基于网络药理学和分子对接分析金银花在奶牛生产中的抗炎作用及机制

杨嘉睿; 高家瑞; 赵梓轩; 蒋林树; 童津津

doi:10.12418/CJAN2023.289

动物营养学报 >

2023 , Vol. 35 >Issue 5: 3104 - 3118

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.289

研究论文

基于网络药理学和分子对接分析金银花在奶牛生产中的抗炎作用及机制

杨嘉睿 ,
高家瑞 ,
赵梓轩 ,
蒋林树 ,
童津津 ^,^**

展开

北京农学院动物科学技术学院,奶牛营养学北京市重点实验室,北京 102206

**童津津,讲师,E-mail: tongjinjin0451@163.com

*同等贡献作者

杨嘉睿(2003—),男,北京人,本科生,研究方向为反刍动物营养与免疫。E-mail: yangjiarui0713@sina.com

Copy editor: 田艳明

收稿日期: 2022-07-19

网络出版日期: 2023-05-11

基金资助

2022年北京市教委分类发展项目

2022北京市教育委员会科学研究计划项目(KM202210020006)

收起

Anti-Inflammatory Effect and Mechanism of Lonicerae Japonicae Flos in Dairy Cow Production Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

YANG Jiarui ,
GAO Jiarui ,
ZHAO Zixuan ,
JIANG Linshu ,
TONG Jinjin ^,^**

Expand

Beijing Key Laboratory of Dairy Cow Nutrition, College of Animal Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China

**lecturer, E-mail: tongjinjin0451@163.com

*Contributed equally

Received date: 2022-07-19

Online published: 2023-05-11

Fold

摘要

本研究通过网络药理学的方法探究金银花在奶牛生产中的抗炎作用机制,并应用分子对接技术进行验证。利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库筛选金银花的主要有效成分及其作用靶点,通过GeneCards、DisGeNET和PubMed数据库收集炎症的靶点;将金银花-炎症的交集靶点导入STRING数据库获得蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络图,通过Cytoscape 3.9.1软件及其插件CytoNCA获得“有效成分-潜在作用靶点-通路”网络图,筛选出PPI网络中的核心靶点;通过David数据库对金银花-炎症交集靶点进行基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析;最后通过PyMOL软件进行分子对接,验证关键有效成分与核心靶点的结合活性。结果表明:1)共获得金银花有效成分23个,金银花与炎症交集靶点共158个。2)PPI网络主要涉及肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)和前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)等核心靶点。3)GO功能富集分析获得了168个生物过程、16个细胞组成以及38个分子功能(P<0.05);KEGG通路富集分析得到20条相关信号通路(P<0.05),主要涉及Janus激酶-信号转导子与转录激活子(JAK-STAT)信号通路、叉头转录因子O亚族蛋白(FoxO)信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路这3个重要的信号通路。4)分子对接结果表明,金银花的2个重要有效成分木樨草素和槲皮素与核心靶点IL-1β稳定结合。综上所述,本研究通过网络药理学与分子对接揭示了金银花在奶牛中的多成分、多靶点和多途径的抗炎作用机制,并验证了金银花的关键有效成分木樨草素和槲皮素与核心靶点IL-1β的稳定性,为金银花在奶牛养殖中的进一步应用提供了理论依据。

关键词： 金银花; 炎症; 网络药理学; 分子对接; 奶牛

本文引用格式

杨嘉睿 , 高家瑞 , 赵梓轩 , 蒋林树 , 童津津 . 基于网络药理学和分子对接分析金银花在奶牛生产中的抗炎作用及机制[J]. 动物营养学报, 2023 , 35(5) : 3104 -3118 . DOI: 10.12418/CJAN2023.289

