程要经过胃肠液环境到达结肠定植位点,所以包埋4层的丁酸梭菌孢子可能在后续应用过程中更具有优势,因而后续模拟肠道递送与黏附试验选用包埋4层的丁酸梭菌孢子作为研究对象。
图4 包埋3和4层丁酸梭菌孢子在不同pH环境中的释放

A:包埋丁酸梭菌孢子在pH=2的SGF母液中释放;B:包埋丁酸梭菌孢子在pH=7的SIF母液中释放。

Fig.4 Release of 3-layer and 4-layer embedded Clostridium butyricum spores in different pH environments

A: the release of the embedded Clostridium butyricum spores in the SGF stock solution of pH=2; B: the release of the embedded Clostridium butyricum spores in the SIF stock solution of pH=7.

2.5 胃肠液对逐层包埋4层多糖的丁酸梭菌孢子释放的影响

将逐层包埋4层多糖的丁酸梭菌孢子先经过SGF处理2 h,随后连续SIF处理8 h,每隔2 h取样,用FE-SEM观测其表面多糖的崩解情况,并利用电位仪测量其表面电位变化。电镜观察结果如图5-A~E所示,可以看出包埋在丁酸梭菌孢子表面的多糖逐渐消失,丁酸梭菌孢子逐渐暴露。表面电位变化结果如图5-F所示,随着胃肠液处理丁酸梭菌孢子表面电位先变为正电,后续变为负电荷,且电负性逐渐增大,但数据结果并未表现出严格的逐层释放特征,推测可能是由于不同层多糖互相交联紧密,所以在释放过程中无法逐层崩解。
图5 模拟胃肠液处理过程中包埋丁酸梭菌孢子释放及表面电位变化

A:包埋丁酸梭菌孢子经SGF处理2 h后的Fe-SEM图片;B:包埋丁酸梭菌孢子经SGF处理2 h后再经SIF处理2 h后的Fe-SEM图片;C:包埋丁酸梭菌孢子经SGF处理2 h后再经SIF处理4 h后的Fe-SEM图片;D:包埋丁酸梭菌孢子经SGF处理2 h后再经SIF处理6 h后的Fe-SEM图片;E:包埋丁酸梭菌孢子经SGF处理2 h后再经SIF处理8 h后的Fe-SEM图片;F:模拟胃肠液中处理不同时长包埋丁酸梭菌孢子表面电位变化。

Fig.5 Release and surface potential change of embedded Clostridium butyricum spores during simulated gastrointestinal fluid treatment

A: FE-SEM image of embedded Clostridium butyricum spores were treated in SGF for 2 h; B: FE-SEM image of embedded Clostridium butyricum spores were treated in SGF for 2 h and continuously treated with SIF for 2 h; C: FE-SEM image of embedded Clostridium butyricum spores were treated in SGF for 2 h and continuously treated with SIF for 4 h; D: FE-SEM image of embedded Clostridium butyricum spores were treated in SGF for 2 h and continuously treated with SIF for 6 h; E: FE-SEM image of embedded Clostridium butyricum spores were treated in SGF for 2 h and continuously treated with SIF for 8 h; F: changes of surface potential of embedded Clostridium butyricum spores treated with simulated gastrointestinal fluid for different time.

2.6 胃肠液对逐层包埋4层多糖的丁酸梭菌孢子黏附特性的影响

显微镜下观察丁酸梭菌孢子黏附的状态,结果如图6-A所示,对照组丁酸梭菌孢子黏附趋向于分散状态,而包埋后丁酸梭菌孢子黏附趋向于聚集状态,但随着丁酸梭菌孢子在模拟胃肠液处理时间的延长,丁酸梭菌孢子聚集状态变弱,更加趋于分散。由图6-B可知,逐层包埋4层多糖的丁酸梭菌孢子经模拟胃肠液处理4、6、8 h后相对于未包埋的丁酸梭菌孢子黏附率均有显著提高(P<0.01,P<0.05,P<0.05),分别提高了3.59、3.33和1.71倍。
图6 胃肠液处理对包埋丁酸梭菌孢子黏附特性的影响

A:包埋前后以及包埋后丁酸梭菌孢子在模拟胃肠液中处理不同时长对Caco-2细胞黏附情况的显微镜照片;B:包埋丁酸梭菌孢子在模拟胃肠液中处理不同时长对Caco-2细胞黏附率的变化。*:P<0.05;**:P<0.01。

Fig.6 Effects of gastrointestinal fluid treatment on adhesion characteristics of embedded Clostridium butyricum spores

A: microphotographs of spores before and after encapsulation and embedded Clostridium butyricum spores were treated in simulated gastrointestinal fluid for different time on the adhesion of Caco-2 cells; B: changes of the adhesion rate of Caco-2 cells treated with embedded Clostridium butyricum spores in simulated gastrointestinal fluid for different time. *: P<0.05; **: P<0.01.