Abstract

This study explored the anti-inflammatory mechanism of Lonicerae japonicae flos in dairy cow production through the method of network pharmacology, and verified by molecular docking technology. The main effective components and their targets of Lonicerae japonicae flos were screened using the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) database, and the inflammatory targets were collected through GeneCards, DisGeNET and PubMed databases. The intersection targets of Lonicerae japonicae flos and inflammation were imported into STRING database to obtain the protein-protein interaction (PPI) network diagram, and the “effective component-potential target-pathway” network diagram was obtained by Cytoscape 3.9.1 software and its plug-in CytoNCA to screen out the core targets in PPI network. The gene ontology (GO) function and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis was performed for the target of Lonicerae japonicae flos-inflammatory intersection using David database. Finally, PyMOL software was used for molecular docking to verify the binding activity of key effective components and core targets. The results showed as follows: 1) a total of 23 effective components of Lonicerae japonicae flos and 158 intersection targets of Lonicerae japonicae flos and inflammation were obtained. 2) PPI network mainly involved core targets such as tumor necrosis factor (TNF), interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β), serine threonine protein kinase 1 (AKT1), and prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2). 3) A total of 168 biological processes, 16 cell compositions and 38 molecular functions were obtained by GO functional enrichment analysis (P<0.05), and KEGG pathway enrichment analysis showed 20 related signaling pathways (P<0.05), mainly involving three important signaling pathways as Janus kinase-signal transductor and transcriptional activator (JAK-STAT), Forkhead transcription factor O subfamily protein (FoxO) and mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways. 4) Molecular docking results showed that two important effective components of Lonicerae japonicae flos, luteolin and quercetin, were stable to bind to the core target IL-1β. In conclusion, this study reveals the multi-component, multi-target and multi-pathway anti-inflammatory mechanism of Lonicerae japonicae flos in dairy cows through network pharmacology and molecular docking, and verifies the stability of the key effective components of Lonicerae Japonicae Flos, luteolin and quercetin, and the core target IL-1β, which provides a theoretical basis for the further application of honeysuckle in dairy cow production.

Key words： Lonicerae japonicae flos; inflammation; network pharmacology; molecular docking; dairy cows

近年来,随着系统生物学、高通量测序技术以及多向药理学的飞速发展,以系统生物学理论、生物系统分析和特定信号节点选择为基础的多靶点药物分子设计的一个新领域——网络药理学,越来越受到关注。网络药理学更着重于多渠道调控信号通路,能够提高药物的疗效并减少其毒副作用,从而提高新药临床试验的成功,能够有效节约药物开发成本。

金银花(Lonicerae japonicae flos)作为一种传统中药药材,是忍冬科忍冬属植物的干燥花芽或含苞欲放的花蕾,具有清热解毒、凉散风热的功效,主治热性病、入咽喉肿痛及身热等症,效果显著^[1]。已有研究表明,从金银花中分离并鉴定出了140多种化合物,包括有机酸、类黄酮、三萜类皂苷和环烯醚等,其中绿源酸类化合物是主要有效成分,也是药材的指标成分^[2]。金银花具有抗病毒、抗氧化、抗诱变、抗炎、抗菌和免疫调节等多种生物学作用^[3]。据报道,当金银花浓度为25 mg/mL时,可显著抑制奶牛病毒性腹泻病毒的活性^[4]。饲粮中添加金银花提取物,可显著提高热应激奶牛的免疫应答,有助于缓解奶牛热应激损伤,增加产奶量^[5]。此外,研究发现,饲粮添加金银花可以显著提高肉牛的生产性能,降低料重比,提高平均日增重及肉牛的体液免疫水平,增强肉牛抗菌抗病毒的能力,降低普通病的发病率^[6]。值得注意的是,金银花对牛消化系统、呼吸系统及生殖系统疾病等方面都会起到预防作用^[7]。此外,唐志文^[8]证实了添加金银花提取物可显著提高奶牛瘤胃液中的乳酸、微生物蛋白和挥发性脂肪酸的浓度,可有效调节瘤胃发酵。

奶牛由于机体代谢负荷过大,免疫力低下,常常导致机体发生炎症。特别是围产期奶牛,在产后几周内由于生理状况和物质代谢的剧烈变化以及免疫功能的改变,会导致各种炎症的发生^[9]。当奶牛发生急性乳腺炎时,直接导致奶产量和乳品质的降低,带来巨大的经济损失^[10]。目前,已有大量研究表明,金银花在奶牛抗炎方面的应用具有显著成效,适宜添加金银花提取物会提高奶牛的生产性能;在治疗各种牛的炎症过程中,中药复方中都会配用一定比例的金银花或占绝大部分比重,如治疗奶牛乳腺炎、奶牛子宫内膜炎、牛额窦炎以及牛子宫炎和阴道炎等^[11⇓-13],含有金银花的药物治疗效果显著,能够快速治愈各类炎症,并且药力强、药效好,无毒副作用,不易复发。

虽然金银花在奶牛抗炎方面有大量的研究报道,但其具体的作用机制尚未阐明。因此,本文应用网络药理学和分子对接技术对金银花在奶牛生产中的抗炎作用机制进行探索,为金银花进一步在奶牛养殖中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 金银花化学成分及作用靶点数据来源

中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP, https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)是各种中草药和药理机制的数据库,能够搜索药物、靶点和疾病之间的关系。TCMSP包含各种天然化合物的药代动力学特性,如口服生物利用度(OB)、类药性(DL)等^[14]。OB是生物利用度,表示中药制剂物被吸收进入人体循环的速度和程度;DL是化合物与已知药物的相似性。OB≥30%、DL≥0.18为有效成分的基本筛选条件,也是生物体接受的基础条件。因此,本文以“Lonicerae japonicae flos”作为关键词进行搜索,设置OB≥30%、DL≥0.18进行筛选过滤,最终获取金银花的有效成分及其作用靶点。通过SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/index.php)和Stitch(http://stitch.embl.de/)2个数据库对有效成分的作用靶点进行预测,使用DrugBank(https://www.drugbank.ca/)再次搜索金银花有效成分的作用靶点。除去重复靶点后,将所获得的金银花化合物有效成分的靶点输入UniProt数据库(https://www.uniprot.org)以获取其靶点的规范名称。

1.2 炎症相关靶点获取

使用GeneCards(http://www.genecards.org/)^[15]、DisGeNET(https://www.disgenet.org/)和PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)3个基因数据库,分别以“inflammation”为关键词,对疾病基因进行搜索,数据库类型为“Gene”,物种限定为“Bos taurus”,筛选以上2个数据库中得到的靶点,整合并删除重复的靶点,建立炎症相关靶点的Excel文件。

1.3 金银花-炎症交集靶点确定

将炎症的相关靶点与金银花有效成分的作用靶点通过Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)线上制图平台,获得金银花-炎症的交集靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络构建

PPI网络是靶点蛋白之间的相互作用网络^[16],为了探索金银花治疗炎症的作用机制,将获得的交集靶点上传于STRING数据库,构建PPI网络。依据STRING结合各不同证据通道的概率计算综合得分,并对随机交互的概率进行校正,取用最低评分0.4为中等可信度、0.7为高可信度、0.9为最高可信度^[17]。本研究选用了评分为0.4的PPI网络,导出PPI互作图和tsv文件;将tsv文件导入Cytoscape 3.9.1绘制PPI网络图,使用CytoNCA插件进行网络拓扑分析,计算节点的度值、介数中心性和子网络中心数,筛选出关键核心靶点。度值是最直接的度量指标,节点越大度值越高,在网络中就越重要;介数中心性用于计量通过每一个节点的基因;接近中心性的数值可以直观衡量节点的重要性。

1.5 基因本体(gene ontology,GO)功能和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析

利用David数据库(https://david.ncifcrf.gov/),对金银花和炎症交集靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析,以P值(P-value)为条件进行显著性判断^[18]。GO功能富集分析时,以P<0.05作为筛选条件;KEGG通路富集分析时,以P<0.05作为筛选条件。通过微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn)制作GO直方图与KEGG气泡图。

1.6 分子对接

通过TCMCP(https://tcmspw-e.com/tcmsp.php)搜索木樨草素和槲皮素,得到这2种有效成分的InChIKey。登录PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),搜索并下载配体木樨草素和槲皮素的2D结构,保存成SDF格式;利用Chem 3D软件转换为mol2格式文件,导入AutodockTools 1.5.6软件进行加全氢、设置为配体(自动分布电荷)、检测配体的Torsion tree中的扭转键以及选择扭转键等处理,保存为pdbqt格式文件。登录UniProt数据库(https://www.uniprot.org)复制核心靶点的Entry Name,选择条件“已验证,物种人”。使用PDB数据库(https://www.rcsb.org/),选择蛋白质晶体分辨率为2.0~3.0,下载核心靶点,即受体肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)和前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)的PDB格式文件。使用AutodockTools 1.5.6软件将核心靶点蛋白作去水和加氢的处理。首先,AutodockTools 1.5.6软件设置Grid,选择对应的配体文件、受体文件,选择半柔性对接,设置GridBox,包裹住全部受体,保存为GPF格式文件,运行RUN AutoGrid,设置对接参数及运算方法,保存为DPF格式文件;然后,设置Dock,依次选择配体文件、受体文件等,运行Run Autodock,保存为DPF格式文件;最后,分析运算结果,选取自由结合能绝对值最大的构象为参考数据。使用PyMOL 2.5.2软件实现分子对接数据可视化。

2 结果

2.1 金银花有效成分和作用靶点获取结果

使用TCMSP数据库进行化学成分收集,收集到236种成分,符合OB>30%、DL>0.18这2个筛选条件的化学成分有23种,即对金银花的这23种有效成分进行后续的分析(表1)。