2.7 胃肠液与包埋工艺对丁酸梭菌孢子生长萌发性能的影响

如图7所示,空白对照组丁酸梭菌孢子在2 h时已经进入对数生长期,而经过胃肠液处理后的丁酸梭菌孢子均在4 h时进入对数生长期,包埋4层的丁酸梭菌孢子生长略有滞后,但仍然保持其萌发和增殖的能力,且达到稳定期后的吸光度值与其他组比较也基本持平,提示包埋工艺以及胃肠液的消化并不影响丁酸梭菌孢子的萌发和增殖。
图7 包埋丁酸梭菌孢子经模拟胃肠液处理后的生长曲线

Fig.7 Growth curve of embedded Clostridium butyricum spores treated with SGF and SIF

3 讨论

3.1 最佳包埋pH

海藻酸盐和壳聚糖溶液混合后会因静电相互作用的存在发生络合导致溶液混浊,并且在pH=6左右时浊度最高,说明此时2种多糖之间静电相互作用最强,交联效果最好,所以在包埋过程中,我们选择把反应体系pH控制在6左右。这与Qi等[31]在海藻酸钠微胶囊上覆盖壳聚糖涂层采用的pH条件一致。根据丁酸梭菌孢子表面电位的变化和电镜结果提示多糖成功包埋于丁酸梭菌孢子的表面。

3.2 包埋层数对丁酸梭菌孢子存活率及黏附性的影响

测定不同包埋层数的丁酸梭菌孢子在模拟胃肠液中的存活率发现,包埋1层壳聚糖的丁酸梭菌孢子存活率并没有明显提高,但随着后续包埋层数的增加,存活率显著提高。多糖包埋后提高了丁酸梭菌孢子在胃肠液中的耐受性,从而使更多具备生物活性的丁酸梭菌孢子到达结肠部位的定植位点成为可能[32]。静电相互作用在细菌对肠上皮细胞的黏附作用中起着至关重要的影响[33-34],由于包埋后最外层多糖种类不同导致其表面带电性质差异。当最外层为壳聚糖时,其对肠上皮细胞的黏附作用显著提高。分析原因是因为上皮细胞带负电,而壳聚糖带正电,在黏附过程中可生成离子键,导致丁酸梭菌孢子黏附能力的提高。此结论与前人的研究结果相符,细菌表面带有正电可提高细菌黏附能力[35⇓⇓-38],Chen等[23]在海藻酸钠包裹的益生菌微球表面进一步覆盖带正电荷的壳聚糖和硫化壳聚糖,益生菌的黏附效果分别提高2.4和3.1倍。考虑到在经过肠道递送过程中丁酸梭菌孢子表面的多糖存在崩解的情况,我们对最外层为壳聚糖层的3层包埋丁酸梭菌孢子和最外层为海藻酸钠层的4层包埋丁酸梭菌孢子在模拟胃肠液环境中处理,发现海藻酸钠层相较于壳聚糖层在SGF与SIF的不同pH条件下均能维持更长时间,进而保证包埋丁酸梭菌孢子在动物体内转运时能更加顺利的到达结肠部位,结合上述存活率测定结果,确定最佳包埋层数为4层,由内到外依次为壳聚糖、海藻酸钠、壳聚糖、海藻酸钠。

3.3 包埋4层丁酸梭菌孢子在模拟胃肠道递送过程中的黏附性变化

包埋4层多糖的丁酸梭菌孢子在SGF处理2 h后,其表面电位由原来带负电变为带正电;而后在连续SIF处理过程中其电位逐渐由正变负,且电负性逐渐增强,这可能是多糖的崩解造成的。正因如此导致了丁酸梭菌孢子的黏附率随着SIF处理时间的延长呈现出下降趋势,但相较于未包埋的丁酸梭菌孢子黏附率依然显著提高,进一步证明表面电位越接近正电位越有利于丁酸梭菌孢子黏附。本试验的结果与Ortega-Anaya等[30]的试验结果相悖,后者表现为细菌表面电负性增强后,黏附性能依然增加,这可能是由于细菌表面处理材料或黏附模型不同所导致。包埋4层丁酸梭菌孢子经模拟胃肠液处理后的Caco-2细胞黏附试验结果显示,包埋后的丁酸梭菌孢子对肠上皮细胞的黏附与未包埋的丁酸梭菌孢子相比趋向于聚集,但随着模拟胃肠液处理时间的延长,也逐渐趋向于游离,究其原因可能是在初始包埋过程中由于2种多糖材料电性差异导致交联时互相黏连在一起,而在模拟胃肠液处理过程中由于多糖在丁酸梭菌孢子表面的崩解导致孢子逐渐分散。

3.4 包埋对丁酸梭菌孢子生长的影响

包埋不同层的丁酸梭菌孢子经过模拟胃肠液处理后进行体外培养,与未处理丁酸梭菌孢子相比发现其生长与萌发活性并未受到包埋工艺和包埋材料的影响,所以理论上当包埋丁酸梭菌孢子经过胃肠液消化并黏附于肠道上皮细胞后可以正常生长繁殖并发挥益生作用。

4 结论

包埋4层多糖不仅提高了丁酸梭菌孢子对胃肠液的耐受性,并且增强了其对肠上皮细胞的黏附能力,同时证实了该包埋工艺并不影响丁酸梭菌孢子的萌发和增殖。这为其顺利通过动物肠道的不利环境并在肠道内发挥益生作用创造了必要的前提,进而为益生菌饲料添加剂开发提供一定技术支持。

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