表1 金银花的有效成分

Table 1 Effective components in Lonicerae japonicae flos

分子编号 Numerator number	中文名称 Chinese name	英文名称 English name	口服生物利用度 OB/%	类药性 DL
MOL001494	亚油酸乙酯	mandenol	42	0.19
MOL001495	亚麻酸乙酯	ethyl linolenate	46.1	0.2
MOL002707	六氢番茄红素	phytofluene	43.18	0.5
MOL002914	黄烷酮	eriodyctiol (flavanone)	41.35	0.24
MOL003006		(-)(3R,8S,9R,9aS,10aS)-9-ethenyl-8-(beta-D- glucopyranosyloxy)-2,3,9,9a,10,10a-hexahydro-5- oxo-5H,8H-pyrano[4,3-d]oxazolo[3,2-a]pyridine-3- carboxylic acid_qt	87.47	0.23
MOL003014		scologanic dibutylacetal_qt	53.65	0.29
MOL002773	β-胡萝卜素	beta-carotene	37.18	0.58
MOL003036		ZINC03978781	43.83	0.76
MOL003044	金圣草(黄)素	chryseriol	35.85	0.27
MOL003059	β-隐黄素	cryptoxanthin	47.25	0.57
MOL003062		4,5’-retro-.beta.,.beta.-arotene-3,3’-dione, 4’,5’-didehydro-	31.22	0.55
MOL003095		5-hydroxy-7-methoxy-2-(3,4,5- trimethoxyphenyl)chromone	51.96	0.41
MOL003101		7-epi-vogeloside	46.13	0.58
MOL003108		caeruloside C	55.64	0.73
MOL003111		centauroside_qt	55.79	0.5
MOL003117		loniceracetalides B_qt	61.19	0.19
MOL003124		xylostosidine	43.17	0.64
MOL003128		dinethylsecologanoside	48.46	0.48
MOL000358	β-谷甾醇	beta-sitosterol	36.91	0.75
MOL000422	山奈酚	kaempferol	41.88	0.24
MOL000449	豆甾醇	stigmasterol	43.83	0.76
MOL000006	木樨草素	luteolin	36.16	0.25
MOL000098	槲皮素	quercetin	46.43	0.28

2.2 金银花有效成分-靶点构建

通过SwissTargetPrediction(P>0.5)和Stitch预测的靶点数分别为351和40个,DrugBank中搜集171个靶点。与使用TCMSP数据库得到的靶点合并、去除重复项后获得靶点158个,将靶点导入Cytoscape中,获得成分靶点图(图1)。

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图1 金银花有效成分-靶点图

MAPK14:丝裂原活化蛋白激酶14 mitogen-activated protein kinase 14;IRF1:干扰素调节因子1 interferon regulatory factor 1;IL-6:白细胞介素-6 interleukin-6;IL-1β:白细胞介素-1β interleukin-1β;IL-1α:白细胞介素-1α interleukin-1α;IL-10:白细胞介素-10 interleukin-10;IFNG:干扰素-γ interferon-gamma;ICAM1:细胞间黏附分子1 intercellular adhesion molecule 1;HSP90AA1:热休克蛋白HSP 90-alpha成员A1 heat shock protein 90-alpha, member A1;HMOX1:血红素加氧酶1 heme oxygenase 1;HIF1A:缺氧诱导因子1α hypoxia-inducible factor 1α;EGFR:表皮生长因子受体 epidermal growth factor receptor;CYP1A1:细胞色素P450家族1亚家族A多肽1 cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1;CXCL:趋化因子(C-X-C基序)配体 chemokine (C-X-C motif) ligand;CTNNB1:连环蛋白β1 catenin beta-1;CRP:C反应蛋白 C-reactive protein;CDKN1A:细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A cyclin dependent kinase inhibitor 1A;CD40LG:CD40配体 CD40 ligand;CCL2:CC基序趋化因子配体2 C-C motif chemokine ligand 2;BIRC5:含杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列蛋白5 baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing 5;APP:淀粉样前体蛋白 amyloid precursor protein;AKT1:丝氨酸苏氨酸蛋白激酶1 serine threonine protein kinase 1;VEGFA:血管内皮生长因子A vascular endothelial growth factor A;TP53:肿瘤蛋白p53 tumor protein p53;TNF:肿瘤坏死因子 tumor necrosis factor;THBD:血栓调节蛋白 thrombomodulin;TGFB1:转化生长因子β1 transforming growth factor beta 1;SPP1:分泌型焦磷酸蛋白1 secreted phosphoprotein 1;SERPINE1:丝氨酸蛋白酶抑制蛋白E1 Serpin family E member 1;SELE:选择素E selectin E;RELA:转录因子p65 transcription factor p65;PTGS2:前列腺素内过氧化物合酶2 prostaglandin-endoperoxide synthase 2;PTGES:前列腺素E合成酶 prostaglandin E synthase;PPARG:过氧化物酶体增殖物激活受体γ peroxisome proliferator activated receptor gamma;PPARA:过氧化物酶体增殖物激活受体α peroxisome proliferator activated receptor alpha;PLAU:尿激酶型纤溶酶原激活物 plasminogen activator, urokinase;PLAT:组织型纤溶酶原激活物 plasminogen activator, tissue;PGR:孕酮受体 progesterone receptor;PARP1:聚(ADP-核糖)聚合酶1 poly(ADP-ribose) polymerase 1;NR3C2:核受体亚家族3 C组成员2 nuclear receptor subfamily 3 group C member 2;NR3C1:核受体亚家族3 C组成员1 nuclear receptor subfamily 3 group C member 1;NOS:一氧化氮合酶 nitric oxide synthase;NFE2L2:核因子红细胞衍生2样2 nuclear factor erythroid-derived 2-like 2;MPO:髓过氧化物酶 myeloperoxidase;MMP:基质金属蛋白酶 matrix metalloproteinase。图3和图6同 the same as Fig.3 and Fig.6。
正菱形节点代表有效成分,圆形节点代表靶点。

Fig.1 Effective components-targets diagram of Lonicerae japonicae flos

Positive diamond nodes represented active components, and circular nodes represented targets.

2.3 交集靶点筛选及PPI网络构建

通过GeneCards、DisGeNET和PubMed数据库分别获取炎症相关基因10 898、467和567个,将3个数据库的数据取并集、去除重复项后获得炎症相关靶点共10 900个。上传成分-靶点、疾病-靶点于Venny 2.1.0网络在线服务器中,获得金银花有效成分与炎症共有靶点53个(图2),表明金银花中23个有效成分的53个潜在作用靶点与炎症密切相关。将共有靶点导入STRING,构建评分0.4的PPI网络,去除不满足评分的靶点后如图3所示。通过DisGeNET对获得的18个核心靶蛋白进行属性整理(表2),结果表明这些靶点分别为激酶、转录因子和信号分子等,其中TNF、IL-6、IL-1β、AKT1和PTGS2为度值前5的靶点,预测为是治疗炎症的关键核心靶点。

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图2 金银花有效成分靶点-炎症靶点韦恩图

Fig.2 Venn diagram of effective component targets of Lonicerae japonicae flos and inflammatory targets

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图3 金银花炎症潜在靶点PPI网络图

Fig.3 PPI network diagram of potential targets of Lonicerae japonicae flos and inflammation

表2 核心靶点的基本信息

Table 2 Basic information of core targets

蛋白质编号 Protein ID	名称 Names	中文名 Chinese names	蛋白质类别 Protein type	度值 Degree value
P01375	TNF	肿瘤坏死因子	信号分子	49
P05231	IL-6	白细胞介素-6	无	44
P31749	AKT1	丝氨酸苏氨酸蛋白激酶1	激酶	43
P01584	IL-1β	白细胞介素-1β	无	43
P335354	PTGS2	前列腺素内过氧化物合酶2	氧化还原酶	41
P22301	IL-10	白细胞介素-10	无	41
P10145	CXCL8	趋化因子(C-X-C基序)配体8	信号分子	40
P14780	MMP9	基质金属蛋白酶9	氧化还原酶	39
P05362	ICAM1	细胞间黏附分子1	无	38
P04637	TP53	肿瘤蛋白p53	转录因子	37
P05121	SERPINE1	丝氨酸蛋白酶抑制蛋白E1	酶调节剂	36
P13500	CCL2	CC基序趋化因子配体2	信号分子	35
P15692	VEGFA	血管内皮生长因子	信号分子	34
P15692	CTNNB1	连环蛋白β1	无	33
Q04206	RELA	转录因子p65	转录因子	33
P00533	EGFR	表皮生长因子受体	激酶	32
P29475	NOS3	一氧化氮合酶3	无	28
P02741	CRP	C反应蛋白	无	28

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

2.4.1 GO功能富集分析

将金银花有效成分靶点与炎症靶点的交集靶点53个,通过David数据库进行生物功能富集分析。结果表明,生物学过程(biological process,BP)共有168个,排名前10的主要有催化活性的调节(regulation of catalytic activity)、细胞对成纤维细胞生长因子刺激的反应(cellular response to fibroblast growth factor stimulus)、肌细胞细胞内稳态(muscle cell cellular homeostasis)、白细胞介素-1介导的信号通路(interleukin-1-mediated signaling pathway)、破骨细胞分化的正向调节(positive regulation of osteoclast differentiation)、与新生血管萌发有关的细胞迁移(cell migration involved in sprouting angiogenesis)、正趋化性诱导(induction of positive chemotaxis)、白细胞栓系或滚动(leukocyte tethering or rolling)、髓鞘形成调节( regulation of myelination)和巨噬细胞分化(macrophage differentiation)等,表明金银花可以调控以上生物学过程中发挥抗炎作用;细胞组分(cellular component,CC)共有16个,包括细胞质基质(cytosol)、泡膜(vesicle membrane)、细胞间连接(cell-cell junction)、膜筏(membrane raft)、皮层细胞骨架(cortical cytoskeleton)、核膜腔(nuclear envelope lumen)、受体复合物(receptor complex)、细胞顶端(apical part of cell)、丝氨酸型肽酶复合物(serine-type peptidase complex)和蛋白-DNA复合物(protein-DNA complex)等;分子功能(molecular function,MF)主要包含金属内肽酶活性(metalloendopeptidase activity)、类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)、黄素单核苷酸结合(FMN binding)、氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)、整合素结合(integrin binding)、白细胞介素-1受体结合(interleukin-1 receptor binding)、核心启动子序列特异性DNA结合(core promoter sequence-specific DNA binding)、蛋白质结合(protein binding)、蛋白酶结合(protease binding)和精氨酸结合(arginine binding)等(图4)。

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图4 金银花炎症交集靶点GO功能分析

Fig.4 GO functional enrichment analysis of intersection targets of Lonicerae japonicae flos and inflammation

2.4.2 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析筛选出P<0.05,按富集比(enrichment ratio)由高到低排序的前20条通路进行可视化(图5),图中气泡越大,表示富集到此通路的基因越多。其中,Janus激酶-信号转导子与转录激活子(JAK-STAT)信号通路(JAK-STAT signaling pathway)、叉头转录因子O亚族蛋白(FoxO)信号通路(FoxO signaling pathway)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路(MAPK signaling pathway)等为金银花发挥抗炎作用的重要信号通路。

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图5 金银花炎症交集靶点KEGG通路富集分析

Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of intersection targets of Lonicerae japonicae flos and inflammation

2.5 金银花-有效成分-炎症靶点-通路网络图构建

将KEGG通路富集分析的结果,进一步与金银花的有效成分和潜在的作用靶点一一对应,整理到Excel中。整理后的有关金银花、有效成分及靶点和靶点作用通路等数据导入Cytoscape软件,作出金银花-有效成分-炎症靶点-通路网络图(图6)。从图中可知,金银花可能通过槲皮素(MOL000098)、木樨草素(MOL000006)和山奈酚(MOL000422)等有效成分,并通过PTGS2、AKT1、TNF和转录因子p65(RELA)等核心靶点调节MAPK信号通路、JAK-STAT信号通路和FoxO信号通路等主要的信号通路,从而发挥抗炎作用,这为接下来的研究提供了思路。

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图6 金银花-有效成分-炎症靶点-通路网络图

Complement and coagulation cascades:补体与凝结级联;Apoptosis:细胞凋亡;Janus激酶-信号转导子与转录激活子信号通路 JAK-STAT signaling pathway;Necroptosis:细胞坏死性凋亡;T cell receptor signaling pathway:T细胞受体信号通路;PI3K-Akt signaling pathway:磷脂酰肌醇-3-羟激酶-蛋白激酶B信号通路;Th17 cell differentiation:Th17细胞分化;Sphingolipid signaling pathway:鞘脂信号通路;Estrogen signaling pathway:雌激素信号通路;MAPK signaling pathway:丝裂原活化蛋白激酶信号通路;Apelin signaling pathway:爱帕琳肽信号通路;Intestinal immune network for IgA production:产免疫球蛋白A肠道免疫网络;RIG-Ⅰ-like receptor signaling pathway:视黄酸(维甲酸)诱导基因蛋白-Ⅰ样信号通路;NOD-like receptor signaling pathway:NOD样受体信号通路;Adipocytokine signaling pathway:脂肪细胞因子信号通路;Leukocyte transendothelial migration:白细胞跨内皮迁移;Chemokine signaling pathway:趋化因子信号通路;VEGF signaling pathway:血管内皮生长因子信号通路;FoxO signaling pathway:叉头转录因子O亚族蛋白信号通路;Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor:病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用。

正六边形代表金银花有效成分,正中心的菱形节点代表金银花,正方形节点代表通路,圆形节点代表交集靶点;颜色越深,其富集基因越多。

Fig.6 Network diagram of the Lonicerae japonicae flos-effective component-inflammatory target-pathway

The regular hexagon represented the effective component of Lonicerae japonicae flos, the diamond node in the center represented Lonicerae japonicae flos, the square node represented the pathway, and the circular node represented the intersection target; the darker the color, the more genes were enriched.

2.6 分子对接结果

选取金银花-有效成分-炎症靶点-通路析网络图中度值最高的2个有效成分槲皮素和木樨草素,分别与度值最高的ATK1、IL-1β、IL-6、TNF和PTGS2这5个靶点蛋白进行分子对接验证。将槲皮素与木樨草素分别与5个靶点蛋白进行10次半柔性对接,选择构想最高、结合自由能绝对值最大的对接结果,并保存为pdbqt格式,然后导入PyMOL 2.2.0中进行3D可视化。结合自由能用来评价成分和靶点之间的结合能力,当结合能小于0时,提示有效成分和靶点可以自由结合,且结合自由能越低,二者亲和力越强。一般认为,结合自由能<-5 kcal/mol代表有效成分与作用靶点之间具有良好的亲和力^[19]。槲皮素和木樨草素与各靶点蛋白的对接结果如表3所示,结合自由能越低,结合活性越好,氢键结合数目越多,空间匹配越好。槲皮素、木樨草素与IL-1β均结合稳定,槲皮素与TNF结合稳定。3D可视化结果见图7和图8。

表3 槲皮素、木樨草素分别与核心靶点分子对接结果

Table 3 Molecular docking results of core targets with quercetin and luteolin

项目 Items	靶点 Targets	氢键结合数目 Number of binding hydrogen bonds	结合自由能 Binding free energy/(kcal/mol)
	TNF	5	-6.07
	ATK1	4	-3.31
槲皮素Quercetin	IL-6	2	-1.95
	IL-1β	5	-5.45
	PTGS2	2	-2.66
	TNF	3	-4.97
	ATK1	4	-3.47
木樨草素Luteolin	IL-6	2	-2.22
	IL-1β	5	-6.48
	PTGS2	5	-3.51

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图7 槲皮素与核心靶点对接的最佳构象相互作用示意图

A~E分别表示槲皮素与ATK1、PTGS2、TNF、IL-6和IL-1β的结合。

Fig.7 Schematic diagram of optimal conformational interaction of quercetin docking with core targets

A to E represented the binding of quercetin with ATK1, PTGS2, TNF, IL-6 and IL-1β, respectively.

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图8 木樨草素与核心靶点对接的最佳构象相互作用示意图

A~E分别表示木樨草素与ATK1、IL-1β、TNF、IL-6和PTGS2的结合。

Fig.8 Schematic diagram of optimal conformational interaction of luteolin docking with core targets

A to E represented the binding of luteolin with ATK1, IL-1β, TNF, IL-6 and PTGS2, respectively.

3 讨论

本文获得金银花有效成分共23种,其中亚油酸乙酯(mandenol)是一种动物体维持生命活动的必要有机物。研究表明,亚油酸乙酯能够有效缓解细菌脂多糖的作用,从而降低其致炎因子的释放;核因子-κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)2个通路蛋白的表达会被亚油酸乙酯这一有机物显著抑制,进而抑制下游炎症细胞因子如TNF、IL-6等的表达,从而发挥抗炎作用^[20]。因此,亚油酸乙酯作为金银花的有效成分之一,在奶牛抗炎过程中发挥了重要的作用。据报道,β-胡萝卜素通过抑制NF-κB通路中NF-κB p65蛋白的表达,从而抑制巨噬细胞炎症因子TNF、IL-6的分泌^[21]。山奈酚对炎症介质IL-6和TNF均有很强的抑制效应。研究表明,山奈酚通过抑制NF-κB信号通路相关蛋白的活化,抑制相关炎症介质的释放,从而发挥抗炎的药理作用^[22]。此外,槲皮素是一种常见的植物激素,具有多重生物效应,包括抗氧化、抗炎及抗肿瘤等作用。研究发现,槲皮素可降低IL-6和TNF的蛋白水平,通过抑制NF-κB和MARK信号通路从而发挥抗炎作用^[23]。绿原酸能够抑制NF-κB信号通路,从而降低IL-6、TNF、IL-1β的表达量,抗炎作用显著^[24]。而且,研究表明,金银花中的有机酸类、黄酮类化合物等也具有抗炎功能^[25],这与我们的研究结果相一致。然而,这些有效成分在金银花中的具体含量及其构效关系,特别是在奶牛生产中发挥抗炎的作用机制还有待进一步的验证。

本研究通过网络药理学筛选到金银花发挥抗炎作用的核心靶点共18个,其中TNF、IL-6、IL-1β、AKT1和PTGS2等靶点在金银花治疗炎症过程中发挥了重要作用。据报道,TNF是一种细胞调节因子,在免疫系统中对蛋白质的信号传递起关键作用,具有调节免疫细胞的功能^[26]。研究表明,IL-1β、TNF和IL-6共同参与了炎症的发生与发展过程^[27-28],其中,IL-6是由间质细胞、造血细胞、上皮细胞及其他各种细胞分泌的一种多效性细胞因子。唐志文^[8]研究发现,通过对围产期奶牛饲喂含有10%绿原酸的金银花提取物,可以显著降低血液中IL-6和触珠蛋白的含量,有效提高奶牛的抗炎能力。此外,研究表明,金银花提取物可通过抑制NF-κB信号通路的激活,降低血清中炎性因子TNF和IL-1β的含量^[29]。而且,含有金银花的中药组方可显著降低乳腺炎的炎症反应,并降低血清中TNF和IL-6的含量,减少乳房炎的发生^[30]。RELA是一种蛋白质亚基,通过磷酸化等多种翻译后修饰作用调控NF-κB的活性及转录功能,特别是RELA可介导内皮细胞中的炎症性线粒体裂变从而发挥抗炎作用。与本研究结果相一致,有研究表明CC基序趋化因子配体2(CCL2)不仅参与炎症,而且还参与多种疾病的发生^[31]。虽然肿瘤蛋白p53(TP53)在癌症治疗方面有广泛研究,但其也参与了多种细胞死亡通路,作为信号中心评估神经元损伤情况^[32]。因此,金银花中的免疫活性成分可能通过促进细胞因子的分泌及活性、减少免疫抑制细胞因子的释放以及增强启动抗炎反应的蛋白质亚基的表达来发挥抗炎功能。

本研究中,GO功能富集分析结果发现,金银花有效成分参与抗炎作用的生物学过程主要有催化活性的调节、与新生血管萌发有关的细胞迁移和正趋化性诱导等方面。研究发现,新生血管的形成是通过内皮细胞的活化、增殖和迁移完成的^[33],新生血管具有血液灌注低、溶质渗透率高以及白细胞、血小板黏性高等特点,会导致炎症发生和加重^[34]。趋化因子是反映炎症进展的指标之一,具有极高的敏感性,其受体能特异性地与趋化因子结合,并通过与其对应配体结合而趋化并活化表达此受体的各种淋巴细胞,而正趋化诱导作用在机体防御、抗感染等多种炎症性疾病的发生发展过程中起到至关重要的作用^[35]。GO功能富集分析的细胞组分中最显著的是细胞质基质,其次是丝氨酸型肽酶复合物^[36]和核膜腔等。研究表明,凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶^[37],通过刺激内皮细胞可引起一系列反应,释放白细胞介素-8(IL-8)、生长因子等可溶性介质,从而引发一系列的促炎反应。此外,本研究中GO功能富集分析的分子功能中主要以蛋白质结合、整合素结合和精氨酸结合为主。精氨酸可以促进蛋白质合成^[38],抑制肠道炎症中因肠黏膜蛋白合成不足产生的炎症反应^[39]。

本研究结果表明,KEGG通路富集数目最多的主要是JAK-STAT信号通路、FoxO信号通路和MAPK信号通路。Van der Pouw Kraan等^[40]研究表明,信号转导子与转录激活子1(STAT1)在炎症过程中由IL-6、IL-10等细胞因子激活后过量表达,调节细胞生长、分化、凋亡以及一些免疫基因的表达。本研究与之相一致,证实了STAT1基因可通过诱导炎症基因表达从而促进炎症发生。据报道,FoxO信号通路在调控细胞凋亡方面起到非常重要的作用^[41],FoxO是FoxO信号通路中起到重要作用的转录因子。周义方等^[42]研究表明,炎症程度和细胞凋亡率与FoxO3a呈正相关变化,所以炎症的发生及过程与FoxO信号通路有着非常紧密的联系,但具体作用机制还需要更多的研究进行论证。MAPK信号通路可通过磷酸化激活转录因子,继而影响基因转录过程,从而实现调控细胞因子分泌过程以参与炎症发生反应。在奶牛乳腺炎发病期间,因MAPK信号通路受影响,导致机体中TNF、IL-1β和IL-6表达量大幅增加,从而激活宿主防御系统产生免疫反应。分子对接验证结果显示,在“金银花-有效成分-炎症靶点-通路”拓扑分析网络图中,度值最高的2个有效成分槲皮素、木樨草素与IL-1β靶点蛋白结合稳定,这2种有效成分可通过该靶点蛋白调控MAPK信号通路、JAK-STAT信号通路和FoxO信号通路等通路,从而作用于奶牛免疫系统发挥抗氧化、抗炎等作用。

4 结论

本研究应用网络药理学方法及分子对接技术,分析了金银花与奶牛炎症之间复杂的网络关系,探究金银花在奶牛生产中的抗炎作用潜在机制,得到金银花可能发挥抗炎作用的靶点及所对应的相关通路。其中,TNF、IL-6、IL-1β、AKT1和PTGS2为金银花发挥抗炎作用的关键靶点,槲皮素和木樨草素均与IL-1β结合稳定。JAK-STAT信号通路、FoxO 信号通路和MAPK信号通路这3种信号通路在金银花发挥抗炎作用中起到了重要作用。本研究为金银花在奶牛生产中的用药开发和应用提供了理论依据。

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